PLoS ONE: Metabolomiikka Yhdessä monimuuttujadatalaskenta ja Pathway analyysi Mahdolliset biomarkkerit mahahaava ja interventiot vaikutukset Corydalis yanhusuo Alkaloidi

tiivistelmä

Metabolomiikka, systemaattinen analyysi mahdollisten metaboliittien biologinen näyte, on yhä sovellettu löytää biomarkkerit, tunnistaa levoton polkuja, mittaus- terapeuttisia kohteita, ja löytää uusia lääkkeitä. Analysoimalla ja todentaa merkittävä ero metaboliaprofiilit ja muutokset metaboliitin biomarkkereita, metabolomiikan pystymme ymmärtämään paremmin aineen metaboliareitit joka voi selventää mekanismia perinteinen kiinalainen lääkintä (TCM). Corydalis yanhusuo
alkaloidi (CA) on tärkeä osa Qizhiweitong (QZWT) reseptiä, jota on käytetty hoitoon mahahaavan vuosisatoja ja sen mekanismi jää epäselväksi kokonaan. Aineenvaihduntatuote profilointi suoritettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografia yhdistettynä aika-of-lennon massaspektrometriaa (HPLC /ESI-TOF-MS) ja yhdessä monimuuttuja-analyysin kanssa ja polku analyysi. Tilastollinen ohjelmisto Mass Profiller Prossional (MPP) ja tilastollinen menetelmä sisältää ANOVA ja pääkomponenttianalyysi (PCA) käytettiin löytää uusia mahdollisia biomarkkereiden selkeyttämiseksi mekanismi CA hoidettaessa happo ruiskutetaan rottien kanssa mahahaava. Muutokset metabolinen profilointi palautettiin niiden lähtötasoarvot jälkeen CA mukaista hoitoa PCA pisteet tontteja. Kymmenen eri mahdollisia biomarkkereita ja seitsemän keskeisten metaboliareitteihin edistää mahahaavahoidon löydettiin ja tunnistettiin. Niistä väyliä, sphingophospholipid aineenvaihduntaa ja rasvahappojen aineenvaihduntaan liittyvä verkko olivat akuutisti levoton. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi suoritettiin arvioimaan geenien ilmentymistä, jotka liittyvät kahden reitin tarkastaa edellä esitetyt tulokset. Tulokset osoittavat, että muuttuneen biomarkkereita ja reitit voivat tarjota todisteita käsityksen huumeiden vaikutusmekanismit ja antaa meille mahdollisuuden lisätä tutkimuksen tuottavuutta kohti metabolomiikka lääkekehityksen.

Citation: Tianjiao L, Shuai W, Xiansheng M, Yongrui B, Shanshan G, Bo L, et ai. (2014) Metabolomiikka Yhdessä monimuuttujadatalaskenta ja Pathway analyysi Mahdolliset biomarkkerit mahahaava ja interventiot vaikutukset Corydalis yanhusuo
Alkaloidi. PLoS ONE 9 (1): e82499. doi: 10,1371 /journal.pone.0082499

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2013; Hyväksytty: 24 lokakuu 2013; Julkaistu: 15 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Tianjiao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Key Program Natural Science Foundation valtion (nro 81241111). Aglient ja rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että niiden käsikirjoitus ei ole suhteita Agilent Technologies Co, Ltd., jotka liittyvät työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteet jne Tämä on osa master~s projektin ja erottuu tahansa sisäinen projekti. Yksi vastaavien tekijöiden, Xiaorong Ran, työskentelee Agilent Technologies Co, Ltd., joka auttoi tutkimusasetelma, kokeita ja /tai analyysejä. Lei Wang palveluksessa on myös Agilent Technologies Co, Ltd., joka on ohjannut tutkimusta ja auttoi muokkaamaan kielioppivirheitä käsikirjoituksen. Kirjoittajat vahvistavat, että työpaikkojen Agilent Technologoies ei muuta niiden noudattamista tahansa PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

mahahaava on yleinen sairaus, joka vaivaa monia ihmisiä kaikki maailmassa, koska sen korkeammalle sairastuvuuteen. Tilastojen mukaan 2005 ilmaantuvuus mahahaava oli jopa 80%, erityisesti länsimaissa. Se on 40-80% toistuvien taajuuden kaikkialla maailmassa. Mahahaava ihmisillä esiintyy usein, koska eri endogeenisten ja ulkoiset tekijät, kuten stressi, tupakointi, ravitsemukselliset puutteet, suolahappoa, pepsiiniä, Helicobacter pylori
, steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden huumeiden käyttö (NSAID), alkoholi ja infektio [1]. Vaikka nämä tekijät on ajateltu olevan osallisena patogeneesissä mahahaavan, mekanismi haava muodostuminen ei ole vielä tarkasti ymmärtää [2], [3]. TCM on saavuttanut yhä hyväksyntää maailmanlaajuisesti viime vuosina, ja sen katsotaan olevan luonnollinen ja vaaraton [4], [5]. Therapies kollektiivisesti kutsutaan TCM käytetään yleisesti hoitoon mahahaava, joka sisältää Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden ja reseptiä jne

QZWT reseptiä koostuu Corydalis yanhusuo
, Radix Glycyrrhizae
ja Radix Bupleuri
ect. on laajalti käytetty paranna mahahaavan vuosisatoja Kiinassa, koska sen merkittävää terapeuttista suorituskyky kliinisen käytön [8] - [10]. Me puhdistettu CA kasveista "Corydalis yanhusuo W.T. Wang" ja puhtaus 92%. Kemiallinen aineosat Corydalis yanhusuo
on tutkittu edellisessä tutkimuksessa. Tetrahydropalmatine, corydaline, protopine et al olivat biologiset aktiivisuudet Corydalis yanhusuo
. Rakenteet ainesosien tutkittiin. CA on tunnustettu olevan tärkeä aktiivisen komponentin Corydalis yanhusuo
[6], ja osoittivat olevan mahahaavan vaikutusta käytetään kiinalaisen kliinisessä käytössä useita vuosia [7]. On myös raportoitu, että CA jolla on anti-inflammatorinen vaikutus [8], [9]. Kuitenkin yksityiskohtainen molekyylitason mekanismi CA hoidettaessa mahahaava ei ole oikein ymmärretty.

selittää vaikutusmekanismi huumeiden, metabolomiikan menetelmää on käytetty laajasti [10]. Metabolomiikka on tärkeä osa systeemibiologian, erityisesti määritettäessä globaalin metabolinen profiili havaitsemalla tuhansia pieniä ja suuria molekyylejä medioissa vaihtelevat soluviljelmissä ihmisen biologisissa nesteissä kuten virtsasta, syljestä, ja veri [11], [12] , [13]. Se on suuri vaikutus tutkinnassa löytää biomarkkereita, ja tunnistaa häirityn väyliä sairauden tai lääkehoitoa [14]. Analysoimalla ja todentaa varhaiskuntoutus biomarkkerit sairauden, metabolomiikan pystymme ymmärtämään paremmin aineen metaboliareitit joka voi selventää toimintamekanismi [15].

Viimeaikaiset edistysaskeleet instrumentoinnin ja laskenta ovat mahdollistaneet samanaikaista tutkimista suuri määrä metaboliitteja. HPLC yhdessä MS on osoittautunut tehokkaaksi yhdistelmä aineenvaihduntatuotteiden tunnisteiden ja kvantitatiivinen, sen erinomaisen tarkkuuden ja herkkyyden. Tavoitteena on nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli saada järjestelmällisesti jotta leikellä mekanismi CA tehokas hoito mahahaava. Erityinen ja ainutlaatuinen biokemiallisia reittejä lääkkeen tehon voidaan tunnistaa, kun yhdessä monimuuttuja-analyysin tekniikoita. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tunnistaa useita metaboliitteja, jotka voisivat helpottaa ymmärtämistä toiminnan mekanismi CA ja tukea niiden sisällyttämistä tuleviin parantaminen TCM terapia.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Eettinen linjaus

Kaikki kokeet suoritettiin mukaisesti hyväksytyn eläinten protokollia ja vahvistamien suuntaviivojen Medicine eettinen arviointi komitea eläinkokeiden Liaoningin University perinteisen kiinalaisen lääketieteen.

2.2 eläinten käsittely ja näytteiden valmistus

Seitsemän viikon ikäisiä urospuolisia SD-rottia, joiden paino 200-250 g, toimitti koe-eläimen keskellä Dalianin Medical University. Hoito ja käsittely rotille mukaisesti standardin Erityiset taudinaiheuttajista vapaat. Mahahaava aiheutettiin rottien menetelmän mukaisesti edellisessä raportissa pienin muutoksin [16], [17]. Kolmen päivän kuluttua tuotannon mahahaava, rotat satunnaistettiin viiteen ryhmään: kontrolli, malli, CA suuren annoksen ryhmässä (32,4 mg /ml), CA keskimmäinen annosryhmässä (10,8 mg /ml) ja CA matalan annoksen ryhmässä (3,6 mg /ml). Kaikki rotat, ryhmissä, annettiin suun kautta ja aktiivinen ryhmä liuos 1,5 ml kerran päivässä (malli ja kontrolliryhmiin suolaliuoksella) ja 7 päivää. Rotat kiellettiin mitään ruokaa 12 tuntia ennen kokeita, mutta saivat vedensaanti vapaasti.

viimeisenä päivänä, rotat olivat syvästi nukutettiin ja lopetettiin sitten. Verta kerättiin, plasmassa ja seerumissa erotettiin sentrifugoimalla 3000 rpm: ssä 15 min 4 ° C: ssa. Plasma kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa flash jäädytettiin nestetypessä, kunnes metabolomiikan analyysi suoritettiin. Sitten mahat leikattiin suurempaa kaarta pitkin, pestään suolaliuoksella. Alueella haavauma mitattiin kompassi mitata haavaindeksi. Alue haavauma on yhtä suuri kuin leveys haava kertaa niin pitkä haava. Histologista arviointia, mahalaukun kudosnäytteet kiinnitettiin neutraalissa puskuroidussa formaliinissa 24 tunnin ajan. Vatsa kohdat olivat dehydrattuja.Tähän arvostellaan etanolilla, läpi ksyleeni, ja upotettiin parafiiniin. Parafiinisektioista (5 mm paksuus) värjättiin hema- /eosiinilla (HE). Toinen mahalaukun haavaumia kudokset poistettiin nopeasti ja jäädytettiin nestetypessä ennen uuttamista kudoksen kokonaispinta-RNA: ta.

2,3 metabolinen profilointi

2.3.1 Kromatografia.

Kromatografia suoritettiin käyttämällä Agilent 1100 sarjan HPLC varustetussa kvaternaaripumpulla, verkossa kaasunpoistajaan autosamplerista, ja termostoidulla pylvästä. Injektiotilavuus vahvistettiin 4 ui. Kaikki näytteet pidettiin 4 ° C: ssa analyysin aikana. Erottaminen suoritettiin 4,6 * 100 mm, ZORBAX SB-C18-pylväs (Agilent, USA). Pylvään lämpötila oli asetettu 45 ° C: ssa. Liikkuvat faasit olivat koostuu 0,1% muurahaishappoa vedessä (liuotin B), ja 0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä (liuotin A), virtausnopeus asetettiin 1 ml /min, split-suhde 01:03, gradientti käytettiin seuraavasti: n lineaarisella gradientilla 70- 33% B käynnisty- 5,0 min, 33 -98% B 5,0-12,0 min. Eluentti otettiin käyttöön massaspektrometriin suoraan. Jokaisen 10 näytettä suonensisäisten, yhdistettyä näytettä, kun QC näyte seuraa tyhjä ruiskutettiin varmistamiseksi vakaus ja toistettavuus LC-MS järjestelmissä.

2.3.2 massaspektrometria.

massaspektrometria, Agilent 6220 TOF-MS kanssa sähkösumutusionisaatioon lähde (ESI) negatiivina käytettiin. Virtausnopeus kuolee kaasun (N2) asetettiin 9 l /min. Sumuttimen asetettiin 45 psi. Muut optimaaliset olosuhteet olivat seuraavat: kuolemaisillaan kaasun lämpötila 350 ° C, fragmentti jännite 120 V. Tiedot kerättiin koko skannaustilaa välillä m /z 50-1050 amu yli 0-12 min. MS kerättiin painopisteen tilassa.

2.3.3 monimuuttuja analyysiin.

Tietojen analysointi menettely on esitetty kuviossa. 1. Molecular piirteenpoimijan (MFE) algoritmin Mass Hunter Laadullinen analyysi ohjelmistoa käytetään erottamaan molekyyli- piirteitä-tunnistamattomia, kohdistamattomia yhdisteet - kussakin data. MFE algoritmi etsii massa signaaleja (ionit), jotka ovat covariant ajoissa, pitää mahdollisia kemiallisia suhteita (isotoopit, additiotuotteet, dimeerit, useita varaustiloissa), ja luo uuttaa yhdiste kromatogrammi ja yhdisteen massaspektri kunkin molekyyli ominaisuus. Uutettu yhdiste luettelo kunkin tiedosto vietiin yhdisteenä Exchange Format (. CEF) tiedosto edelleen Mass Profiler Professional (versio B.2.00, Agilent) tilastollinen analyysi. Tuloksena ominaisuus tiedostot kustakin näytteestä käsiteltiin ANOVA ja PCA-analyysi hyödyntämällä MPP ohjelmisto, joka linjassa, normalisoitu, visualisoida ja suodatetaan molekyylitason ominaisuudet (MFien), jatkojalostukseen [18], [19], [20], [ ,,,0],21]. Myöhemmin, hierarkkinen klusterointi (ehto puu) levitettiin tiedostoihin. Hierarkkinen klusterin analyysi on tilastollinen menetelmä ryhmitellä näytteitä valvomatta eri klustereissa tai oksat hierarkkinen puu. Tällä tavoin suhteita eri ryhmien välillä on esitetty. Ehto puu näkyi lämpöä kartan. Identiteettiä biomarkkereita merkittäviä muutoksia ryhmissä määritettiin ID Browser ominaisuuksia MPP.

2.3.4 biomarkkerit tunnistaminen.

potentiaalisten biomarkkereiden määritettiin Q-TOF (Xevo G2). MS törmäys energia on 35ev, ja tiedot saatiin negatiivisten ionien tilassa x (V4. MassLn1) ohjelmistoa käytettiin tietojen analysointia. Identiteetit erityisten aineenvaihduntatuotteiden vahvistettiin elementtejä tietoja vertaamalla niiden massaspektrit käyttäen alkuainekoostumuksen antamat tiedot ohjelmiston.

2.3.5 Verkko ja Pathway Analysis.

MPP ohjelmisto oli työssä kaikkiin merkittäviin (kansio muutos > 2) ylös säänneltyä ja säädeltiin aineenvaihduntatuotteiden ja niihin liittyviä biologisia polkuja. Mahdollinen markkereita tunnistettu verrattiin tarkka massa varauksen suhde joissakin tietokannoissa, kuten HMDB, Kegg, METLIN, LIPID MAPS ja pubchem, löytää liittyviä reittejä. T-testi ja taita-alter määrittämiseen käytettiin tilastollisen merkitys reittejä. P-arvo < 0,05 ja kansio muutos > 2 pidettiin kriteerit tilastollisesti merkitsevä ja se voi valita.

2.6 Molecular Data

Yhteensä RNA eristettiin vatsan kudoksista, mukaan lukien valvonta, malli ja CA ryhmiä käyttäen TRIZOL reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden. cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA (1 ug) käyttämällä TransScript Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi SuperMix kit (Beijing transgeeniset Biotech, Kiina). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (CFX96, BIO-RAD, USA) suoritettiin käyttäen TransStart ™ Top Green qPCR SuperMix- Kit (Beijing transgeeniset Biotech, Kiina). Monistamiseen käytetyt alukkeet S1Pr1, S1Pr3, SphK1, Got2 ja Fabp1 oli Invitrogen (S1Pr1: GenBank tali. Nro. NM_017301, S1Pr3: GenBank tali. Nro. XM_225216, SphK1: GenBank tali. Nro. NM_133386, Got2: GenBank tali. Nro . NM_013177.2, Fabp1: GenBank acc. no. NM_012556.2) ja ilmentymistä näiden transkriptien kvantitoitiin vastaan ​​taloudenhoito geeni β-aktiini, joka monistettiin käyttäen alukkeita 5'-TGGCACCACACTTTCTACAATGA-3 'ja 5'-AGGGACAACACAGCCTGGAT- 3 '. Ekspressiotasot kohdegeenien analysoitiin käyttämällä CFX Manager-järjestelmän (BIO-RAD, USA).

2,7 Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. SPSS 19.0 for Windows käytettiin tilastolliseen analyysiin. Aineisto analysoitiin käyttämällä ANOVA, jossa p < 0,05 määritetty tilastollisen merkitsevyyden.

tulos

3.1 Vaikutus CA etikkahapon pistetään aiheuttama mahahaava malli

kokeellisessa mallissa etikkahappoa ruiskutettiin aiheuttaman mahalaukun limakalvon vaurioita rotilla käytetään usein seuloa yhdisteitä vatsahaavanvastaista aktiivisuutta, että se toimii johtava syy mahahaavan ihmisellä [22]. Etikkahappo ruiskutetaan aiheuttama voimakas mahan limakalvon vaurioita muodostumista haava mallin ryhmässä (Fig. 2A) rottia, joilla on merkittävästi erilainen verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 2B). Patologinen havainto käytettiin confirme vahinkoja etikkahappo-indusoitu pintakerroksiin mahalaukun limakalvon ulteriorly. Etikkahappo aiheuttama mahalaukun haavaumia (Fig. 2C) on eroosio vaikutus limakalvoon, joka oli mukana lihasten murtuman ja tulehdussolujen tunkeutuminen kerrosten verrattuna kontrolli (Fig. 2D). Tulokset osoittivat, että malli mahahaavan onnistuneesti toistettu. Tulokset aika-kurssi osoitti kuvassa. 2E havainnollistavat, että alueen haava rottia altistettiin CA jäi huomattavasti pienempi verrattuna vastaaviin arvoihin mallissa rotilla seitsemäntenä päivänä, niin me valitsi seitsemännen päivän näytteitä analysoitavaksi. Vaikutusten arvioimiseksi CA, kuten on osoitettu kuviossa. 2F, alue mahahaavan CA annosryhmissä väheni huomattavasti verrattuna malliin (p < 0,01). Meidän kokeelliset tulokset viittaavat siihen, että CA voi tehokkaasti paranna mahahaavan, erityisesti keskellä annoksen ryhmässä. Näyttää siltä, ​​että on olemassa selvä päällekkäisyys hermosolujen patogeneettisiin reittejä mukana haavauma synnyssä ja masennus. Siksi ei ole yllättävää, että lääkitys hoidettaessa depressiivisiä episodeja voi myös aiheuttaa voimakas suojaava vaikutus mahahaava [23]. Syy miksi CA keskimmäinen annos ryhmä on parempi terapeuttinen vaikutus kuin suuren annoksen ryhmässä voi olla CA suuren annoksen ryhmässä on rooli estää hermo. Vaikutus CA tutkittiin edelleen tutkia mekanismia.

3,2 Metabolomic Study

3.2.1 hankinta ja käsittely metaboliaprofiilin datan.

Edustaja kaikkien ionien kromatogrammit ( TIC) plasmanäytteiden peräisin ohjaus, malli, ja CA annosryhmissä negatiivisissa tilat on esitetty kuvassa. 3 käyttämällä optimaalista LC-MS-olosuhteet on kuvattu edellä. Pienimolekyylimassaisia ​​aineenvaihduntatuotteiden voidaan erottaa hyvin lyhyessä ajassa 15 minuuttia. Jotta paremmin visualisoida hienoisia eroja ja yhtäläisyyksiä joukossa näiden monimutkaisten aineistoja, useita hahmontunnistuksen menetelmiä käytettiin fenotyypin plasman Metabolomi rottien. Täällä, hierarkkinen klusterointi analyysi ja PCA käytettiin luokitella metabolisen fenotyyppien ja tunnistaa differenting aineenvaihduntatuotteita. Hierarkkinen klusterointi analyysi metabolomiikan tiedot osoittivat selvästi erottelua ohjaus, malli ryhmä ja CA annoksen ryhmässä (Fig. 4). Vuonna PCA tulokset, kukin piste edustaa yksittäistä näytettä. PCA Tulokset näkyvät pisteet tontteja osoittaa hajonta näytteiden, jotka osoittavat samankaltaisia ​​metabolomiikan seoksiin ryhmitelty yhteen ja koostumukseltaan erilaisia ​​metabolomes levityksen yhteydessä. PCA tulokset juoni voisi jakaa eri plasmanäytteiden eri lohkojen osalta, mikä viittaa siihen, että aineenvaihduntaan ovat muuttuneet. Mitä tietoja analyytikko PCA meidän koe osoitti kuvassa. 5, ohjaus- ja malli ryhmät olivat merkittävästi jaetaan kahteen luokkaan, mikä osoittaa, että malli etikkahapon aiheuttaman mahahaavan onnistui toistettu. Enemmän hienovaraisia ​​muutoksia löytyy hahmontunnistuksen lähestymistapa-pisteet tontit PCA. PCA tulokset näyttää, että malli ryhmä oli kaukana loput neljä ryhmää, mikä osoittaa, että muuttunutta metabolinen kuvio johtui etikkahaposta aiheuttama voi olla merkittävästi erilainen kuin muut. Asema hoitoryhmän oli lähellä kontrolliryhmään, mikä viittaa siihen, että muuttunutta metabolinen malli aiheutti CA. Tulokset ilmeistä, että CA voisi muuttaa epänormaali metabolisen tilan ja voi olla erilainen kohtelu mekanismi etikkahappoa aiheuttama mahahaava.

3.2.2 Mahdollisten biomarkkereiden.

pienimolekyylisiä metaboliitteja merkittäviä eroja (T-testi, p < 0,05) etsittiin ohjelmiston MPP. Mahdollinen markkereita tunnistettiin käyttämällä "ID selaimen" etsiä Metlin tietokannasta (http://metlin.scripps.edu/) ja verrataan tarkka massa varauksen suhde joissakin tietokannoissa, mukaan lukien HMDB (http: //www. hmdb.org/), Kegg (http://www.genome.jp/kegg/), LIPID MAPS (http://dev.lipidmaps.org:25424/), ja pubchem (http: //pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/). Voimme tietää todennäköinen nimi mahdollisten biomarkkereiden läpi ensimmäisen vaiheen. Esillä olevassa tutkimuksessa 10 mahdolliset biomarkkerit tunnistettiin (taulukko 1). Tarkka molekyylimassa yhdisteitä merkittäviä muutoksia ryhmissä määritettiin sisällä mittausvirheiden (< 5 ppm) Waters Xevo G2 QTOF, ja sillä välin, mahdollisen alkuainekoostumuksen tyydyttämättömyysaste ja murto isotooppi runsaasti yhdisteet saatiin. Oletettu molekyylikaava etsittiin vuonna Chemspider (http://www.chemspider.com/), HMDB ja muihin tietokantoihin tunnistaa mahdollisia kemiallisia perustuslait, ja MS /MS-tiedot seulottiin määrittämiseksi mahdollisten rakenteiden ioneja. Sfingosiini-1-fosfaatti (S1P) ja steariinihappo otettiin esimerkkien avulla fragmentteja rakenteen ja arviointiprosessin. Ensisijainen ja toissijainen massaspektrometriaa tiedot analysoitiin Masslynx (visio 4.1, vedet) ohjelmisto, verrattuna tietokanta, ja ioni fragmentit 379,2488 (C _{18H 38NO 5P) on esitetty kuvassa. 6 A. Tärkeimmät fragmentti-ionit analysoitiin MS /MS seulonta olivat m /z 224,080, 165,1254 ja 82,0238, jotka voisivat vastata menetetty C 7H 15NO 5P, C 11H 17O, C 4H 4NO vastaavasti. Lopuksi oli spekuloitu kuin S1P jälkeen viittaavat ja niiden napaisuus koon. Samaan aikaan ioni fragmentteja steariinihapon 284.2715 (C 18H 36o 2) (Fig. 6 B) oli 212,2419 (C 15H 32), 143,1359 (C 9H 19o), 117,0962 (C 6 H 13o 2) ja 83,0962 (C 6 H 11).}

biomarkkerit edellä kuvatut osoittautui läheiset suhde muodostumista ja mahahaavahoidon. Merkittävästi up säädellään D-glukoosi, lysiini, Virtsahappo, palorypälehapon, kortikosteroni, sfingosiini-1-fosfaatti ja säädeltiin tryptofaani, glykokolaatin, heksadekaanidikarboksyylihappo, steariinihapon havaittiin mallin ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 7 ). Tämä ero aineenvaihduntatuotteiden voi merkitä niiden potentiaali suunnattu biomarkkereita erottamiselle mahahaava ja normaali toteaa. Seuranta muutokset näistä metaboliiteista voi ennustaa kehitystä mahahaava. Biomarkkerit 1, 2, 3, 4, 7, 8 laskivat käsittelyn jälkeen CA, että päinvastoin, muut biomarkkerit lisättiin. Lisäksi jotta luonnehtimaan mahahaavan vaikutuksia CA selvemmin muutokset suhteelliset pitoisuudet tavoite yksilöityjä aineenvaihduntatuotteita eri ryhmissä analysoitiin, olemme havainneet, että sisältö näiden keskeisten merkkiaineiden lähempänä normaalia ryhmään. Tulokset osoittavat mekanismi hoitoon mahahaavan voidaan saavuttaa sääntelyn näiden merkittävästi markkereita ja niiden vuorovaikutusta, kuten Fig. 8. Esimerkiksi steariinihappoa jossa vaadittiin 17FA, on suhde tapsiinihap- hapolla vaikka proteiinin Fabp1 (rasvahappo sitova proteiini 1). Verkko ei ainoastaan ​​osoittaa vuorovaikutuksen biomarkkerit, mutta antaa myös tietoja mahdollisten proteiinien geenit, entsyymit ja biologisia prosesseja. Se edistää löytö kohde esiintymisen aikana ja mahahaavahoidon ja on johtava kehittämiseen uuden lääkkeen parantaa mahahaava.

3,3 määritys mRNA-tasojen vahvistamiseksi biomarkkerit

vahvista meidän metabolomiikan havaintojen tarvitsemme molekyylitason dataa, joten tunnistimme 5 t, jotka liittyvät 4 mahdollisia biomarkkereita ja 2 metaboliareitteihin RT-PCR. Sphingolipid aineenvaihdunta, kuten S1Pr1, S1Pr3 ja SphK1 tarkasteltiin osoitti kuvassa. 8. Tulokset on koottu kuvioon. 9. mRNA taso S1Pr1, SIPr3 ja SphK1 merkittävästi voimistunut mallissa ryhmä, ekspressiotasot olivat 5,21, 2,54, 6,57 kertaa verrattuna kontrolliryhmään, joka oli samaa mieltä aiempien havaintojen ja tietojen. Jälkeen CA hoidon ekspressiotasot S1Pr1, S1Pr3 ja SphK1 palasivat perustasolle. S1P on muodostettu kahdesta kinaasien, sfingosiinikinaasin 1 ja 2 (SphK1 ja SphK2), mutta ei havaittu eroja SphK2 ilmentymisen kaikissa ryhmissä (tuloksia ei ole esitetty), tulos oli yhdenmukainen kanssa verkon havainnot. Täällä voimme selittää potentiaalinen mekanismi CA hoidettaessa mahahaava estämällä S1P lisäämällä. Olemme myös löytäneet väheni ilmaus Fabp1 ja Got2 mallissa ryhmässä (Fig. 9), verrattuna kontrolliryhmään. Mutta CA tekee ryhmät olivat lähellä kontrolliryhmään, joka vahvisti, että terapeuttinen vaikutus CA liittyi rasvahappojen aineenvaihduntaa molekyylitasolla.

3.4 Pathway Analysis

Tarkempi analyysi reittejä ja verkot vaikutteita mahahaava suoritettiin MPP. Polut saatu osoittaa taulukossa 2. Käytämme laadukkaita Kegg metaboliareitit backend tietopohjaa tunnistaa olennaisimmat reittejä, kuten sfingolipidikeramidi aineenvaihdunta, tricarboxylicacidcycle happo sykli, biotiini aineenvaihduntaa ja niin edelleen, joissa 7 ainutlaatuinen polkuja ( taulukossa 1) mallin ryhmässä tunnistettiin. Mahdolliset biomarkkerit liittyvät foolihapon aineenvaihduntaan, rasvahappojen aineenvaihduntaan, ja sfingolipidikeramidi aineenvaihdunnan reittejä myös noudatettiin. Niistä 6 erillistä aineenvaihduntatuotteiden tunnistaa näiden reittien, monet ovat eri vaiheissa etenemisestä mahahaava. Jotkut muuttunut merkittävästi metaboliittien, kuten glykokolaattia, heksadekaanidikarboksyylihappo, ja steariinihappo on löydetty ja käytetty selittämään rasvahapon mekanismi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä tavoitteen reittejä osoittavat selvästi häiriöt yli muodostumista mahahaava ja voi edistää mahahaavan.

Keskustelu

mahahaavojen ihmisillä toistuvat usein, ja vaikeus hoidettaessa niitä osoitetaan sanonta "Kun haava, aina haava" [24]. Monet tekijät voivat lisätä niiden esiintymistä mahahaava, mutta mekanismia ei ole ymmärretty selvästi. Siksi lääkehoidon tehokkuutta ei riipu ainoastaan ​​lasku haitallisia tekijöitä, mutta myös muuttuneet metaboliitteja, jotka säätelevät metaboliareittiin. Erityisesti löytö ennakoivia biomarkkereita, riski mahahaavan antaa mahdollisuuden diagnosoida ja sallia lääkehoidon ajankohtainen. QZWT käytettiin parantaa mahahaava monta vuotta Aasiassa, vaikka sen mekanismi on epäselvä. Metabolomiikka yhdistettynä monimuuttujadatalaskenta välineitä, jotka samanaikaisesti määrällisesti tuhansia aineenvaihduntatuotteiden elävän organismin käytettiin analysoimaan biomarkkereita mahahaava [25]. Lisäksi ymmärrys biomarkkerit on herättänyt uutta kiinnostusta aloilla lääkekehityksen ohjelmia ja tautien seurantaan, joka tarjoaa arvokkaita tähtäimet noin monimutkainen sairaus mekanismeista [26]. Tämä tutkimus siis suunniteltu edelleen selvittämiseksi taustalla olevan mekanismin CA mahahaavan sääntely metaboliateissä kokonaiskuvan.

malliltaan mahahaavan rotilla onnistuneesti toistettu. Plasma näytteet analysoitiin HPLC /ESI-TOF-MS: n ja monimuuttuja tilastollinen analyysi. Tulokset osoittivat, että pinta-ala haavauma ja dynaamisen metaboliaprofiilien jälkeen CA hoidon suljettiin kontrolliryhmään, joka osoittaa, että CA oli terapeuttista tehoa. Mukaan metabolomiikan analyysiin, 10 potentiaali biomarkkereita ja 7 liittyvän metaboliareitit tunnistettiin tutkimuksessamme. Merkittävästi säädeltiin D-glukoosi, lysiini, virtsahapon, palorypälehapon, kortikosteroni, sfingosiini-1-fosfaatti ja ylös säädellään tryptofaani, glykokolaatin, heksadekaanidikarboksyylihappo, steariinihapon havaittiin CA ryhmässä verrattuna mallin ryhmässä. Lisäksi foolihapon aineenvaihduntaan, rasvahappojen aineenvaihduntaan, ja sfingolipidikeramidi aineenvaihduntaa ja monet muut aineenvaihdunnan varmistettiin vaikuttaa mahahaava. Meillä on ekspression määrittämiseksi mRNA: iden, jotka liittyvät Sphingolipid aineenvaihduntaa ja rasvahappojen aineenvaihduntaa vahvistaa mekanismi. Monia muita mahdollisia proteiineja, geenejä, entsyymejä ja bioprosessi suljettu muulta väyliä tarvitsee tulevaisuudessa kokeita vahvistaa.

Analysoimalla ja todentaa varhaiskuntoutus biomarkkerit sairauden, metabolomiikan voimme paremmin ymmärtää patologisten prosessien ja aineen metaboliareitteihin . Uskomme, että biomarkkereiden ja polku analyysit on loistavat mahdollisuudet tutkia ja selventää terapeuttinen vaikutus TCM. Nykyisessä tutkimuksessa olemme tunnettu biomarkkerit vuorovaikutusta verkot sisältävät proteiineja, geenejä, entsyymien ja bioprosessi kuten on esitetty kuviossa. 8. S1P teko solun ligandina sen tiettyihin reseptoreihin-S1PRs, on nyt tunnustettu säätelijänä monia fysiologisia ja patofysiologisia prosesseja, kuten tulehdussairauksiin kuten nivelreuma, tulehduksellinen suolistosairaus, ja sepsis [27], [28]. Tulehdus, joka esiintyy limakalvon ruoansulatuskanavassa, mikä aiheuttaa maha-suolikanavan haavauma [29]. Tuloksemme osoittavat, että CA voi vähentää ilmentymistä S1P ja sen reseptoreihin, mukaan lukien S1Pr1 ja S1Pr3, lievittää tulehdusta ongelmien lievittämiseksi mahalaukun haavaumia [30]. S1P on muodostettu SphK1 ja SphK2 [31]. SphK1 voi aktiivinen NF-KB-reitin, joka käynnisti suurimpien tulehduksellinen signalointimolekyylin TNF-α. Lyhyesti, NF-KB: n ja TNF-α liittyy läheisesti muodostamiseksi ja parantaa mahahaava [32], [33]. Olemme myös havainneet, että puute SphK1 (ei SphK2) estää merkittävästi mahahaava, mikä osoittaa, että SphK1 voi olla keskeinen rooli mahahaava. Siten sfingolipidikeramidi aineenvaihdunta voi olla kannattava tavoite hoitoon mahahaavan.

Steariinihappo, glykokolaatin ja heksadekaanidikarboksyylihappo muuttunut aiheuttaa rasvahappojen aineenvaihdunnan häiriöön sulkeminen sen esiintyvyys ja kuntoutus mahahaavan [34], [35] . Rasvahapot, kuten steariinihappo jne yleisesti mielletään energialähteenä, on herättänyt kiinnostusta tutkimusta ja kansanterveydelle, koska niiden vaikutuksia ihmisen terveyteen ja sairauksiin. Rasvahapot ovat hyödyllisiä terveyttä edistäviä. Steariinihappo, glykokolaatti ja heksadekaanidikarboksyylihappo säädellään Fabp1, entsyymi rasvahapon sitovan proteiinin 1. analyysi RT-PCR: llä, alhainen ilmentyminen Fabp1 mallissa ryhmään viittaa siihen, että Fabp1 toimintaa estävä voi vähentää steariinihappo, glykokolaatti ja heksadekaanidikarboksyylihappo , ja johtaa rasvahappoaineenvaihdunta häiriö. Siksi lisääntynyt tulehdusreaktio ja mitokondrioiden ja edistää haavauman muodostumista. Kuitenkin, CA voi tasapainottaa tämä häiriö lisäämällä ilmentymistä Fabp1 [36]. Glutamiinihappo-aspartaattiaminotransferaasin 2 (Got2) on tärkeä entsyymi tricarboxylicacidcycle happo syklin (TCA cycle). Vakavasti esto TCA aiheuttama vähentynyt of Got2 edistää muodostumiseen mahahaava. Metaboliitit aminohappoja, kuten tryptofaania ja sen metaboliittien in vivo on laaja rooli tryptofaanin aineenvaihdunnassa. Tärkeintä on, että tryptofaani aineenvaihdunnan häiriöt voivat aiheuttaa TCA häiriö. TCA osansa paranemista mahahaava [37]. Down-regulation Got2 mRNA: n ekspression malli ryhmässä ja ylössäätöä in CA ryhmissä oli aiemmin osoitettu tulostamme. Kaikki nämä tiedot osoittavat selvästi, että molekyylitason mekanismi CA hoitoon mahahaavan läheisesti korreloi sen saldo vaikutuksia TCA. Nämä tulokset osoittavat CA vaikutukset voivat välittyä läpi proteiinin, entsyymit ja metaboliareittiin.

• PLoS ONE: vähäisemmälle Expression of proangiogeeninen Growth Factors and Their reseptorit Mahalaukun haavaumat kirroottisten Patients
• PLoS ONE: In vivo Antioksidantit ja Haavaumalääkityksiä aktiivisuus Parkia speciosa Etanolista lehtiuutetta vastaan ​​etanolin aiheuttamia mahahaavan Rats