PLoS ONE: Metabolomica accoppiato con multivariata dei dati e analisi Pathway sui potenziali biomarcatori nella ulcera gastrica ed effetti di intervento di Corydalis yanhusuo Alkaloid

Estratto

La metabolomica, l'analisi sistematica dei potenziali metaboliti in un campione biologico, è stato sempre più applicata alla scoperta di biomarcatori, individuando percorsi perturbate, misurare bersagli terapeutici, e la scoperta di nuovi farmaci. Analizzando e verificando la differenza significativa nei profili metabolici e cambi di biomarcatori metaboliti, metabolomica permette di capire meglio sostanza vie metaboliche che possono chiarire il meccanismo di medicine tradizionali cinesi (TCM). Corydalis yanhusuo
alcaloide (CA) è una componente importante di Qizhiweitong (QZWT) prescrizione che è stato usato per il trattamento di ulcera gastrica per secoli e il suo meccanismo rimane completamente chiaro. Metabolita profiling è stata effettuata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione combinata con spettrometria di massa a tempo di volo (HPLC /ESI-TOF-MS) e in collaborazione con l'analisi dei dati e l'analisi multivariata percorso. Il software statistico Messa Profiller Prossional (MPP) e il metodo statistico tra cui ANOVA e analisi delle componenti principali (PCA) sono stati utilizzati per la scoperta di nuovi potenziali biomarcatori per chiarire il meccanismo di CA nel trattamento di ratti di acido iniettato con ulcera gastrica. Le variazioni di profili metabolici sono stati ripristinati i valori basali dopo il trattamento CA secondo le trame punteggio PCA. Dieci diversi biomarcatori potenziali e sette vie metaboliche chiave che contribuiscono al trattamento dell'ulcera gastrica sono stati scoperti e identificati. Tra le vie, sphingophospholipid rete correlati metabolismo degli acidi grassi e il metabolismo sono stati acutamente perturbata. Quantitative analisi reale tempo di reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) sono stati eseguiti per valutare l'espressione di geni correlati ai due percorsi di verifica dei risultati di cui sopra. I risultati mostrano che i biomarcatori cambiati e percorsi possono fornire la prova di comprensione dei meccanismi di azione di farmaci e ci consentirà di aumentare la produttività della ricerca verso la scoperta della droga metabolomica

Visto:. Tianjiao L, W Shuai, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et al. (2014) Metabolomica accoppiato con multivariata dei dati e analisi Pathway sui potenziali biomarcatori nella ulcera gastrica ed effetti di intervento di Corydalis yanhusuo
Alkaloid. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10.1371 /journal.pone.0082499

Editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: May 15, 2013; Accettato: 24 ottobre 2013; Pubblicato: 15 gen 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Programma chiave della Science Foundation naturale dello Stato (n ° 81.241.111). La Aglient ed i finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:. Gli autori dichiarano che il loro manoscritto non ha rapporti con Agilent Technologies Co, Ltd., per quanto attiene all'occupazione, consulenza, brevetti, prodotti in sviluppo o prodotti commercializzati ecc Questo è parte di un progetto master~s e si distingue da qualsiasi progetto interno. Uno dei corrispondenti autori, Xiaorong Ran, è impiegato da Agilent Technologies Co., Ltd., che ha contribuito allo studio di progettazione, sperimentazione e /o analisi. Lei Wang è anche impiegato da Agilent Technologies Co., Ltd., che ha supervisionato lo studio e ha contribuito a modificare gli errori grammaticali nel manoscritto. Gli autori confermano che l'occupazione da Agilent Technologoies non altera la loro adesione a una qualsiasi delle politiche di PLoS ONE su dati e la condivisione di materiale.

Introduzione

ulcera gastrica è una malattia molto diffusa che affligge molte persone in tutto tutto il mondo a causa della sua morbilità sempre più in alto. Secondo le statistiche del 2005, l'incidenza di ulcera gastrica è stato fino al 80%, in particolare il mondo occidentale. Ha 40-80% della frequenza ricorrenti in tutto il mondo. Ulcera gastrica negli esseri umani si verificano spesso a causa di vari fattori endogeni ed esogeni come lo stress, il fumo, carenze nutrizionali, acido cloridrico, pepsina, Helicobacter pylori
, l'uso di droghe anti-infiammatori non steroidei (FANS), alcol e infezione [1]. Mentre questi fattori sono stati presumibilmente implicata nella patogenesi delle ulcere gastriche, il meccanismo di formazione di ulcere non è ancora ben compreso [2], [3]. TCM ha guadagnato crescente accettazione in tutto il mondo negli ultimi anni ed è generalmente considerato come naturale e innocuo [4], [5]. Terapie collettivamente chiamati MTC sono comunemente usati per il trattamento di ulcera gastrica, che comprende fitoterapia cinese e prescrizione ecc

QZWT prescrizione composto da Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae
e Radix Bupleuri
ect. sono stati ampiamente utilizzati per curare l'ulcera gastrica per secoli in Cina, grazie alla sua notevole prestazioni terapeutico in applicazione clinica [8] - [10]. Abbiamo purificati CA da piante "Corydalis yanhusuo W.T. Wang" con la purezza del 92%. I costituenti chimici di Corydalis yanhusuo
sono stati studiati nel nostro studio precedente. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine et al sono state le attività biologiche del Corydalis yanhusuo
. Le strutture dei componenti sono stati esaminati. CA è riconosciuto come il principale componente attivo in Corydalis yanhusuo
[6], e ha dimostrato di avere effetti antiulcera utilizzato nella pratica clinica cinese per molti anni [7]. E 'stato anche riportato che CA possiede effetto antinfiammatorio [8], [9]. Tuttavia, il meccanismo molecolare dettagliata di CA nel trattamento dell'ulcera gastrica non è ben compreso.

Per spiegare il meccanismo di azione dei farmaci, metodologia metabolomics è stato ampiamente utilizzato [10]. Metabolomica è un componente importante della biologia dei sistemi, soprattutto nella determinazione del profilo metabolico globale rilevando migliaia di molecole piccole e grandi in vari media vanno da colture di cellule ai fluidi biologici umani quali urina, saliva, e sangue [11], [12] , [13]. Ha un grande impatto nella ricerca di scoprire biomarcatori, e individuando percorsi perturbate a causa di malattia o di trattamento farmacologico [14]. Analizzando e verificando le specifiche biomarcatori precoci di una malattia, metabolomica permette di capire meglio sostanza vie metaboliche che possono chiarire il meccanismo d'azione [15].

I recenti progressi della strumentazione e il calcolo hanno permesso l'analisi simultanea di un gran numero di metaboliti. HPLC accoppiato con SM ha dimostrato di essere un efficace combinazione di metaboliti identificazioni e quantificazioni grazie alla sua eccellente risoluzione e sensibilità. Lo scopo del presente studio è stato quello di ottenere una visione sistematica di sezionare il meccanismo di CA come un trattamento efficace per l'ulcera gastrica. Le vie biochimiche specifiche e uniche di efficacia dei farmaci possono essere identificati, quando accoppiato con tecniche di analisi multivariata dei dati. Lo scopo di questo studio è quello di individuare molteplici metaboliti che potrebbero facilitare la comprensione del meccanismo d'azione di CA e di aiutare la loro incorporazione in futuro miglioramento della terapia TCM.

Materiali e Metodi

2.1 Dichiarazione etica

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i protocolli animali approvati e le linee guida stabilite dal Comitato Etico Medicine Review per gli esperimenti sugli animali di Liaoning Università di Medicina tradizionale Cinese.
Manipolazione

2.2 degli animali e preparazione del campione

Sette settimane di età ratti SD maschi di peso 200-250 g, sono stati forniti dal centro animale sperimentale di Dalian Medical University. La cura e la gestione dei ratti erano in conformità con lo standard di specifico patogeno libero. ulcera gastrica è stata indotta nei ratti secondo il metodo in una relazione precedente con una leggera modifica [16], [17]. Tre giorni dopo la produzione di ulcera gastrica, i ratti sono stati randomizzati in cinque gruppi: controllo, modello, gruppo ad alto dosaggio CA (32,4 mg /ml), gruppo di dose media CA (10,8 mg /ml) e CA gruppo a basso dosaggio (3,6 mg /ml). Tutti i ratti, in gruppi sono stati somministrati per via orale della soluzione gruppo attivo 1,5 ml una volta al giorno (modello e gruppo di controllo con soluzione fisiologica) per 7 giorni. I ratti sono stati proibiti qualsiasi cibo per 12 ore prima che gli esperimenti, ma è stato permesso l'accesso all'acqua liberamente.

L'ultimo giorno, i ratti erano profondamente anestetizzati e poi sacrificati. Il sangue è stato raccolto, plasma e siero sono stati separati mediante centrifugazione a 3000 rpm per 15 min a 4 ° C. I campioni di plasma sono stati raccolti e conservati a -80 ° C sono state eseguite Flash congelato in azoto liquido fino al momento dell'analisi metabolomica. Poi, stomaci sono stati tagliati lungo la grande curvatura, lavati con soluzione salina. L'area dell'ulcera è stata misurata mediante una bussola per misurare l'indice ulcera. L'area dell'ulcera uguale alla larghezza dei tempi ulcera la lunghezza dell'ulcera. Per la valutazione istologica, campioni di tessuto gastrico sono stati fissati in formalina tamponata neutra per 24 h. sezioni di stomaco sono stati disidratati con etanolo classificato, passato attraverso xilene, e inclusi in paraffina. sezioni di paraffina (spessore 5 mm) sono state colorate con ematossilina /eosina (HE). Gli altri tessuti ulcerate gastrici sono stati rapidamente rimossi e congelati in azoto liquido fino a quando l'estrazione di RNA totale del tessuto.

2.3 metaboliche Profiling

2.3.1 cromatografia.

La cromatografia è stata eseguita utilizzando un sistema della serie HPLC Agilent 1100 dotato di pompa quaternaria, degasatore on-line, campionatore automatico, e comparto colonna termostatato. Il volume di iniezione è stato fissato a 4 ml. Tutti i campioni sono stati mantenuti a 4 ° C durante l'analisi. La separazione è stata eseguita su un * 100 millimetri 4.6, colonna ZORBAX SB-C18 (Agilent, USA). La temperatura della colonna è stata fissata a 45 ° C. Le fasi mobili erano composti di acido formico 0,1% in acqua (solvente B) e acido formico 0,1% in acetonitrile (solvente A), la portata è stato impostato come 1 ml /min con split rapporto 01:03, il gradiente è stato utilizzato come segue: un gradiente lineare del 70- 33% B su inizializzazione 5.0 min, 33 -98% B su 5,0-12,0 min. L'eluente è stato introdotto per lo spettrometro di massa direttamente. Dopo ogni 10 campioni iniettare, un campione composito come il campione QC seguito da uno spazio è stato iniettato per garantire la stabilità e ripetibilità dei sistemi LC-MS.

2.3.2 Mass Spectrometry.

Per la spettrometria di massa, Agilent 6220 TOF-MS con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità negativo è stato utilizzato. La portata di gas morire (N2) è stato fissato a 9 L /min. Il nebulizzatore è stato fissato a 45 psi. Le altre condizioni ottimali erano le seguenti: morire temperatura del gas di 350 ° C, tensione frammento di 120 V. I dati sono stati raccolti nella modalità a scansione da m /z 50 a 1050 amu sopra 0-12 min. I dati sono stati raccolti MS in modalità baricentro.

2.3.3 multivariata analisi dei dati.

procedura di analisi dei dati è mostrato in fig. 1. L'algoritmo Molecular Feature estrattore (MFE) nel software di analisi qualitativa Mass Hunter è stato usato per estrarre funzioni-identificati molecolari, composti non mirati - in ciascuno dei dati. L'algoritmo MFE cerca segnali di massa (ioni) che sono covarianti nel tempo, considera possibili relazioni chimiche (isotopi, addotti, dimeri, molteplici stati di carica), e genera uno spettro di massa cromatogramma composti e composti estratti per ogni caratteristica molecolare. L'elenco composto estratto per ogni file è stato esportato come file in formato composto Exchange (. CEF) per ulteriore Mass Profiler professionale (versione B.2.00, Agilent) analisi statistiche. I file funzione risultanti per ogni campione sono stati trattati con ANOVA e PCA analisi utilizzando il software MPP, che allineato, normalizzato, visualizzati e filtrati le caratteristiche molecolari (MFS), per l'ulteriore elaborazione [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Successivamente, il clustering gerarchico (stato degli alberi) è stato applicato ai file di dati. analisi dei cluster gerarchica è un metodo statistico per i campioni di gruppo senza sorveglianza in vari gruppi o rami dell'albero gerarchico. In questo modo, vengono mostrati i rapporti tra i diversi gruppi. L'albero condizione è stata visualizzata come una mappa di calore. L'identità di biomarcatori con cambiamenti significativi nei gruppi è stato determinato da caratteristiche ID del browser di MPP.

2.3.4 Biomarkers Identificazione.

L'identificazione di potenziali biomarcatori è stata determinata da Q-TOF (Xevo G2). L'energia di collisione MS è 35ev, ei dati sono stati ottenuti in modalità ioni negativi, software x (V4. MassLn1) è stato utilizzato per l'analisi dei dati. Le identità dei metaboliti specifici sono stati confermati da confronto elementi di informazione dei loro spettri di massa utilizzando le informazioni composizione elementare fornite dal software.

2.3.5 Rete e Pathway Analysis.

software MPP è stato impiegato a tutti significativi (modifica della cartella > 2) fino metaboliti regolamentati e giù regolamentati e percorsi biologici correlati. I potenziali marcatori identificati sono stati confrontati con il preciso rapporto di massa carica in alcuni database, tra cui HMDB, KEGG, METLIN, LIPID MAPPE e PubChem, alla scoperta di percorsi relativi. T-test e piegare-alter sono stati usati per determinare la significatività statistica nelle vie. valore di P < 0,05 e il cambiamento cartella > 2 è stato considerato come criteri per la statisticamente significativa e saranno selezionati

2.6 dati molecolari

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti dello stomaco tra cui il controllo, il modello e CA. gruppi utilizzando un reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. cDNA è stato sintetizzato da RNA totale (1 mg) utilizzando il kit Transscript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Pechino transgen Biotech, Cina). real time PCR quantitativa (CFX96, Bio-Rad, Stati Uniti d'America) è stata effettuata utilizzando un kit TransStart ™ Top Green qPCR SuperMix (Pechino transgen Biotech, Cina). Primer utilizzati per amplificare S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 e Fabp1 erano da Invitrogen (S1Pr1: GenBank acc no NM_017301, S1Pr3:.. GenBank acc non XM_225216, SphK1:.. GenBank acc non NM_133386, Got2:... GenBank acc No . NM_013177.2, Fabp1:.. GenBank acc non NM_012556.2) e l'espressione di queste trascrizioni è stata quantificata contro il gene housekeeping β-actina, che è stato amplificato utilizzando i primer 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'e 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. I livelli di espressione di geni bersaglio sono stati analizzati utilizzando il gestore di sistema CFX (BIO-RAD, Stati Uniti d'America).

2.7 Analisi statistica

I dati sono espressi come media ± SEM. SPSS 19.0 per Windows è stato utilizzato per l'analisi statistica. I dati sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA, con p < 0,05 impostato come livello di significatività statistica

Risultato

3.1 Effetto della CA sul acetico iniettato indotta ulcera gastrica modello
.

il modello sperimentale di acido acetico iniettato indotta danno alla mucosa gastrica nei ratti è spesso impiegato per lo screening dei composti per attività anti-ulcera che serve come la principale causa di ulcera gastrica nell'uomo [22]. Acido acetico iniettato indotta intenso danno della mucosa gastrica nella formazione dell'ulcera nel gruppo del modello (Fig. 2A) ratti che ha una significativa differenza rispetto al gruppo di controllo (Fig. 2B). osservazione patologica è stata utilizzata per confirme il danno di acido acetico-indotta negli strati superficiali della mucosa gastrica ulteriormente. acido acetico indotta ulcere gastriche (Fig. 2C) ha un effetto di erosione alla mucosa, che è stata accompagnata da frattura muscolare e infiltrazione di cellule infiammatorie negli strati rispetto al controllo (Fig. 2D). I risultati hanno dimostrato che il modello di ulcera gastrica è stata riprodotta con successo. I risultati del time-course mostrato in Fig. 2E illustrano che l'area dell'ulcera in ratti trattati con CA rimaneva significativamente minore rispetto ai rispettivi valori nei ratti modello al settimo giorno, in modo da choosed campioni settima giornata per l'analisi. Per valutare gli effetti di CA, come dimostrato in fig. 2F, l'area di ulcera gastrica in gruppi di dosaggio CA era significativamente diminuito rispetto al gruppo del modello (p < 0,01). I nostri risultati sperimentali suggeriscono che CA può curare efficacemente l'ulcera gastrica, in particolare il gruppo di dosaggio medio. Sembra che vi è una marcata sovrapposizione tra le vie patogenetiche neuronali coinvolti in ulcera genesi e depressione. Pertanto, non è sorprendente che i farmaci per il trattamento di episodi depressivi può anche esercitare potente effetto protettivo contro l'ulcera gastrica [23]. Il motivo per cui il Gruppo CA dose media hanno un migliore effetto terapeutico rispetto al gruppo ad alto dosaggio può essere CA gruppo ad alto dosaggio ha un ruolo di inibire nervi. L'effetto di CA è stata esaminata per indagare ulteriormente il meccanismo.

3.2 Metabolomica Studio

3.2.1 acquisizione e l'elaborazione dei dati di profilo metabolico.

I cromatogrammi totale di ioni rappresentative ( TIC) di campioni di plasma derivati ​​dal controllo, il modello e gruppi di dosaggio di CA in modalità negativi sono presentati in Fig. 3 in base alle condizioni ottimali LC-MS sopra descritti. Basso metaboliti di massa molecolare potevano essere separati bene nel breve tempo di 15 min. Al fine di visualizzare meglio le somiglianze e le differenze sottili tra questi insiemi di dati complessi, diversi metodi di pattern recognition sono stati impiegati per il fenotipo metabolome plasma dei ratti. Qui, l'analisi di clustering gerarchico e PCA sono stati usati per classificare i fenotipi metabolici e identificare i metaboliti differenting. Gerarchica analisi di clustering dei dati ha mostrato metabolomica separazione netta tra il controllo, gruppo di modelli e il gruppo della dose CA (Fig. 4). Nei punteggi PCA, ogni punto rappresenta un singolo campione. I risultati vengono visualizzati come PCA trame punteggio che indica la dispersione dei campioni, che indicano simili composizioni metabolomica quando raggruppati insieme e compositivo diversi metabolomes quando disperso. Il punteggio plot PCA potrebbe suddividere i diversi campioni di plasma in diversi blocchi, rispettivamente, il che suggerisce che i profili metabolici sono cambiate. Per quanto riguarda le informazioni analista della PCA nel nostro esperimento ha mostrato in fig. 5, i gruppi di controllo e di modello sono stati significativamente divisi in due classi, indicando che il modello di acetico ulcera gastrica indotta da acido è stato riprodotto con successo. Più sottili cambiamenti possono essere trovati dai pattern recognition trame approccio a punteggio di PCA. risultati PCA mostrano che il gruppo modello è stato lontano dai rimanenti quattro gruppi, indicando che cambiato modello metabolico provocato da acido acetico indotta può essere significativamente diverso dagli altri. La posizione del gruppo di trattamento era vicino al gruppo di controllo, suggerendo che modello metabolico mutato è stato causato da CA. I risultati manifesto che CA potrebbe cambiare lo stato metabolico anomalo e può avere un meccanismo diverso trattamento di ulcera gastrica acetico acido-indotta.

3.2.2 Identificazione di potenziali biomarcatori.

La piccola molecola metaboliti di differenze significative (t-test, p < 0,05) sono stati cercati dal software di MPP. I potenziali marcatori sono stati identificati utilizzando il "Browser ID" per cercare nel database METLIN (http://metlin.scripps.edu/) e confrontato con il preciso rapporto di carica di massa in alcuni database, tra cui HMDB (http: //www. hmdb.org/), KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), LIPID MAPPE (http://dev.lipidmaps.org:25424/), e PubChem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Siamo in grado di conoscere il nome probabile di potenziali biomarcatori attraverso il primo passo. Nel presente studio, 10 potenziali biomarker state identificate (Tabella 1). La massa molecolare precisa di composti con cambiamenti significativi nei gruppi è stato determinato entro errori di misura (< 5 ppm) da Waters Xevo G2 QTOF, e nel frattempo, il potenziale composizione elementare, grado di insaturazione e frazionata isotopo abbondanza di composti sono stati ottenuti. La formula molecolare presunta è stata cercata in ChemSpider (http://www.chemspider.com/), HMDB e altri database per identificare i possibili costituzioni chimici, ed i dati MS /MS sono stati proiettati per determinare i potenziali strutture degli ioni. Sfingosina-1-fosfato (S1P) e l'acido stearico sono stati presi come esempi per illustrare frammenti della struttura e il processo di valutazione. Le informazioni di spettrometria di massa primaria e secondaria è stato analizzato mediante MassLynx (visione 4.1, acque) software, rispetto al database e frammenti ionici di 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) hanno mostrato in Fig. 6 A. I principali ioni frammento analizzati dallo screening MS /MS erano m /z 224,080, 165,1254 e 82,0238, che potrebbe corrispondere a perso C 7H 15NO 5P, C 11H 17O, C 4H 4NO rispettivamente. Infine, è stato ipotizzato come S1P dopo riferendosi e in base alla loro dimensione polarità. Nel frattempo, i frammenti di ioni di acido stearico 284.2715 (C 18H 36 ° 2) (Fig. 6 B) sono stati 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19o), 117,0962 (C 6H 13o 2) e 83,0962 (C 6H 11).}

I biomarcatori sopra descritti sono stati rivelati hanno una stretta rapporto con la formazione e il trattamento dell'ulcera gastrica. La significativa crescita regolata D-glucosio, lisina, acido urico, acido piruvico, corticosterone, sfingosina-1-fosfato ed il basso regolato triptofano, glicocolato, acido hexadecanedioic, acido stearico sono state osservate nel gruppo del modello rispetto al gruppo di controllo (Fig. 7 ). Questa differenza di metaboliti può indicare il loro potenziale come biomarcatori mirate per differenziare ulcera gastrica e stati normali. Il monitoraggio dei cambiamenti di questi metaboliti possono predire lo sviluppo di ulcera gastrica. I biomarcatori 1, 2, 3, 4, 7, 8 sono diminuiti dopo il trattamento di CA, al contrario, sono stati aumentati gli altri biomarcatori. Inoltre, al fine di caratterizzare antiulcera effetti di CA più chiaramente, cambiamenti nelle concentrazioni relative di metaboliti bersaglio identificati in diversi gruppi sono stati analizzati, abbiamo trovato che il contenuto di questi marcatori chiave più vicino al gruppo normale. I risultati indicano il meccanismo per il trattamento di ulcere gastriche può essere ottenuto attraverso la regolazione di questi marcatori significativamente e la loro interazione come Fig. 8. Ad esempio, acido stearico, che chiama 17FA, ha relazione con acido thapsic se la proteina Fabp1 (acid-binding protein 1 grassi). La rete non solo indica l'interazione tra biomarker, ma fornisce anche informazioni di potenziale proteine, geni, gli enzimi e processi biologici. Contribuisce alla scoperta del bersaglio durante il verificarsi ed il trattamento dell'ulcera gastrica ed è conduttivo per lo sviluppo di nuovi farmaci per curare l'ulcera gastrica.

3.3 Determinazione dei livelli di mRNA per confermare i biomarcatori

per confermare i nostri risultati metabolomica, abbiamo bisogno di alcuni dati molecolari, così abbiamo identificato 5 mRNA che sono collegati ai 4 biomarcatori potenziali e 2 vie metaboliche con RT-PCR. metabolismo sfingolipidi, tra cui S1Pr1, S1Pr3 e SphK1 sono stati esaminati come mostrato in fig. 8. I risultati sono riassunti nella Fig. 9. Il livello di mRNA di S1Pr1, SIPr3 e SphK1 erano significativamente upregulated nel gruppo del modello, i livelli di espressione sono stati 5,21, 2,54, 6,57 volte rispetto al gruppo di controllo, che era in accordo con i nostri risultati e dei dati precedenti. Dopo il trattamento CA, i livelli di espressione di S1Pr1, S1Pr3 e SphK1 sono tornati al livello basale. S1P è formata da due chinasi, sfingosina chinasi 1 e 2 (SphK1 e SphK2), ma non sono state osservate differenze nell'espressione SphK2 tra tutti i gruppi (dati non riportati), il risultato è stato in linea con i nostri risultati di rete. Qui, siamo in grado di spiegare un potenziale meccanismo di CA nel trattamento dell'ulcera gastrica bloccando S1P aumentando. Abbiamo anche trovato una diminuita espressione di Fabp1 e Got2 nel gruppo di modelli (Fig. 9), rispetto al gruppo di controllo. Ma CA fa i gruppi sono stati vicino al gruppo di controllo, che ha confermato che l'effetto terapeutico di CA era legato al metabolismo degli acidi grassi dal livello molecolare.

3,4 Pathway Analysis

un'analisi più dettagliata dei percorsi e reti influenzate da ulcera gastrica è stata effettuata da MPP. I percorsi spettacoli ottenuti nella Tabella 2. Usiamo l'alta qualità KEGG vie metaboliche come la base di conoscenze back-end per individuare i percorsi più importanti, come il metabolismo degli sfingolipidi, ciclo dell'acido tricarboxylicacidcycle, metabolismo biotina e così via, in cui 7 percorsi unici ( elencati nella Tabella 1) per il gruppo del modello è stato identificato. I potenziali biomarcatori correlati al metabolismo dell'acido folico, metabolismo degli acidi grassi, e percorsi del metabolismo sfingolipidi sono stati conformati. Dei 6 metaboliti distinti identificati da questi percorsi, molti sono in varie fasi di avanzamento del ulcera gastrica. Alcuni metaboliti significativamente modificate come glicocolato, acido hexadecanedioic, e acido stearico sono stati trovati e utilizzati per spiegare il meccanismo di acido grasso. Questi risultati suggeriscono che questi percorsi di destinazione mostrano le perturbazioni marcati oltre la formazione di ulcera gastrica e potrebbero contribuire allo sviluppo di ulcera gastrica.

Discussione

Le ulcere gastriche nell'uomo ricorrono di frequente, e la difficoltà nel trattamento di loro è indicato con l'adagio "una volta l'ulcera, sempre un'ulcera" [24]. Molti fattori possono aumentare l'incidenza di ulcera gastrica, ma il meccanismo non è stato compreso chiaramente. Pertanto, l'efficacia del trattamento farmacologico dipende non solo la diminuzione di fattori dannosi, ma anche sui metaboliti modificati che regolano il percorso metabolismo. In particolare, la scoperta di biomarcatori in grado di predire il rischio di ulcera gastrica sarà l'occasione per la diagnosi e consentire il trattamento farmacologico tempestivo. QZWT è stato usato per curare l'ulcera gastrica per molti anni in Asia, anche se il suo meccanismo rimane poco chiaro. Metabolomica accoppiato con strumenti di dati multivariati che contemporaneamente quantificano migliaia di metaboliti in un organismo vivente è stato utilizzato per analizzare i biomarcatori in ulcera gastrica [25]. Inoltre, la comprensione dei biomarcatori ha suscitato nuovo interesse nel campo dei programmi di scoperta della droga e il controllo delle malattie, fornendo prezioso in-sights circa i meccanismi di malattia complessa [26]. Questo studio è stato quindi progettato per chiarire ulteriormente il meccanismo di base di CA il regolamento ulcera gastrica dalle vie metaboliche in una visione globale.

Il modello di ulcera gastrica nei ratti è stata riprodotta con successo. I campioni di plasma sono stati analizzati mediante HPLC /ESI-TOF-MS e analisi statistica multivariata. I risultati hanno mostrato che l'area dell'ulcera e profili metabolici dinamiche dopo il trattamento CA sono stati chiusi al gruppo di controllo, dimostrando che CA ha efficacia terapeutica. Secondo l'analisi metabolomica, 10 potenziali biomarcatori e 7 relative vie metaboliche sono state identificate nel nostro studio. Il D-glucosio, lisina significativamente verso il basso regolato, acido urico, acido piruvico, corticosterone, sfingosina-1-fosfato e fino regolato triptofano, glicocolato, acido hexadecanedioic, acido stearico sono stati osservati nel gruppo CA rispetto al gruppo di modelli. Inoltre, il metabolismo dell'acido folico, il metabolismo degli acidi grassi e il metabolismo sfingolipidi e molti altri metabolismo sono stati confermati ad avere un impatto sulla ulcera gastrica. Abbiamo determinare l'espressione di mRNA sono collegati sfingolipidi metabolismo metabolismo e acidi grassi per convalidare il meccanismo. Molti altri potenziali proteine, geni, enzimi e bioprocessi chiuse per altri percorsi devono futuri esperimenti per convalidare.

Per l'analisi e la verifica delle specifiche biomarcatori precoci di una malattia, metabolomica ci permette di comprendere meglio i processi patologici e le vie metaboliche di altre sostanze . Noi crediamo che il biomarker e analisi via hanno un grande potenziale per esplorare e chiarire l'azione terapeutica della MTC. In questo studio, abbiamo caratterizzato interazione biomarker reti comportano proteine, geni, enzimi e bioprocesso come mostrato in Fig. 8. S1P atto extracellulare come un ligando per i suoi specifici recettori-S1PRs, è ora riconosciuto come regolatore di molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui malattie infiammatorie, come l'artrite reumatoide, malattia infiammatoria intestinale, e sepsi [27], [28]. L'infiammazione che si verifica nella mucosa del tratto gastrointestinale, quindi, provoca ulcere gastrointestinali [29]. I nostri risultati mostrano che CA può diminuire l'espressione di S1P e dei suoi recettori, tra cui S1Pr1 e S1Pr3, per alleviare i problemi di infiammazione per alleviare la formazione di ulcere gastriche [30]. S1P è formata da SphK1 e SphK2 [31]. SphK1 può attiva la NF-kB, che avviato dal grande molecola di segnalazione infiammatoria TNF-α. In breve, NF-kB e TNF-α è strettamente legato a formare e curare l'ulcera gastrica [32], [33]. Abbiamo anche trovato che la carenza di SphK1 (non SphK2) inibisce significativamente ulcera gastrica, indicando che SphK1 può giocare un ruolo fondamentale nel ulcera gastrica. Così, il metabolismo degli sfingolipidi può essere un obiettivo vitale per il trattamento di ulcera gastrica.

L'acido stearico, glicocolato e acido hexadecanedioic cambiati causano metabolismo degli acidi grassi disturbo chiusura per l'incidenza e la riabilitazione di ulcera gastrica [34], [35] . Gli acidi grassi, tra cui ecc acido stearico, comunemente visti come fonte di energia, hanno attratto l'interesse per la ricerca e la salute pubblica, a causa dei loro effetti sulla salute e delle patologie umane. Gli acidi grassi sono benefiche per la promozione della salute. acido stearico, glicocolato e hexadecanedioic sono regolati da Fabp1, l'enzima di acidi grassi-binding protein 1. Per l'analisi di RT-PCR, la bassa espressione di Fabp1 nel gruppo modello suggerisce che l'attività Fabp1 inibendo può ridurre l'acido stearico, glicocolato e acido hexadecanedioic , e portare a disturbi del metabolismo degli acidi grassi. Pertanto, un aumento della risposta infiammatoria e la disfunzione mitocondriale e promuovere la formazione di ulcere. Tuttavia, CA può bilanciare questo disturbo aumentando l'espressione di Fabp1 [36]. Glutammico-ossalacetico transaminasi 2 (Got2) è un enzima importante nel ciclo dell'acido tricarboxylicacidcycle (TCA). La gravemente inibizione della TCA causata dalla diminuzione di Got2 contribuirà alla formazione di ulcera gastrica. I metaboliti di aminoacidi come triptofano e dei suoi metaboliti in vivo hanno un ruolo ampio nel metabolismo del triptofano. La più importante è che i disturbi del metabolismo del triptofano possono causare disturbo TCA. TCA svolgono un ruolo nella guarigione dell'ulcera gastrica [37]. Down-regolazione dell'espressione Got2 mRNA in gruppo di modelli e di up-regulation in gruppi CA sono stati precedentemente dimostrato nel nostro risultato. Tutti questi dati indicano chiaramente che il meccanismo molecolare di CA trattamento di ulcera gastrica era strettamente correlato con i suoi effetti equilibrio su TCA. Questi risultati implicano effetti CA possono essere mediati attraverso proteine, enzimi, e via il metabolismo.

• PLoS ONE: L'espressione diminuita di fattori di crescita pro-angiogenici e dei loro recettori in ulcere gastriche di pazienti cirrotici
• PLoS ONE: In Vivo antiossidante e antiulcera attività di Parkia speciosa etanolica Estratto di foglie di etanolo-indotta ulcera gastrica a ratti