PLOS ONE: Haute diversité des vacA et cagA Helicobacter pylori Génotypes chez les patients avec et sans gastrique Cancer

Résumé

Contexte

Helicobacter pylori
est associée à une gastrite chronique, ulcères peptiques, et le cancer gastrique. Le but de cette étude était d'évaluer la répartition topographique de H. pylori
dans l'estomac ainsi que la vacA
et cagA
génotypes chez les patients avec et sans cancer de l'estomac.

Méthodologie /Principales constatations

Trois biopsies gastriques, des régions prédéterminées, ont été évalués chez 16 patients atteints de cancer gastrique et 14 patients présentant des symptômes dyspeptiques. Des patients cancéreux, des échantillons de biopsie supplémentaires ont été obtenus à partir des centres de tumeurs et des marges; Parmi ces échantillons, la présence de H. pylori vacA
et cagA de génotypes a été évaluée. Positif H.
pylori était de 38% et 26% des biopsies obtenues à partir des groupes cancéreuses et non cancéreuses gastriques, respectivement ( p
= 0,008) et 36% des sites tumoraux. Chez les patients atteints de cancer, nous avons trouvé une distribution préférentielle de H. pylori
dans le fond et le corps, alors que, dans le groupe non-cancer, la répartition est uniforme ( p
= 0,003). La majorité des biopsies étaient simultanément cagA
gène positif et séronégatifs. Le fond et le corps ont montré un taux de positivité plus élevé pour le cagA
gène dans le groupe non-cancer ( p = 0,036
). Un mélange de tailles de gènes
cagA a également été significativement plus fréquents dans ce groupe ( p
= 0,003). Quatre-vingt-deux pour cent de tous les sujets ont montré plus d'un gène génotype
vacA; S1b et m1 vacA de génotypes ont été principalement trouvés dans le groupe de cancer gastrique. Le plus haut la diversité -genotype signal de séquence de vacA a été trouvé dans le corpus et 5 cm de marges tumorales.

Conclusion /Importance

High H. La diversité de la colonisation de pylori, ainsi que le cagA
gène, a été retrouvé principalement dans le fond et le corps des patients atteints de cancer gastrique. La diversité des génotypes observés dans l'échantillonnage l'ensemble d'organes et de la tumeur systématique a été remarquable. Nous constatons qu'il n'y a pas suffisamment de preuves pour soutenir l'association d'un isolat avec une maladie spécifique, en raison de la nature multisouches de H. pylori de l'infection montré dans ce travail

Citation:. López-Vidal Y, Ponce-de-León S, Castillo-Rojas G, Barreto-Zúñiga R, Torre-Delgadillo A (2008) Haut de la diversité vacA
et cagA Helicobacter pylori
génotypes chez les patients avec et sans cancer gastrique. PLoS ONE 3 (12): e3849. doi: 10.1371 /journal.pone.0003849

Editeur: Debbie Fox, L'Institut de recherche pour les enfants à l'hôpital New Orleans pour enfants, États-Unis d'Amérique

Reçu: 12 mai 2008; Accepté: 10 Novembre 2008; Publié 3 Décembre, 2008

Droits d'auteur: © 2008 López-Vidal et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche a été financé par la subvention DGAPA PAPIIT-IN207302 de l'Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), UC-MEXUS et CONACyT-México 47749-M. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Helicobacter pylori
est un pathogène gastrique qui infecte près de 50% de la population mondiale [1]. Il est considéré comme le principal agent étiologique de la gastrite chronique active et est généralement acceptée comme étant la cause principale de la maladie de l'ulcère gastro-duodénal; il est également un facteur de risque connu pour le cancer gastrique [2]. le développement du cancer gastrique a été démontrée pour couvrir plusieurs décennies, en commençant séquentiellement avec H. pylori de l'infection et l'apparition d'une gastrite chronique active [3]. atrophie et métaplasie intestinale glandulaires éventuellement se produisent dans un sous-ensemble de patients et se terminent dans le cancer gastrique [4]. H. pylori de l'infection a été suggéré de conduire à une augmentation du risque relatif (RR) -sur l'ordre de quatre à neuf fois-pour développer des conditions gastriques précancéreuses, en particulier lorsque l'infection se produit pendant l'enfance [5]. Étant donné que seule une minorité de H. les personnes infectées par pylori de développer cette maladie, on pense que le développement de la maladie dépend de l'expression de gènes spécifiques de virulence bactérienne, par exemple cagA
et vacA
[6] , qui sont tous deux fortement exprimé indépendamment de l'état de l'hôte de la maladie [7], [8]. Les associations entre la topographie gastrique, la diversité génotypique de la H. pylori vacA
et cagA de gènes, et le développement du cancer gastrique reste controversée. Le but de la présente étude était d'évaluer la distribution de la vacA
et cagA
génotypes de H. pylori
le long de l'estomac chez les patients avec et sans cancer gastrique

Hypothesis:. une fréquence plus élevée de H. pylori
est associée à stades précoces du cancer gastrique.

Méthodes

Les patients visés pour l'étude endoscopique en raison de suspicion de cancer ou symptômes dyspeptiques ont été invités à participer à une étude prospective transversale . Tous les patients atteints d'un cancer ont été inclus, ainsi que ceux ayant une dyspepsie non ulcéreuse et /ou de reflux gastro-oesophagien. Les critères d'exclusion comprenaient des anomalies de la coagulation, anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), la consommation de drogues non-stéroïdes dans les 72 dernières heures, l'hypertension portale, et la présence d'un lymphome à l'étude histologique.

Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé avant de participer à l'étude. Le protocole d'étude a été approuvé par le Conseil institutionnel d'examen de l'Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), numéro de registre CIBH-1081.

endoscopie digestive haute a été réalisée selon une technique standard. Un système de biopsie-échantillonnage systématique a été utilisé comme suit: à partir de chaque patient, trois biopsies gastriques ont été obtenus à partir de chacun des quatre sites de l'estomac (de antre, partie angulaire, corpus et fundus). A partir des patients atteints d'un cancer gastrique, d'autres échantillons de biopsie ont été obtenus à partir du centre et de la marge de la tumeur et à une distance d'au moins 5/2 cm des marges tumorales.

Tous les échantillons pathologiques provenant de patients atteints d'un cancer gastrique ont été évalués par un seul pathologiste expérimenté et classé selon la classification de Lauren comme diffuse, intestinale, ou mixte [9]. La description du cancer gastrique avancé a été basée sur la classification Borrmann [10]. sous-types de cancer gastrique début morphologiques ont été classées selon les directives japonaises Endoscopie Société [11], [12].

H. pylori
a été cultivé en enduisant les échantillons de biopsie sur la surface des plaques de sang de cheval de gélose (10% de sang de cheval dans Casman base de gélose [BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, États-Unis]) [8].

chromosomiques l'ADN a été extrait [13] et H. pylori ARNr 16S
et cagA
gène a été amplifié par PCR comme décrit précédemment [7]. Le La séquence signal de vacA et la mi-région ont été typés par PCR allélique spécifique du type, comme décrit précédemment par Morales et al.
[8].

cagA de la variable d'amplification du gène de la région. Les cagA
3 régions »répétées du H. Les souches étudiées dans pylori de cette enquête ont été classés en fonction de leur longueur (en raison de la présence d'un nombre variable de séquences répétées dans la région 3 'du gène). Les produits d'amplification obtenus ont été classés par la taille dans l'un des trois groupes: court (906 pb); moyen (1008 pb) et à long (1110 pb), selon Karita et al
. [14]. L'amplification a été réalisée en utilisant des amorces cagRV17-F 5'-acc ctg gtc GGT aat gga tta TCT-3 'et cag22-R 5'-tta aga ttt ttg gaa acc acc ttt t-3' qui ont été conçus sur la base des séquences, récupérées de Genbank en utilisant ALIG (logiciel scientifique et pédagogique) et ClustalW (BCM Recherche Launcher, alignements de séquences multiples).

les données ont été analysées à des fins descriptives utilisant des fréquences relatives et des moyens arithmétiques (écart-type [SD]), comme réputée approprié. Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées par χ ^{2 analyse, ainsi qu'avec Fisher-Freeman-Halton test exact pour les tableaux de contingence. Le groupe de cancer de l'estomac a été comparé à des patients atteints de dyspepsie non ulcéreuse et /ou reflux gastro-oesophagien. Les patients cancéreux ont été stratifiés en début de stade TNM 0, I ou II et avancé pour III ou IV. Le niveau d'alpha a été fixé à 0,05. Étant donné que les comparaisons multiples simultanées ont été menées, une correction alpha-valeur nominale a été introduite à la suite de la procédure de Bonferroni. Par conséquent, nous avons considéré les associations avec p
valeurs comprises entre 0,05 et 0,01 comme suspect. En revanche, les résultats à la p
≤0.0063 niveau ont été considérés comme raisonnablement significatif. Les valeurs comprises entre 0,01 et 0,0063 ont été considérés comme marginaux. Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant Stata logiciel statistique (Intercooled Stata 7.0 pour Windows 98/95 Package /NT, 2002) et Stat-Xact (v. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).}

Résultats

Trente-deux patients ont été inclus dans cette étude. En fonction du diagnostic endoscopique, 18 ont été classés dans le groupe de cancer gastrique et 14 dans le groupe des non-cancéreuse. En raison de signes histologiques de lymphomes gastriques, cependant, deux patients dans le groupe de cancer gastrique ont dû être exclus, laissant 16 personnes dans ce groupe. L'âge moyen des patients dans le cancer de l'estomac et des groupes dyspeptiques était de 57,6 ± 16,7 années (56% d'hommes) et 47,2 ± 14 ans (13,3% d'hommes), respectivement. Dix patients (63%) affichent une tumeur diffuse selon la classification Lauren. Cinq patients ont eu tôt cancer gastrique (type I, trois; II, un; IIB, un) et 11 avaient avancé cancer gastrique (type IIIA, quatre, IIIB, trois; IV, quatre), selon la Société de recherche japonais pour le cancer gastrique les lignes directrices et la classification Borrmann.

Dans nos échantillons de biopsie 411, H. pylori
a été identifié par la culture ou la PCR dans 38% (78/203) des échantillons de biopsie du groupe de cancer gastrique, 26% (54/208) du groupe non-cancer ( p
= 0,008), et 36% (40/110) des sites tumoraux (voir tableaux 1 et 2). H. pylori
a démontré une distribution topographique différentiel chez les patients atteints de cancer gastrique, avec un taux de positivité plus élevé dans le fond et le corps ( p
= 0,003), le tableau 1. Le groupe non-cancer n'a montré aucune différence de distribution topographique . Une positivité un peu plus élevé de H. pylori
a été trouvé dans les sites tumoraux par la culture ou à des marges tumorales par PCR; Cependant, ces augmentations de positivité ne sont pas statistiquement significatives (tableau 2). Il n'y avait pas de corrélation significative entre le H. pylori
taux de positivité et le stade du cancer TNM (début vs fin).

Nous avons trouvé H. La positivité de pylori cagA dans 72% des échantillons gastriques du groupe de cancer gastrique, 73% du groupe non-cancer ( p
= NS) (tableau 3), et 83% de la tumeur les sites ( p
= non significatif [NS]). Le H. la distribution topographique de pylori cagA n'a pas été statistiquement significative dans le cancer gastrique groupe, tandis que le groupe non-cancer a démontré un taux de positivité plus élevé dans le fond et le corps; Cependant, l'importance de cette découverte est discutable ( p = 0,036
) (tableau 3). Encore une fois, dans les sites de la tumeur, nous avons trouvé aucun modèle de distribution important pour la cagA
fraction de positivité, il n'y avait une différence entre les patients atteints de cancer gastrique précoce et avancé.

Quatre-vingt-un H. Les souches pylori de ont été étudiés (80 cagA
+), dont 46 souches provenant de patients atteints de cancer gastrique et 35 chez des patients non cancéreux. Seulement deux Les tailles de gènes de cagA ont été obtenus à partir de la 80 H. Les souches pylori de l'étude; aucun des plus Les séquences cagA de ont été trouvés. Dans les deux groupes, la plus courte cagA
a été le plus fréquemment détecté. Les résultats sont résumés dans le tableau 4. Il est intéressant, à la fois cagA de tailles ont été amplifiés à partir de 12 (15%) des souches, ce qui suggère que ces patients étaient co-infectés par le multiple H. Les souches pylori de. Cette constatation a été obtenue le plus souvent dans le groupe de patients non cancéreux (28,6%) que dans le groupe du cancer gastrique (4,4%) ( p
= 0,003).

Le génotype de la séquence de signal prédominant chez les patients atteints de cancer gastrique, présents dans 39% du groupe, était S1b. La combinaison S1b /s2 était présent dans 20% du groupe et s2 était présent dans 12%. Seize pour cent des patients atteints d'un cancer gastrique a une séquence signal non identifiable (s0). Il n'y avait pas de distribution statistiquement significative de vacA
génotypes dans l'estomac ( p
= NS) (voir Figure 1). Les plus fréquents vacA de génotype dans le groupe non-cancer était S1b, qui était présent dans 59% du groupe, suivi par la combinaison S1a /S1b dans 11%, S1a /S1b /s2 dans 7%, et une séquence signal non identifiable à 9% ( p
= 0,06), figure 1. l'analyse de la distribution des génotypes topographique a montré que le génotype de S1b vacA
était prédominant dans toutes les zones (fundus corpus , partie angulaire, et de l'antre) de l'estomac dans les deux groupes étudiés (Figure S1). Nous avons trouvé une nette différence et marginalement significative dans les modèles de distribution de ces génotypes entre les groupes de cancer et non cancéreuses ( p
= 0,01). Tant le corpus et fundus du groupe de cancer gastrique ont montré une plus grande diversité de génotypes signal séquence, comme l'a fait le corpus dans le groupe non-cancer (Figure S1).

Les plus fréquents vacA
génotypes pour chacun des sites tumoraux (centre et la marge de la tumeur, et au moins 2-5 cm par rapport aux marges de la tumeur) ont été S1b et S2, qui sont présents dans 19%; S1a /S1b et S1b /s2 sont chacun présents chez 17% et S1a /S1b /2, S1a /s2, et s0 étaient présents dans 8%. Il n'y avait pas d'association significative entre le génotype et la proximité tumeur place (Figure 2). La répartition de ce génotype dans les sites tumoraux et anatomiques chez des patients atteints d'un cancer n'a pas été statistiquement significative ( p
= 0,06) (figures 1 et 2). Une association significative ( p
= 0,02) entre le génotype et la tumeur stade a été identifié: S1a /S1b, S1a /S1b /s2, et les génotypes S1b /s2 étaient prédominants dans le groupe de cancer gastrique, tandis que S1b, s2 et génotypes S1a /s2 étaient relativement abondants dans le groupe de cancer gastrique avancé (Figure 3).

la plus fréquente région médiane génotype chez les patients atteints de cancer gastrique était m1, qui était présent dans 44% des patients , suivie m0 (génotype non typable) à 26%, 21% m2, et la combinaison m1 /m2 10% (figure 1). Dans le groupe non-cancer, le plus fréquent vacA de génotype était m1, qui était présent dans 52% des patients, suivi par m0 dans 32%, la combinaison de m1 /m2 dans 11%, et m2 5%; il y avait un modèle de distribution distinct pour ces génotypes, avec un niveau de signification douteuse ( p
= 0,03) (Figure 1). Analyse de la répartition topographique entre les zones anatomiques de la région médiane du génotype a montré que le génotype M1 était principalement (50%) dans la partie angulaire, avec le restant dans le fond (48%) et le corps (42%). Le génotype de la m0 est principalement dans le sinus maxillaire (39%) dans le groupe du cancer gastrique (figure S1). Dans le groupe non cancéreux, le génotype était m1 le plus abondant dans le fond (77%); 56% était dans le corpus, et 43% était dans l'antre. Le génotype m0 a été détecté dans la partie angulaire (62%), sans différence statistiquement significative entre les groupes d'étude (Figure S1). Une distribution presque uniforme des différents génotypes n'a été trouvée dans les sites tumoraux (figure 2). Il n'y avait pas de différence entre les zones anatomiques et des sites de tumeurs chez des patients atteints d'un cancer gastrique (figure 1 et 2) ou entre les premiers et avancé des tumeurs (figure 3).

Le tableau 5 montre l'analyse de la distincte vacA
génotypes trouvés au sein de chaque individu pour lequel plus d'une biopsie a été étudié. Quatre-vingt-deux pour cent (12/13) des patients atteints de cancer a eu plus d'un génotype présent. Une conclusion similaire a été observée dans le groupe non-cancer. Trois sujets dans le groupe non-cancer étaient toujours positifs pour la cagA
gène, et trois autres possédaient les deux types (positifs et négatifs) simultanément. Dans le groupe de patients cancéreux, six individus étaient positifs pour cagA hôtels et sept pour les deux types. Aucun sujet ont toujours été négatifs pour ce gène. La figure 4 présente le nombre de biopsies par individu et le nombre de vacA de segment de signal de gène (SS) génotypes distincts. Le nombre le plus bas de génotypes chez les patients de plus de 10 biopsies était de deux, et le plus élevé était de cinq

Discussion

La présente étude a abouti à quatre grandes conclusions:. D'abord, H. pylori
est uniformément répartie sur l'estomac chez les patients ayant des symptômes dyspeptiques seulement; deuxièmement, H. pylori
a une préférence pour le fond et le corpus chez les patients atteints de cancer gastrique; troisième, chez les patients présentant des symptômes dyspeptiques, H. pylori cagA
a une distribution préférentielle dans le fond et le corps et il y a une fréquence élevée de mélange cagA
tailles; quatrième, le génotype S1b était prédominante dans les deux groupes d'étude, et le génotype s1a était présent seulement dans le groupe dyspeptiques.

La haute H. pylori de la positivité dans le fond de patients atteints de cancer gastrique peut être dû à sa proximité avec le corpus, une zone qui est colonisée en H. pylori
gastrite induite. Corpus prédominante atrophie ou la perte de types de cellules glandulaires spécialisées telles que pariétal et les cellules principales, semble être critique pour la progression du cancer [15], et il est probable que le fond d'oeil est impliquée, soit avant ou après que le corps est déjà engagé dans cancer.

Une positivité relativement élevée pour H. pylori
a été trouvé au niveau du site de la tumeur, malgré les déclarations antérieures que H. pylori
ne peut se développer dans la muqueuse atrophiée et que la métaplasie intestinale est un milieu défavorable [16]. Tang et al.
, Cependant, a suggéré que H. pylori
peut survivre dans l'épithélium gastrique en présence d'une lésion cancérigène [17]. Il a également été spéculé que certains facteurs de virulence peuvent jouer un rôle important dans la persistance de H. pylori
dans la muqueuse gastrique [18].

Dans la présente étude, nous avons observé que H. pylori
démontre la colonisation similaire des régions anatomiques du site de l'estomac et de la tumeur. H. pylori de la positivité dans les groupes de cancer gastrique précoce et avancé a également été trouvé pour être très semblables; Tang et al.
, Cependant, observé les résultats inverses [17]. Nous pensons que la différence observée entre ces deux études est due au nombre de biopsies étudiées chez chaque patient; nous avons démontré que l'échantillonnage systématique modifie l'association de H. pylori
avec la maladie.

Une prévalence plus élevée de H. gène-positivité pylori cagA a été trouvé dans le corpus et fundus des patients atteints de dyspepsie. Auparavant, Semino-Mora et al
. a montré que ce modèle ne sont pas présents chez les patients atteints de cancer gastrique [19], bien que nous avons utilisé un autre cagA
amplification fragment dans le présent ouvrage. transformation néoplasique gastrique est induite et maintenue, au moins en partie, par in vivo
intracellulaire cagA de l'expression; cet effet pourrait jouer un rôle non seulement au cours de la cancérogenèse gastrique au début, mais, sur la base de nos données, pourrait également se produire plus tard dans ce processus [19]. Nous avons observé que 15% des souches possédait un mélange de cagA
3 'répéter région tailles, ce qui suggère la présence de co-infection avec de multiples H. pylori
souches, principalement dans le groupe non-cancer. Kidd et al
a obtenu des résultats différents. alors que ces auteurs ont étudié un nombre plus élevé de patients [20], nous avons étudié un nombre plus élevé de biopsies gastriques qui comprenait plusieurs sites spécifiques au sein de l'estomac.

Nous avons déjà observé la présence de la diversité génotypique dans l'ulcère gastro-duodénal corpus [8]. Cette diversité a été proposée pour tenir compte des actions synergiques qui sont associés à ce processus [21]. La prédominance vacA de la séquence signal de génotype détecté dans les deux groupes d'étude était S1b, en accord avec notre précédent rapport [22]
.

Les résultats importants de notre étude sont qu'il ya une répartition topographique séquence de signal de vacA, le génotype S1b est communément associé avec le groupe non-cancer et /combinaison s2 S1b ou génotypes s2 se trouvent uniquement dans le groupe de cancer gastrique. Aucune étude antérieure sur les individus atteints de cancer gastrique ont examiné les zones quatre tumorales évalués dans le présent ouvrage. Le génotype S1C a été constaté que le génotype le plus répandu en Asie; cependant, son association avec le cancer gastrique diminue [22], [23]. La diversité du génotype
vacA de H. pylori
a été expliqué par un modèle de co-évolution [21].

En ce qui concerne mi-région des allèles de Vaca, nous avons trouvé des génotypes M1 et M2, dans les deux groupes étudiés, avec m1 génotype étant le plus fréquent dans les régions prédéterminées de l'estomac évalué [8].

dans les deux groupes étudiés, nous avons trouvé H. Les souches pylori de qui étaient non typable pour les allèles signal de séquence et de la mi-région en raison de la variation significative dans le gène
vacA [8], [24]. Nous avons trouvé que la constante cagA
- et la diversité -allele de vacA était plus grande dans la tumeur, ce qui suggère que H. pylori
peut rester dans la tumeur sans stress environnemental.

La diversité génotypique observée dans les organes et les tumeurs entières systématiques dans le présent travail a été remarquable. La principale conséquence pratique de cette constatation est la nécessité de rechercher un système similaire d'échantillonnage exhaustif afin d'associer un facteur de pathogénicité avec la maladie. Nous avons constaté que l'association d'un seul isolat-dérivée d'une seule biopsie avec la maladie ne suffit pas en raison de la nature multisouches de H. pylori de l'infection démontrée dans le présent travail.

Les limites de cette étude sont liés à sa nature d'observation et sa conception transversale. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité qu'il y ait une variable de confusion associée à la fois à la présence de la infection
Helicobacter pylori et le cancer ou le statut dyspeptiques. En outre, l'absence d'un suivi longitudinal nous empêche de confirmer l'apparition séquentielle des événements, comme le développement du cancer et de l'infection initiale avec la souche (s) de Helicobacter pylori
qui ont finalement été détectés.

conflit d'intérêts

Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.

Informations complémentaires
Figure S1. .
Séquence signal topographique et la distribution des allèles de région médiane du gène vacA chez les patients avec et sans cancer gastrique
doi: 10.1371 /journal.pone.0003849.s001
(3,81 MB TIF)

Remerciements

Nous remercions Rosa Isabel Amieva-Fernández, Ana Karina Martínez-Díaz, Leonor Jacobo-Albavera, et Fernando Vargas-Romero pour une excellente assistance technique avec l'amplification de l'ADN.

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