séquençage profond du carcinome gastrique révèle des mutations somatiques pertinentes à medicine

personnalisées séquençage profond du carcinome gastrique révèle des mutations somatiques pertinentes à la médecine personnalisée
Résumé de l'arrière-plan
Globalement, le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer , avec la majorité de la charge de la santé pris en charge par les pays économiquement moins développés.
Méthodes
nous rapportons ici une caractérisation génétique des 50 échantillons d'adénocarcinome gastrique, en utilisant des réseaux affymetrix SNP et Illumina ARNm tableaux d'expression ainsi que le séquençage Illumina Résultats
altérations génétiques des régions codantes de 384 gènes appartenant à différentes voies connues pour être modifiés dans d'autres cancers. on a observé dans la voie Wnt, Hedgehog, le cycle cellulaire, des lésions de l'ADN et épithéliale-mésenchymateuse transition de voies Conclusions
les données de thérapies approuvées. suggère ciblées ou en développement clinique pour le carcinome gastrique serait bénéfique pour ~ 22% des patients étudiés. En outre, les nouvelles mutations détectées ici, sont susceptibles d'influencer la réponse clinique et de proposer de nouvelles cibles pour la découverte de médicaments.
Contexte
Malgré la récente baisse des taux de mortalité par cancer de l'estomac en Amérique du Nord et dans la plupart des Nord et en Europe occidentale , cancer de l'estomac reste l'une des principales causes de décès dans le monde et est commun au Japon, en Corée, Chili, Costa Rica, Fédération de Russie et d'autres pays de l'ex-union soviétique [1]. Malgré l'amélioration des modalités de traitement et le dépistage, le pronostic des patients atteints d'un adénocarcinome gastrique reste faible [2]. Pour comprendre la pathogenèse et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est essentiel de disséquer les mécanismes moléculaires qui régulent la progression du cancer gastrique. En particulier, les mécanismes oncogéniques qui peuvent être ciblés par la médecine personnalisée.
Le terme «addiction oncogène» pour décrire les cellules fortement dépendantes d'un oncogène donné ou voie oncogénique cancer a été introduite par Weinstein [3, 4]. Le concept met en évidence le développement de thérapies ciblées qui tentent d'inactiver un oncogène, essentielle à la survie des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales qui ne sont pas dépendantes de manière similaire.
Plusieurs oncogenes activés à haute fréquence dans d'autres cancers se sont également avérés être muté dans le cancer gastrique. Il en découle que ces agents thérapeutiques de ciblage commercialisés oncogènes permettrait de traiter efficacement une partie des carcinomes gastriques, soit sous forme d'agents uniques ou en combinaison. En Janvier 2010, le trastuzumab a été approuvé en combinaison avec la chimiothérapie pour le traitement de première ligne du -positifs cancer gastrique avancé et métastatique ERBB2 de. Le trastuzumab est le premier agent ciblé à être approuvé pour le traitement du carcinome gastrique et une augmentation de 12,8% du taux de réponse a été observée avec l'addition de trastuzumab à la chimiothérapie dans adénocarcinome gastrique positif ERBB2 de [5, 6]. Il a été estimé que 2-27% des cancers gastriques abritent ERBB2
amplifications et peut être traitée avec des inhibiteurs de ERBB2 [7, 8]. De même, une surexpression d'un autre récepteur tyrosine kinase (RTK)
EGFR a été observée dans le cancer gastrique et de multiples essais des inhibiteurs de l'EGFR de dans ce type de cancer sont en cours (passé en revue dans [9, 10]). En outre, certains cancers gastriques abritent une amplification d'ADN ou d'une surexpression du TKP MET
[11, 12] et son paralogue MST1R
[13] et peut être traité avec MET
ou les inhibiteurs MST1R de [14-20 ]. Enfin, FGFR2
sur l'expression et l'amplification a été observée dans une petite proportion des cancers gastriques (squirrheux) [21] et les inhibiteurs ont montré une certaine efficacité dans la clinique [22].
Aval des RTK, KRAS
l'amplification de type sauvage et de mutation a également été trouvé dans environ 9-15% des cancers gastriques [23, 24] et peuvent être efficacement traités avec des inhibiteurs de MEK [25, 26]. Activation de la voie Pi3K /AKT /mTOR a également été vu dans 4-16% du cancer gastrique [27-30] et peut donc être sensible aux inhibiteurs de la PI3K [31-34]. De même, le cycle cellulaire kinase AURKA
a été montré pour être activé dans le cancer gastrique [35, 36] et les inhibiteurs AURKA en développement clinique [37] peut avoir des avantages cliniques.
Rapports de la fréquence des différents types d'activation oncogénique et leurs co-occurrence sont limitées. Par contraste avec les tumeurs stromales gastrointestinonal (GIST) qui sont caractérisés par une fréquence élevée de KIT et PDGFRA
de l'activation [38] et, par conséquent traités efficacement dans la plupart imitanib et par le sunitinib [39, 40], apparaît adénocarcinome gastrique d'être une maladie hétérogène moléculairement sans haute fréquence perturbation oncogène découvert jusqu'à présent. Ceci est illustré par une étude récente de la mutation somatique dans les gènes codant pour la kinase dans 14 lignées cellulaires de cancer gastrique et trois tissus de cancer gastrique qui ont découvert plus de 300 nouvelles kinases variations nucléotidiques simples et variantes structurelles liées à la kinase. Cependant, la mutation ne très souvent récurrente ou kinase muté a été découvert [41].
Dans le but d'élucider le potentiel pour le traitement du cancer de l'estomac avec des thérapies ciblées soit sur le marché, en développement ou à découvrir, nous avons caractérisé clinique échantillons de carcinome gastrique pour détecter l'activation oncogène.
Nous avons pris une approche globale en analysant les échantillons sur Affymetrix SNP et Illumina ARNm tableaux d'expression. Ces technologies sont bien validées pour la détection du génotype, l'ADN du nombre de copies variation et ARNm profil d'expression. Ils se prêtent à des échantillons cliniques hétérogènes. Les échantillons ont également été interrogés par la deuxième génération (Illumina) séquençage. technologies de séquençage de deuxième génération relativement nouveaux offrent à la fois augmenter le débit et la capacité de séquençage profond. Ce dernier point est particulièrement important pour la caractérisation des échantillons de cancer qui ont tendance à inclure un mélange de types de cellules comprenant des cellules normales, qui infiltrent le système vasculaire et des cellules tumorales de différents génotypes. Dans cette étude, nous avons utilisé l'enrichissement de la cible et la technologie de séquençage Illumina pour séquencer les régions codantes de 384 gènes. Nous avons décidé de privilégier la profondeur de la couverture dans une couverture plus large afin de capturer des mutations présentes dans les sous-populations dans les tumeurs. Des études récentes ont montré cancers ont tendance à abriter de nombreuses mutations dans un plus petit nombre de voies de signalisation [42, 43] donc nous nous sommes concentrés sur les gènes dans ces voies. Nous avons également inclus les gènes codant pour des protéines précédemment montré pour affecter la réponse aux thérapies ciblées et plus susceptibles d'être ciblés avec succès par petite intervention molécule, comme notre objectif est de trouver des moyens plus efficaces et novatrices de traitement de cancer de l'estomac.
Méthodes
les échantillons d'ADN et d'ARN de tissus échantillons ont été obtenus auprès des hôpitaux en Russie et au Vietnam selon la CISR protocoles approuvés et avec la CISR a approuvé les formulaires de consentement pour l'analyse moléculaire et génétique. Les centres médicaux eux-mêmes ont aussi des comités d'éthique internes avec le protocole examiné et coffrages. Les échantillons ont été obtenus par l'intermédiaire Solutions Tissue Ltd http: //www. Tissulaires solutions com /.. Pour les caractéristiques de l'échantillon voient Génotypes de tableaux de plus fichier 1 table S1 et copier des profils numériques ont été générés pour chaque échantillon en utilisant 1 pg d'ADN terme sur les tableaux Affymetrix SNP V6 en utilisant des protocoles Affymetrix. données de variation du nombre de copies ont été analysées dans le http logiciel ArrayStudio: //www. Omicsoft com.. Les données ont été normalisées en utilisant l'algorithme Affymetrix et segmenté en utilisant CBS. Un profil de transcription a été généré pour chaque échantillon en utilisant 1 pg d'exécution d'ARN total sur Illumnia HG-12 tableaux d'expression d'ARN en suivant les protocoles Illumina. Les données ont été analysées dans le http logiciel Illumina GenomeStudio:.. //Www illumina com /software /genomestudio_ logiciel ILMN.. Comme une procédure de données de pré-traitement, un ensemble de sonde a été retenu que si elle a un (à savoir deux écarts types au-dessus de fond) "actuels" appeler dans au moins un des échantillons. Les valeurs de signal des ensembles de sondes restantes ont été transformées en échelle logarithmique à base 2 et à la normalisation quantile a été réalisée. copie de l'ADN et les niveaux d'expression d'ARN ont été intégrés au niveau des gènes au sein du logiciel http ArrayStudio: //www. Omicsoft com.. analyse de l'enrichissement Pathway a été réalisée dans le GeneGo http analyse de Metacore suite: //www. GeneGo com /.. Toutes les données du tableau de cette étude est disponible dans GEO http: //www NCBI nlm nih gov /geo /sous le numéro série d'adhésion GSE29999
séquençage de l'ADN profonde ciblée
5..... pg d'ADN a été PCR enrichi pour les exons codant de toute transcription connue de 384 gènes d'intérêt (fichier supplémentaire de 2 tableau S2) en utilisant la plate-forme http Raindance:... //www logies de raindancetechnol com /
Les bibliothèques cibles résultantes ont été séquences en utilisant Illumnia GAII à une longueur de lecture 54 nt. Séquence lit a été cartographiée sur le génome de référence (hg18) en utilisant le programme BWA [44]. Bases en dehors des régions ciblées ont été ignorées lors de la synthèse des statistiques de couverture et les appels de variantes. Samtools a été utilisé pour analyser les alignements et faire des appels de génotype [45], et tout appel qui dévie de la base de référence a été considéré comme une variante potentielle. Le package samtools génère des estimations de qualité de consensus et de qualité variant de caractériser les appels de génotype. Précision des appels de génotype a été estimée par la concordance au génotype appels de la Affymetrix 6.0 SNP microarray. matrices de concordance des échantillons basés sur des données de SNP et de séquence ont été générés pour vérifier l'échantillon erreurs d'étiquetage (supplémentaire fichier 3 chiffre S1). Concordance et la quantité d'appels de génotype ont été compilés pour les seuils de qualité de consensus, la qualité de variante, et de la profondeur. La dernière série d'appels de variantes ont été identifiées en utilisant la qualité d'un consensus supérieur ou égal à 50 et de la qualité de variante supérieure à 0. Pour identifier exclusivement les modifications somatiques, seules les mutations présentes dans l'échantillon de cancer et non détectés dans aucun des échantillons normaux ont été retenus. Comme un filtre supplémentaire pour les variantes de la lignée germinale, toutes les variantes présentes dans dbSNP et 1000 ensembles de données du génome de polymorphisme ont été enlevés.
Q-PCR
Q-PCR a été réalisée via le protocole standard en utilisant Fluidigm 48 * 48 de tableau dynamique. Tout d'abord, une course de validation a été effectuée en utilisant l'ARN de contrôle mis en commun à partir de trois échantillons. Quatre montants d'ARN ont été testés d'entrée (125 ng, 250 ng, 375 ng et 500 ng). points de données triplicat ont été obtenus pour la dilution par la suite de 10 points de série pour chaque état par essai. Les meilleurs résultats globaux étaient à 250 ou 500 ng, qui a donné des valeurs de rendement ~ 85%. Par conséquent 250 quantité d'entrée ng pour les échantillons expérimentaux. Les données ont été produites en triple et la moyenne combinée. valeurs CT ont été converties en abondance en utilisant l'abondance de la formule standard = 10 (40-CT /3.5). Les données de test a été normalisé pour les femmes de ménage à l'aide de l'analyse de la méthode de covariance où les deux femmes de ménage (GAPDH et bêta-actine) ont été utilisés pour calculer un score robuste et le score a été utilisé comme covariable pour ajuster les autres gènes. L'analyse des données a été réalisée dans le logiciel Arraystudio.
les amorces ADN génomique PCR de Sanger séquençage ont été commandés auprès de IDT (Integrated Technologies Inc ADN, Coralville, Iowa). Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant la polymerase Platnium Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA). 50 ng d'ADN génomique a été amplifié pendant 35 cycles à 94 ° C pendant 30 secondes, 58 ° C pendant 30 secondes et 68 ° C pendant 45 secondes. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide Agencourt AmPure (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Le séquençage direct des produits de PCR purifiés avec des amorces de séquençage ont été effectuées avec AB v3.1 BigDye-terminator kit de séquençage de cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA) et les réactions de séquençage ont été purifiés en utilisant Agencourt CleanSeq (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Les réactions de séquençage ont été analysées en utilisant un analyseur génétique 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Résultats Tous les résultats de la séquence des données ont été rassemblées et analysées en utilisant Codon code Aligneur (CodonCode Corporation, Dedham, MA).
profils d'ADN et de l'ARN amplification à travers des échantillons sont conformes aux études antérieures
Conformément à la plupart des autres cancers humains, du nombre de copies des changements sont survenus dans les génomes des échantillons de cancer de l'estomac 50 par rapport aux échantillons normaux appariés (figure 1). Les grandes régions d'amplification fréquentes ont été trouvés à des régions chromosomiques 8q, 13q, 20q et 20p. oncogènes Myc connus d'hôtels et CCNE1
sont situés dans les amplicons 8Q et 20p, respectivement, et susceptibles de contribuer à un avantage de croissance conféré par l'amplification. Ces amplifications ont été observés dans les études antérieures dans le cancer gastrique avec amplification de 20p pour lesquels ZNF217
et TNFRSF6B
ont été proposés comme gènes du pilote candidat [46]. Figure 1 Vue d'aberrations CNV dans tous les 50 échantillons de carcinome gastrique, pour chaque autosome. L'axe des ordonnées correspond à la somme du nombre de changements positifs ou négatifs pour un segment particulier avec un rapport log2 de ces changements. Les zones avec nombre augmenté ou diminué copie cohérente dans tous les échantillons analysés ou très grands changements dans quelques échantillons montreront grandes tailles positives et négatives changement. Chaque point ou un segment dans la figure est colorée par échantillon. Le code de couleur est arbitraire avec chacun des 50 échantillons de cancer étant attribué une couleur. segments Amplified comprennent le chromosome 8q, 20q, 20p, 3q, 7p et 1q.
Concordance entre copie d'ADN gain de nombre et d'expression de l'ARN dans les échantillons de cancer a été évaluée et les 200 premiers gènes contenus dans une région de fréquentes copie haute ADN échantillons de cancer et qui avaient des niveaux élevés d'ARNm (par rapport aux tissus normaux appariés) sont présentés dans le tableau 4 supplémentaire fichier S3. La plupart des gènes de cette liste sont des régions chromosomiques 20q et 8q, suggérant que ces amplifications ont le plus d'effet sur les niveaux d'ARNm, dans la minorité sont des gènes pour 20p, 3q, 7p et 1q. La figure 2 montre les profils d'ARN mesurés par Q-PCR d'un gène modèle à partir de chaque région présentant une surexpression générale dans le cancer gastrique, en particulier dans certains échantillons. Outre MYC
et CCNE1
, il existe de multiples gènes dans ces régions, ce qui pourrait contribuer à un avantage de croissance pour la cellule cancéreuse. Les voies biologiques les plus significativement enrichis pour les gènes amplifiés et surexprimés sont impliqués dans la régulation de la traduction (p = 0,000015) et des dommages de réparation de l'ADN (p = 0,003). Les échantillons ayant des amplifications dans ces régions génomiques sont annotés à la figure 3. Il n'y a pas de tendance discernable pour amplifications dans ces régions pour co-produire ou d'être exclusive. En accord avec une étude précédente [47], le locus du PERLD1 a été amplifié (dans le ERBB2
amplicon) dans l'échantillon 08280 et MMP9
a été surexprimé mais pas discernable amplifié. Egalement sur la figure 3 amplifications d'ADN de liaison avec l'expression de l'ARN concordante de gènes susceptibles d'affecter la réponse aux thérapies ciblées sont notées, par exemple les données sous-jacentes voir supplémentaires fichier 5 chiffre S2. Figure 2 Expression d'exemple des gènes de chaque région chromosomique amplifié à travers des échantillons d'étude confirmés par Q-PCR. Les points rouges représentent des échantillons de cancer et des points blancs représentent des échantillons normaux. L'axe des ordonnées représente l'abondance de l'ARNm.
Figure 3 profil mutationnelle d'échantillons. Des échantillons de tissus sont affichés dans la partie supérieure et les annotations qui les concernent sont dans les colonnes ci-dessous. Les cases rouges indiquent l'amplification de l'ADN et concordant surexpression d'ARNm, des boîtes d'orange désignent l'ARN surexpression sans signe d'amplification de l'ADN, les points rouges représentent une perte d'ADN. Les boîtes bleues indiquent une mutation non synonyme somatique validé par séquençage Sanger et les boîtes pourpres représentent des mutations somatiques non synonymes, observées dans les données Illumina sans tenter de confirmer par séquençage Sanger. changements aminés sont notées dans les boîtes et les changements conduisant à la perte ou le gain d'un codon d'arrêt sont en rouge.
données de séquençage montre une grande concordance avec génotypage
préparation bibliothèque de séquençage a échoué pour six des échantillons de cancer d'origine 50 et quatorze des échantillons normaux appariés originaux. Par conséquent, deux paires plus appariés ont été ajoutés à l'analyse, ce qui entraîne un ensemble de données de 44 échantillons de cancer, 36 avec des paires normales appariés (supplémentaires fichier 1 table S1). La région ciblée comprenait 3,28 MB à travers 6,547 exons uniques dans 384 gènes (supplémentaire fichier 2 tableau S2). couverture médian de dans tous les échantillons était de 88,3% et a chuté à 74% en exigeant une couverture minimum de 20. Tout le séquençage a été réalisé à un minimum de 110x couverture moyenne de lecture à travers les régions génomiques enrichies pour chaque échantillon. Le lit a été aligné sur le génome humain et les variantes du génome de référence ont été appelés. Comme témoin, une analyse pour comparer le génotypage des appels à partir des matrices Affymetrix V6 SNP et le séquençage a été effectué Illumina. Les régions ciblées pour le séquençage contenaient 1005 loci couverts par les réseaux Affymetrix V6 SNP. En l'absence de filtrage de la variante de séquençage appelle à des mesures de qualité, l'accord médiane entre les génotypage et de séquençage des résultats était de 97,8% avec une gamme de 65-99% (fichier 6a supplémentaire, Figure S3a). L'ensemble concordance brute génotype d'appel était de 96,8%. Les mesures de qualité ont été choisis afin de maximiser l'accord entre le génotypage et les appels de séquençage tout en minimisant les faux négatifs. La mesure la plus informative était la qualité de consensus et d'une coupure de ≥50 ont entraîné la perte d'environ 10% des génotypes partagés, mais une augmentation globale de 2% de concordance à 98,7% (supplémentaire 6b de fichier, Figure S3b). appels de génotype Variant ont été isolés pour une analyse de concordance. Dans cet ensemble, un seuil de qualité variant de > 0 une précision accrue des appels de génotype variant de 98,9% (supplémentaire 6c de fichier, Figure S3c). Lorsque les deux seuils de qualité ont été appliqués l'échantillon concordance médian est de 99,5% (6d fichier supplémentaire, Figure S3d) qui se situe dans la région d'erreur de réseau de génotypage. Six échantillons (08362T1, 08373T2, 336MHAXA, 08337T1, 89362T2, DV41BNOH) avaient une concordance de < 98% et deux d'entre eux (et 08393T2 DV41BNOH) ont respectivement une concordance entre 82% et 88%. Par conséquent, avec un ≥ qualité de consensus 50 et une variante qualité > 0, le taux de faux positifs était de 0,5% et 1,6% pour les génotypes de référence et des variantes de génotypes, respectivement (fichier supplémentaire 6e Figure S3E).
De tous les changements de nucléotide simple passant les seuils ci-dessus, toutes les variantes présentes dans aucun des échantillons normaux ou dans les bases de données de polymorphisme de dbSNP (v130) ou 1000 génomes ont été supposés être des variants germinales et mis au rebut. Des variantes présentes uniquement dans les exons d'échantillons de cancer ont été supposées être somatiques et conservées. 18.549 variants somatiques ont été détectés au total dans tous les 44 échantillons (fichier supplémentaire 7 Tableau S4), 3357 ont été prévus pour être exonique et non synonyme. Pour établir des priorités pour les mutations ayant un impact fonctionnel, nous nous concentrons tout autre analyse sur les mutations non synonymes et mutations mises en évidence conduisant à la perte ou le gain de codons stop. Nous avons appliqué l'algorithme SIFT [48] pour prédire les changements d'acides aminés qui ne sont pas tolérés dans l'évolution et sont donc plus susceptibles d'affecter la fonction de la protéine, 1509 mutations somatiques non synonymes ont un score de SIFT de < 0,05. Le taux de mutations avec score EIPD < 0,05 par gène, corrigé pour la longueur de la CDS a été calculé (4). La figure 4 montre, les gènes ayant la plus forte concentration de faible EIPD mutations de notation étaient S1PR2
, parl2
, SSTR1
, TP53
, GPR78
et RET
, avec S1PR2 étant le plus extrême. Il y a quinze mutations avec score EIPD < 0,05 à travers le 353aa CDS de S1PR2
, concentrés dans neuf échantillons. S1PR2
également connu sous le nom de codes EDG5 pour un récepteur couplé aux protéines G de la S1P et active RhoGEF, LARG
[49]. On sait peu de son rôle dans le cancer et somatiques mutations ont pas été observée dans les 44 tissus séquencés pour S1PR2
dans la base de données COSMIC [50]. Figure 4 Diagramme à barres du taux de mutations délétères à travers le gène séquencés. Les gènes séquencés sont représentés sur l'axe des x. Le nombre de mutations non synonymes somatiques nuisibles observés dans chaque gène /nombre d'acides aminés dans chaque CDS à tracer
données. Séquenceurs est confirmée par séquençage de Sanger
Certaines mutations somatiques non synonymes ont été sélectionnées pour être confirmée par séquençage de Sanger. Toutes les mutations signalées en bleu sur la figure 3 ont été confirmés par séquençage Sanger et ont également été confirmés pour être somatique par séquençage de la séquence de type sauvage dans le tissu normal adapté (voir fichier supplémentaire 8 Figure S4 des traces exemple de séquençage). Bien que 74% ont été confirmées, certaines mutations détectées dans le séquençage Illumnia n'a pas été confirmé que les mutations somatiques par séquençage Sanger. Seize des 68 (24%) des mutations que nous avons tenté de confirmer étaient présents dans l'échantillon normal et le cancer, ce sont des mutations germinales mais non détectés dans aucun des échantillons normaux par séquençage Illumina et pas non plus représentés dans dbSNP ou 1000 génomes données. Cinq des seize mutations germinales étaient des échantillons de cancer sans tissu normal assorti inclus dans l'ensemble de données, les onze autres sont venus à partir d'échantillons de cancer avec une séquence de tissus normaux appariés inclus dans l'ensemble de données. Cela met en évidence un taux de contamination germinale pas éliminé par les contrôles normaux appariés ou la comparaison des bases de données de polymorphisme connues. Il se peut que la couverture des substitutions dans le tissu normal se trouve être inférieur à celui de l'échantillon de cancer et de sorte que certaines mutations germinales restent malgré les filtres somatiques. Deux des 68 (3%) des mutations que nous avons tenté de confirmer ne sont pas présents dans l'échantillon normal ou le cancer par séquençage Sanger. Une cause pourrait être faux positifs dans les données Illumnia en raison de artefact; cependant fichier supplémentaire 6 Figure S3 montre le taux de faux positifs à être faible au moins pour les variantes représentées sur les tableaux Affymetrix V6. Une autre possibilité est que ceux-ci sont présents dans un sous-ensemble de l'échantillon au-dessous de la sensibilité de la méthode de Sanger, mais détectée par le séquençage Illumina. Par conséquent, les mutations rapportées dans le séquençage Illumina sont également signalés en violet sur la figure 3, une certaine prudence est justifiée
interpréter ces résultats car ils peuvent être polymorphismes germinales ou présente uniquement dans un sous-ensemble de l'échantillon de la tumeur. Les modifications de la RAS /Trois échantillons de tumeurs de la RAF /MEK /ERK voie avaient des altérations génétiques de KRAS (figure 3) suggérant la possibilité thérapeutique pour le traitement avec des inhibiteurs de MEK. L'une de ces modifications est une mutation G12D. On a montré que les mutations de KRAS G12D de d'initier la cancérogenèse et la survie de la tumeur [51]. Amplification et surexpression de type sauvage KRAS
a été vu dans les 2 autres échantillons. KRAS de l'amplification a été observée auparavant dans 5% des cancers gastriques primaires. des lignées cellulaires de cancer gastrique avec l'activation et de la sensibilité de KRAS de type sauvage de l'amplification du spectacle KRAS constitutifs de KRAS de RNAi knockdown [24]. Une nouvelle mutation KRAS
a également été observée; . (Dans l'échantillon 08393) la conséquence fonctionnelle est inconnue
Le PIK3CA
mutation concomitants avec KRAS de G12D, est connu pour affecter la sensibilité aux inhibiteurs de MEK [25]; en outre, de nouvelles mutations observées dans cette étude peuvent aussi avoir des conséquences pour la même classe de produits thérapeutiques. Par exemple: les fonctions KSR2 de comme un échafaudage moléculaire pour promouvoir ERK signalisation [52, 53]. Par conséquent, les mutations dans KSR2
tels que vu dans sept échantillons peut affecter la sensibilité aux inhibiteurs de MEK. Un second exemple est ULK1
, qui contrôle positivement autophagie en aval de mTOR [54] et est muté dans quatorze échantillons. L'autophagie est augmentée ainsi que la phosphorylation de ERK lorsque les cellules de cancer gastrique sont traités avec un inhibiteur du protéasome [55], donc des mutations dans ULK1
peuvent affecter la sensibilité aux traitements inhibiteurs de protéasome tels que bortézomib en monothérapie ou en association avec des inhibiteurs de MEK.
modifications dans la voie PI3K /AKT
Il y avait rupture de séquence substantielle des phosphoinositide-3-kinase (PI3K) gènes de la voie dans l'ensemble de l'échantillon. Il y a un certain nombre de PI3K /AKT /mTOR inhibiteurs dans le développement clinique et les patients avec mutations activatrices dans la voie sont des candidats pour le traitement [56]. PIK3CA de les mutations de oncogenicity connu ont été trouvés dans quatre échantillons. Cela se traduit par une fréquence de mutation hotspot PIK3CA de 9%, légèrement plus élevé que les estimations précédentes de 6% (12/185) [27] et de 4,3% (4/94) [57]. Les mutations hotspot PIK3CA commune de oncogenicity connu (E545K et H1047R) [58] ont été observées deux fois chacun. Une autre mutation dans PIK3CA de K111E, qui a également été observée auparavant dans quatre échantillons en COSMIC, a été observée une fois et potentiellement nouvelles mutations somatiques ont été observées dans deux autres échantillons.
Cinq qu'AKT1
mutations non synonyme ont été observées. Bien que qu'AKT1 de les mutations se trouvent dans environ 2% de tous les cancers, ils se produisent principalement à l'acide aminé 15 et l'importance fonctionnelle de la mutation dans d'autres sites est inconnue. Une autre mutation non synonyme de AKT2
a été observée dans les mutations de l'échantillon 08407. Akt2 sont beaucoup plus rares que qu'AKT1 de les mutations, bien qu'une AKT2
mutation a été observée auparavant dans le carcinome gastrique, à une fréquence de 2% [ ,,,0],59]. Enfin mutation de PTEN
ou MTOR
peut affecter la réponse à la voie des inhibiteurs. Les modifications de mutations de PTEN Plusieurs sont notés et mTOR de les mutations sont fréquentes. dans Receptor Tyrosine Kinase
Les tyrosine kinases de récepteur (RTK) et médicament cible EGFR
, ERBB2
et MET
ont chacun été amplifié (log2 > 0,6) et surexprimées au niveau de l'ARN dans un échantillon de cancer. Il s 'ensuit que les tumeurs peuvent être sensibles aux inhibiteurs des récepteurs RTK amplifiés. De plus, de multiples mutations non synonymes sont observées dans les régions codantes. mutations en aval seraient censés influencer la réponse. Par exemple, dans le MET de l'échantillon amplifié une mutation tronquer dans AKT3
peut affecter la sensibilité aux inhibiteurs de MET.
FGFR2
est amplifié et l'ARN surexprimé dans deux échantillons, il y a aussi de multiples mutations dans FGFR1
-4. De larges inhibiteurs de RTK de gamme, qui ciblent FGFR entre autres kinases, peut être efficace chez ces patients [60, 61].
Transformations in Cell Proteins Cycle
Le virus oncogène homologue SRC
est muté dans quatre de la tumeur échantillons, deux des mutations sont prévus pour avoir un effet délétère, y compris l'introduction d'un codon d'arrêt. Cela peut contre-indiquer les inhibiteurs de la SRC. MET de l'amplification est également un marqueur de résistance connu pour la thérapeutique anti-SRC tels que dasatanib [62, 63]. La kinase du cycle cellulaire liée, AURKA
a été amplifié et surexprimé dans un échantillon. inhibiteurs AURKA sont en développement pour les tumeurs solides [37] et peuvent être indiqués dans ce cas. CCNE1
a été amplifié dans deux échantillons (08390 et 08357). Des niveaux élevés de CCNE1
se sont révélés être fréquemment associés au cancer gastrique précoce et des niveaux de métastases, mais l'expression ne sont pas en corrélation avec la survie [64, 65]. Les niveaux de haute CCNE1 ont été suggérés comme un marqueur de sensibilité pour l'enzyme activée par les thérapies géniques dirigée pro-drogue [66]
activation de la voie Wnt est commun dans les échantillons de carcinome
mutations ont été observées dans l'APC
gène dans des 22 échantillons. APC est un suppresseur de tumeur connu pour activer CTNNB1 et la signalisation de la voie Wnt, entre autres effets [67]. La voie Wnt a été précédemment jugée être fréquemment activé dans le cancer gastrique [68]. Nous avons utilisé une signature transcriptionnelle, généré à partir des études antérieures [69, 70] et disponible à la base de données Broad Institute MSigDB pour classer les échantillons de l'étude par leurs signatures wnt de transcription. La figure 5A montre une carte thermique des niveaux de transcription des gènes Wnt dans la signature des ensembles de données. L'activation de cette voie est plus élevée dans presque tous les échantillons de cancer par rapport aux échantillons normaux. les inhibiteurs de Wnt font l'objet d'intenses recherches dans l'industrie pharmaceutique et la recherche universitaire [71-73]. Ces résultats suggèrent qu'ils auront une indication dans le cancer gastrique, ainsi que de nombreux autres cancers. Figure 5 signatures transcriptionnelles à travers des échantillons. heatmap en cluster montrant l'expression des gènes de signature A Wnt et les gènes de signature hérisson B, à travers des échantillons dans l'étude. Toutes les valeurs d'expression sont Zscore normalisée. Zscore < -1 sont bleu, Z-score > 1 sont rouges avec une coloration graduée par le biais blanc à 0. Les noms exemples sont sur l'axe des x, ils sont regroupés par modèle d'expression et des échantillons avec des scores élevés de signature sont à droite. Les échantillons présentant des mutations somatiques non synonymes APC (A) ou des mutations PTCH1 (B) et désigné par un astérisque au-dessus du heatmaps. WNT signature gènes (haut en bas): fstl1, DACT1, CD99, LMNA, SERPINE1, TNFAIP3, GNAI2, ID2, MVP, ACTN4, CAPN1, LUZP1, MTA1, RPS19, PTPRE, Axin2, NKD2, SFRS6, CCND1, SCAP, CPSF4 , SENP2, DKK1, PRKCSH, SLC1A5, HDGF, CBX3, SCML1, PCNA, RPS11, SNRPA1, TGM2, LY6E, IFITM1, NSMAF, TCF20, BCAP31, AXIN1, AGRN, PLEKHA1, SLC2A1, CTNNB1, EIF5A, IMPDH2, GSK3B, PFN1 , UBE, MAP3K11, ARHGDIA, HNRPUL1, FLOT2, GYPC, NCOA3, CENTB1, SYK, POLR2A, KRT5, DHX36, ELF1, SMG2, FGD6, MAPKAP1, LOC389435, RPL27A, SRP19, RPL39L, SFRS2IP, FUSIP1
; Hedgehog signature gènes (haut en bas):. LRFN4, JAG2, RPL29, WNT5A, SNAI2, FST, MYCN, BMP4, CCND1, BMI1, c-flip, PRDM1, Activation
GREM1, FOXF1, CCND2, CD44
du voie hedgehog est également courante dans PTCH1 des échantillons de carcinome
est un gène suppresseur de tumeur et agit comme un récepteur pour les ligands hedgehog et inhibe la fonction de smoothened. Quand lissée est libéré, il signale intracellulairement conduisant à l'activation des facteurs de transcription GLI [74]. Des mutations multiples somatiques de PTCH1
sont enregistrés dans COSMIC, conformément à son rôle de suppresseur de tumeur.

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