PLoS ONE: Restauravimas miR-1228 * išraiška Stabdo epitelio-mezenchiminių perėjimas skrandžio vėžio

Anotacija

Dysregulated miRNAs žaisti kritinių vaidmenis kancerogenezėje ir vėžio progresavimo metu. Šioje tyrime Pasaulis-1228 * funkcija reguliuojant vėžio progresavimo buvo tiriamas skrandžio vėžio. Sumažėjęs buvo pastebėtas išraiška Pasaulis-1228 * žmogaus skrandžio vėžio audiniuose, lyginant su sveikų audinių. Vėliau miR-1228 * vaidmuo buvo įvertintas vivo
naudojant navikas svetimo modelį. Pagal šį modelį, PPN-1228 * raiškos slopino svetimo auglio susidarymą. Be to, mes parodė MIR-1228 * neigiamai reglamentuoja NF-κB veikla SGC-7901 skrandžio vėžio ląsteles ir nustatė, kad CK2A2 buvo miR-1228 tikslas *. Ląstelę Pasaulis-1228 * sumažino mezenchiminių žymenų ekspresiją ir padidino epitelio žymeklis E-cad, tai rodo galimą vaidmenį slopinant epitelio-mezenchiminių perėjimą. Apibendrinant, šios išvados suteikti pirmąją įrodymų, kad Pasaulis-1228 * vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant skrandžio vėžio augimą ir rodo, kad pasirinktinį atstatymą miR-1228 * gali būti naudingas skrandžio vėžio gydymo

nurodomoji dalis:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, ir kt. (2013) restauravimas miR-1228 * išraiška Stabdo epitelio-mezenchiminių Perėjimas skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (3): e58637. Doi: 10,1371 /journal.pone.0058637

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: Spalio 25, 2012; Priėmė: Vasario 5, 2013 m Paskelbta: Kovo 12, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Jia et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų.. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

mikro RNR (miRNAs) yra trumpas klasė ( 20-23 nukleotidų ilgio), endogeninių, viengrandės RNR, kuri reguliuoti genų ekspresiją sukelia transliacijos represijoms ar iRNR degradaciją [1], [2]. Per šiuos molekulinius mechanizmus, miRNAs turėti normalius biologines funkcijas, pavyzdžiui, reguliuojant ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir apoptozės. Be to, buvo įrodyta, dysregulated miRNAs žaisti kritinių vaidmenis reguliavimo Kancerogeninis ir vėžio progresavimo [3], [4]. Abberant miRNAs išraiška buvo pastebėta daugelio rūšių navikais, įskaitant skrandžio vėžio [5].

epitelio-mezenchiminių perėjimas (EMT) yra biologinis perprogramavimas įvykis, kuris leidžia epitelio ląstelių atlikti kelis biocheminių pokyčių įsigyti mezenchiminių ląstelių fenotipas. Nors EMT yra svarbi tinkamo embriono vystymasis, daugėja įrodymų, leidžia manyti, kad netipinė aktyvavimo EMT veda į piktybinio naviko progresavimo [6]. Įrodyta, kad EMT yra pagrindinis procesas prisideda prie vėžio vystymąsi, kuriai būdingas iš epitelio žymeklio E-cad praradimo, AN mezenchimos persekiotoją Vimentin padidėjimas, o į migracijos ir invazinę elgesį [7] padidėjimas, [8].

mūsų ankstesniame tyrime, analizuojant Mirna masyvas kasos vėžiu srityse, PPN-1228 * buvo nustatyta kaip viena iš vėžio susijusių miRNAs (duomenys neparodyti). Čia mes pateikė įrodymų, kad Pasaulis-1228 * buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su sveikų audinių. Restauravimas išraiška miR-1228 * skrandžio vėžio ląstelių reikšmingai slopina ląstelių migraciją ir naviko augimą. Mechaniškai, mes parodė, kad Pasaulis-1228 * slopina NF-κB aktyvavimo ir potencialiai slopina EMT.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901 , AGS ir BGC-823 buvo įsigytas iš Biochemijos instituto ir ląstelių biologijos (Kinijos mokslų akademija). Vienas normalus skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1 buvo įsigytas iš Pekino vėžio tyrimų instituto. Šios ląstelės buvo gydomi 37 ° C temperatūroje, 5% CO2 inkubatoriuje į RPMI-1640 (SGC-7901 ir BGC-823), F-12K (AGS) arba DMEM (GES-1) vidutinio papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo [ ,,,0],9], [10].

klinikinius mėginius

Penkiasdešimt poros skrandžio vėžio ir gretimų ne vėžio audinių mėginiai buvo paimti iš pacientų, kuriems buvo atlikta chirurginė rezekcija Antrojoje filialas ligoninė, medicinos koledžo , Zhejiang universiteto. Suderintos ne vėžio gretimų audinių buvo gauti bent 5 cm nuo naviko svetainėje. Nė vienas iš pacientų buvo atlikta spindulinė terapija arba chemoterapija prieš operaciją. Audinio mėginiai buvo surinkti, prisegami užšaldomos skystame azoto, ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol naudojamas [11]. Visi audiniai buvo histologiškai patvirtinta, kad skrandžio adenokarcinoma. Tyrimas buvo patvirtintas Antrojo filialas ligoninės etikos komiteto Zhejiang universiteto medicinos koledžo. Pasirašytas informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių arba iš pacientų atstovus, jei tiesioginis sutikimas negali būti gautas.

RNR gavyba ir Realaus laiko PGR

Viso RNR buvo išskirta iš fermentuotų ląstelių arba audiniai, naudojant TRIzol (Invitrogen), ir visos RNR koncentracija buvo nustatyta. Sintezė kDNR ir realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant TaqMan MicroRNA atvirkštinės transkripcijos rinkinį (Applied BIOSYSTEMS) ir TaqMan MicroRNA Analizės rinkinį (Applied BIOSYSTEMS), atitinkamai. Realaus laiko PGR buvo atliekama ant Taikomoji Biosystems StepOnePlus ™ Realaus laiko PGR sistema pagal protokolą. Sąvoka lygis Pasaulis-1228 * buvo standartizuoti RNU6B. Realaus laiko PGR reakcijos buvo atliekami tris kartus. Santykinis išraiška miRNAs buvo apskaičiuotas naudojant lyginamąją Ct metodas [12].

Naviko Sėjimas Analizės nuogas Pelės

Moteris BALB /c athymic nuogas pelių 4 savaičių amžiaus, buvo įsigytas iš Šanchajus laboratorija gyvūnų centras (Kinijos mokslų akademija). Visos procedūros, susijusios gyvūnai buvo patvirtinti eksperimentiniais gyvūnų etikos komitetas, medicinos koledžo, Zhejiang universiteto. MIR-1228 * arba Pasaulis-NC stabili transfekciją SGC-7901 ląstelių suspensijos (2,5 × 10 ^{7 ląstelių /ml) 200 iL serumo neturinčia terpe buvo po oda švirkščiamas į nuogas pelių kraštais, atitinkamai. Naviko augimo buvo tiriama, du kartus per savaitę 5 savaites ir naviko tūris (V) buvo stebimas matuojant ilgį (L) ir pločio (W) naviko su apkabos ir apskaičiuojamas pagal formulę V = 1/2 (L × W × p) [13].}

Mobilusis migracijos

migracija gebėjimas miR-1228 * arba Pasaulis-NC stabili transfekcijos SGC-7901 ląstelių buvo aptikta naudojant Transwells (8 mm akučių dydis, Corning). Į Transwells buvo įdėti į 24-duobučių lėkštelėse. Šviežiai tripsinizuojamos ir plauti ląstelės buvo sustabdytas 100 iL serumo neturinčioje RPMI1640 sudėtyje yra 1% vaisiaus galvijų serumo. Apie 1 × 10 ^{5 ląstelių /gerai buvo dedamas į viršų kameroje kiekvieno įdėklu. 200 įxL RPMI1640 sudėtyje yra 20% vaisiaus jaučio serumo buvo įtraukta į apatines rūmams. Po to, kai inkubavimą 24-48 h, esant 37 ° C temperatūroje, 5% CO _{2 temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje, ląstelės buvo nustatyti su 95% absoliučiojo alkoholio ir nudažomi su violetinei [14]. Taip pat vidiniame kameros ląstelės buvo pašalintas su medvilnės tamponu ir prie apatinės pusės į membranos ląstelės buvo skaičiuojamas ir nufotografuotas pagal apversto mikroskopu, kurio × 200 priartinimas per penkių atsitiktinių laukų į kiekvieną šulinėlį. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}}

Vakarų dėmė

Iš viso baltymai buvo matuojamas naudojant BCA rinkinį (Pierce) pagal gamintojo protokolą. Klasifikuojamos ląstelių baltymai buvo Frakcionuotas elektroforezės būdu dėl 12% SDS poliakrilamido gelio ir elektromagnetinių-pernešama ant nitroceliuliozės (NC) membranų 2,5 valandos 200 V. NC membranų buvo inkubuojamos su blokuojančiu buferiu 1 valandą kambario temperatūroje, o po to per naktį gydymo su pirminiais antikūnais 4 ° C temperatūroje, ir tada su HRP-konjuguoto antrinio antikūno (MBL). Išplovus, reaktyviąją juostos buvo aptiktas naudojant ECL Vakarų dėmė aptikimo rinkinį (MILLIPORE) pagal gamintojo instrukcijas. Antikūnai naudojami šiame eksperimente buvo triušis monokloninis anti-E-cad (Epitomics), anti-Vimentin (Epitomics), anti-β-kateninai (Epitomics), anti-sraigė (Mobilusis signalizacijos), anti-slunkius (Mobilusis signalizacijos), anti -ZEB1 (Mobilusis signalizacijos), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) ir pelės anti-GAPDH (KangChen Biotech ").

imunohistocheminis

Parafino skyriai, 3- mkm storio, kepdavo 2 h esant 60 ° C ir deparaffinized. Antigenas paieška buvo atlikta naudojant citrato natrio buferio (pH 7.2), esant 95 ° C temperatūroje 15 minučių ir tada skaidres buvo atšaldytas iki kambario temperatūroje 30 minučių. Po to, kai gydomas su 3% vandenilio peroksido 15 minučių, kad blokuoti endogeninę peroksidaze, sekcijos buvo gydomi normalus ožkos serumas, gebančiais skysčio 30 minučių, kad sumažinti nespecifinį ir tada triušis polikloninis Anti-E-cad (Santa Cruz) arba triušis monokloninis anti-Vimentin (Epitomics) buvo inkubavome skyrius 12 valandų, esant 4 ° C temperatūroje. Po to, kai rewarming 1 h ir plovimo 5 kartus, dalys buvo inkubuotos su antriniais antikūnais 30 minučių kambario temperatūroje. Diaminobenzidinas buvo naudojamas spalvų reakcijas.

plazmidžių Statybos ir Mobilusis transfekcijq

Mir-1228 * ekspresijos vektorius (MIR-1228 *) arba neigiama kontrolė (MIR-NC) buvo apskaičiuota klonavimas atkaitintas oligonukleotidai kad pateiktos optimizuotas Pasaulis-1228 * kamieninių kilpa (nukleotidai buvo sukurta kaip: viršuje kryptis, 5'-TGC TGG TGG GCG ggg GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA KTG AKTAS GAA ŠMC PPK BMK BMK CGC CCA, C-3 ";. apačioje kryptis, 5'-BMT GGT ggg CGG ggg GGT GTG TGG TBS GTC AGT GGC CAA AAC ŠMC PPK BMT Persijos BMK Persijos ŠMC, C-3 ") arba neigiama kontrolė kamieninių kilpa į pcDNA6.2-GW /EmGFP vektoriaus ( Invitrogen) [15]. 2-KB Pasaulis-1228 * rengėjas regionas buvo papildyta (Gruntai buvo sukurta kaip: pirmyn, 5'-ATC TAG GGT ACC BTK AKTAS TGG AG CCA CAC "AGA-3"; anuliuotos, 5'-VPK TGA AGA TCT ACC TBS AGA GTT ggg GTG TG-3 "). ir coloned į pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], vadinamas pGL3-Pasaulis-1228 * -promoter. Tuščia pGL3-Enhancer "Vektorius veikė kaip neigiamos kontrolės (pGL3 kontrolės). Mir-1228 * tikslinė regionas CK2A2 3'UTR seka buvo chemiškai susintetinti Šanchajus Biotech ir įterpiamas pasroviui pMIR-ataskaitos liuciferazės plazmidės (Applied Biosystems), vadinamas pMIR-CK2A2. PReceiver-C-ed ORF klonas su GFP-žyma buvo įsigytas iš GeneCopoeia. Generuoti stabilias Transfekuoti ląsteles, Mir-1228 * ir Pasaulis-NC ekspresijos konstruktas buvo pernešta į SGC-7901 ląstelių linijos, naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Po 48 valandų, blasticidin (14 mikrogramų /ml) buvo įtraukta į terpėje. PGL3-Pasaulis-1228 * -promoter /kontrolė, GFP-C-ed /kontrolė, pMIR-CK2A2 /kontrolė arba NF-κB reporteris vektorius (Promega) buvo laikinai perkeltų į SGC-7901 ląstelių naudojant Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) buvo naudojamas kaip vidaus normalizuoti [17].

liuciferazės reporterio testą

liuciferazės reporterio testą buvo atliktas SGC-7901 ląstelių. Ląstelės plaunamos PBS du kartus ir lyzed Passive lizės buferiniame tirpale (Promega) ir liuciferazės veikla buvo matuojamas nuo 20 iL lizate naudojant dvejopo liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA) ant GloMax 20/20 luminometer (PROMEGA). Visi duomenys buvo gauti vidutiniškai rezultatus iš ne mažiau kaip trijų nepriklausomų kartojasi.

Statistinė analizė

Skirtumai tarp ekspresijos lygmenis Mir-1228 * skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo nustatomas pagal Vilkoksono prisijungę rank testas. Klinikinių tyrimų duomenys buvo analizuojami naudojant chi kvadrato testas. Stjudento t-testas ir ANOVA dirbo analizuoti in vitro, parsisiųsti ir vivo
duomenis. Viskas, P
vertės buvo dvipusis ir skirtumai buvo nustatyti statistiškai reikšmingi P pervežimas < 0,05. Rezultatai buvo analizuojami naudojant SPSS V.16.0 programinė įranga (SPSS Inc). * P < 0,05, ** p < 0,01.

Rezultatai

Pasaulis-1228 * dažnai žemyn reguliuojama žmogiškųjų skrandžio vėžys

Pirmiausia, siekiant nustatyti, ar Mir-1228 * yra skirtingai išreikštas žmogaus pirminės skrandžio vėžio pasakymas lygis brandus Pasaulis-1228 * buvo tiriama naudojant TaqMan realaus laiko PGR 50 porų žmogaus skrandžio vėžio audiniuose ir poros atitikimo gretimų noncancerous skrandžio audinius. Mūsų rezultatai parodė, kad išraiška lygis Pasaulis-1228 * reikšmingai sumažėjo skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su gretimų noncancerous skrandžio audinių (pav. 1A). Apie 72% navikų mėginiuose buvo mažesnis išreikštas su miR-1228 * (1B pav.). Naudojant 2 ^{-ΔΔCT vertybes, PPN-1228 * <kartų kaita; 1,0 buvo laikomas žemu, o tai > 1,0 buvo laikomas aukštos raiškos [18]. Pasaulis-1228 * išraiška buvo taip pat vertinamas skrandžio vėžio ląstelių linijų ir vienas įamžinta normalų skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos (GES-1). Kaip parodyta Fig. 1C, PPN-1228 * žymiai buvo mažas išraiška visose vėžio ląstelių linijų, palyginti su GES-1. Kartu paėmus, šie rezultatai suteiks tvirtą įrodymų, kad Pasaulis-1228 * buvo žemyn reguliuojama skrandžio vėžio.}

Be to, PPN-1228 * išraiška buvo įvertintas atsižvelgiant į klinikos ypatybių pacientams. Visi pacientai neturėjo toli metastazių ir visi audiniai, buvo histologiškai patvirtinta skrandžio adenokarcinomos. Visais atvejais (n = 50) buvo suskirstyti į grupes į dvi grupes: miR-1228 * mažas išraiška (n = 36) ir miR-1228 * aukštos išraiška (n = 14). Mir-1228 * mažai išraiška grupė turėjo polinkius į didesnius naviko dydžio. Tačiau nebuvo jokių reikšmingų ryšių tarp Mir-1228 * išraiška ir kitų clinicopathologic funkcijų, tokių kaip amžius, lytis, histologinio tipo ar TNM etape (1 lentelė).

Padidėjęs Pasaulis-1228 * išraiška Stabdo ksenografiniuose navikų susidarymo

norint įvertinti funkcinį vaidmenį PPN-1228 * skrandžio vėžio, optimizuotas Pasaulis-1228 * kamieninių kilpa buvo klonuotas į pcDNA6.2-GW /EmGFP vektorių. Skrandžio ląstelių linija SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su pcDNA6.2-GW /EmGFP-Pasaulis-1228 * arba pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektoriaus ir stabili ląstelių linijų buvo sukurtas ir pavadintas Pasaulis-1228 * arba Pasaulis-NC, atitinkamai. Kaip ir tikėtasi, AT-PGR analizė parodė, kad Pasaulis-1228 * stabilios ląstelės turėjo brandžios miR-1228 * ekspresijos padidėjimas lyginant miR-NC stabilių ląstelių (Pav. 2a). Nebuvo morfologinis pokytis Pasaulis-1228 * stabilios-perkeltų ląstelių, lyginant su nontransfected ląsteles. SGC-7901 ląstelių su arba be transfekciją PPN-1228 * buvo implantuoti po oda į nuogas pelių kraštais įvertinti galimą poveikį PPN-1228 * skrandžio vėžio augimo vivo
. Raiškos miR-1228 * reikšmingai slopino naviko augimą (2B pav.). Iki eksperimento vykdymo laikotarpiui, dydis ir drėgno produkto svorio navikų su miR-1228 * raiškos buvo žymiai mažesnis ir mažesnis negu kontrolinės grupės (pav. 2C-D). Taigi, duomenys rodo, kad Pasaulis-1228 * slopina svetimo naviko augimą skrandžio vėžio ląstelių in vivo
.

NF-κB aktyvinimas yra atsakinga už Žemutinės raiškos PPN-1228 * skrandžio Vėžys

Naujausi darbai parodė, kad dauguma miRNAs turi transkripcijos faktorius (TF) Privalomoji svetaines ir daug tyrimų, pranešė, kad miRNAs gali būti reguliuojamas TFS [19]. Čia mes naudojami bioinformatikos programos (Rėmėjas 2,0 ir P-rungtynės) nustatyti galimus reguliatoriai Mirna-1228 * [16], [17]. Mes nustatėme, trys, C-ed privalomas domenų 2-kb miR-1228 * rengėjas regionas (pav. 3A). Nuo C-ed subvieneto yra NF-κB šeimos ir hiperaktyvaciją NF-κB veiklos dalyvis buvo įrodyta, kad būti susijęs su skrandžio vėžiu [20], [21]. Mes iškėlė hipotezę, kad NF-κB aktyvacijos priskiriama PPN-1228 * skrandžio vėžio downregulation.

Norėdami įrodyti savo hipotezę, mes sukūrėme liuciferazės statyti su miR-1228 * rengėjas regiono ir įvertinti savo veiklą atsako į NF-κB aktyvacijos. Eksperimentas buvo atliktas kultivuojant SGC-7901 ląsteles 8 valandų, TNF-alfa (50 arba 100 ng /ml, klasikinis NF-κB kelias aktyvatoriaus) ir /arba pirolidino Ditiokarbamato (PDTC, 100 pM) buvimą, plačiai naudojamas inhibitorius transkripcijos faktoriaus NF-κB [22]. SGC-7901 ląstelės buvo pernešta su pGL3-miR-1228 * -promoter arba pGL3-kontrolė, po 24 valandų, transfekuota SGC-7901 ląstelės buvo veikiamos 8 valandas TNF-alfa su arba be PDTC ištirti, ar NF-κB aktyvacijos reguliuoja Pasaulis-1228 * rengėjas veikla. Mes pastebėjo, kad TNF-alfa gydymą ženkliai slopina Pasaulis-1228 * rengėjas veikla ir slopinimas NF-κB su PDTC išvengti TNF-alfa-tarpininkaujant downregulation apie aktyvumą (3b pav.), O tai rodo, kad NF-κB gali neigiamai reguliuoti miR- 1228 * išraiška. Toliau nustatyti, ar NF-κB subvieneto C-ed yra atsakingas už liberalizavimo Pasaulis-1228 *, mes perkeltų SGC-7901 ląstelių Pasaulis-1228 * -promoter su arba be GFP-C-Rel ir stebėjo labai sumažėjo liuciferazės veiklos GFP -c-ed grupė nei kontrolės (3C pav.). Apibendrinant, duomenys rodo, kad NF-κB subvienetų C-ed funkciškai prisideda prie PPN-1228 * downregulation skrandžio vėžio.

Pasaulis-1228 * Stabdo NF-κB Veikla ir CK2A2 raiška SGC-7901

siekiant ištirti PPN-1228 įtaką * remiantis NF-κB signalinio kelio NF-κB Reporter konstruktai buvo pernešta į vieną miR-1228 * arba Pasaulis-NC stabili perkeltų SGC-7901 ląsteles ir veiklos NF-κB liuciferazės buvo nustatomas po 48 valandų. Mūsų rezultatai parodė, kad NF-κB veikla buvo gerokai sumažėjo raiškos PPN-1228 * (. 4A pav), nurodant neigiamo grįžtamojo ryšio tarp miR-1228 * išraiška ir NF-κB veikla. Toliau nustatyti tolesnius tikslus PPN-1228 * in NF-κB keliu, mes atliekame bioinformatikos analizę ir nustatė, CK2A2 buvo vienas iš tariamų tikslinių genų, kurie buvo prognozuojama. Naudojant Miranda RNA22 [23], [24], mes įsikūrę vienas potencialus prijungimo vietą Mir-1228 * ties CK2A2 (4B pav.) 3'UTR srities. CK2A2 yra vienas dalinys baltymų kinazės CK2 kuris dalyvauja NF-κB keliu [25], [26], ir buvo pastebėtas jos išraiška turi būti iki reguliuojama keliomis vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [27], [28]. Daugiau tyrimai tarp CK2A2 ir miR-1228 kartu * parodė, kad baltymų lygiai CK2A2 buvo kartu žemyn reguliuojama ant Pasaulis-1228 * stabilios raiškos ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių (pav. 4c). Siekiant patikrinti, ar CK2A2 yra tiesa tikslas Pasaulis-1228 * A iš CK2A2 3'UTR srities segmentas, kuriame yra privalomas svetainė buvo klonuotas į liuciferazės geno 3'UTR srities į pMIR-ataskaitos plazmidžių [29]. Fluorescencinis intensyvumas reporterio geno buvo žymiai sumažėjo grupės, kuri buvo bendrai transfekuota su pMIR-CK2A2 ir miR-1228 * lyginant su kontrole (pav. 4d). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-1228 * sąveikauja su CK2A2 iRNR 3'UTR srities.

Pasaulis-1228 * Slopina EMT

Buvo pranešta, kad aktyvacija NF-κB vaidina svarbų vaidmenį EMT už vėžio progresavimo [30], [31], ir slopinamas NF-κB veiklos tikrų vėžinių ląstelių linijų sukėlė EMT pasikeitimams [32]. Nuo miR-1228 * atrodo neigiamai reguliuoja NF-κB veikla, todėl mes ištirti, jei Pasaulis-1228 * taip pat gali neigiamai reguliuoti EMT skrandžio vėžio. Vakarų dėmė parodė, kad padidėjusi miR-1228 * in SGC-7901 ląstelių žemyn reguliuojamos mezenchiminių žymekliai (Vimentin, β-kateninai, sraigė, šliužas, ir ir ZEB1 /2), o iki reguliuojama epitelio žymeklis El cad (Pav. 5A ). Be to, miR-1228 * raiškos sukėlė ląstelių migracija sumažėjimą (pav. 5B-C). Imunohistocheminį dažymo dirbo toliau patvirtina EMT susijusios baltymų pokyčius PPN-1228 * Transfekuoti SGC-7901 ląstelės ksenografiniuose modelį. Ji buvo parodyta, kad Vimentin išraiška sumažėjo, o E-cad išraiška padidėjo, palyginti su kurios kontrolinių ląstelių (pav. 5D). Panašius išvados buvo pastebėtas kitoje skrandžio vėžys ląstelių linijos AGS (pav. S1). Duomenys pateikti pirmąjį įrodymų, kad Pasaulis-1228 * restauravimas skrandžio vėžio neigiamai reguliuoja EMT.

Diskusijos

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia piktybinių navikų pasaulyje ir šiuo metu yra antra pagrindinė priežastis vėžys siejamas gaišimas [33], [34]. Nors dabartinė praktika, kuri sujungia chemoterapija arba radioterapija su chirurgine rezekcija žymiai išaugo bendras išgyvenamumas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, bendras 5 metų išgyvenamumas yra vis dar maža. Skrandžio Kancerogeninis laikomas daugiaveiksnė ir daugiapakopį procesą, kuris apima onkogenų aktyvinimą ir naviko slopintuvas genų nukenksminimą [35].

miRNAs yra endogeninė ne baltymų kodavimo trumpus RNR, kurie vaidina svarbų vaidmenį ląstelių fiziologija, plėtra, ir ligų, neigiamai reguliuoti genų ekspresiją. Analizė Mirna ekspresijos profilius parodė, kad daug miRNAs yra nenormaliai išreiškė ir koreliuoja su Tumorigenesis, progresavimo, ir prognoze įvairių hematologinių ir solidinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio [36]. Nustatyti ir išaiškinti biologinius funkcijas miRNAs dereguliavimo skrandžio vėžio gali padėti mums geriau suprasti šios mirtinos ligos patogenezę ir suteikia naujų galimybių plėtoti Mirna terapiją. Pavyzdžiui, PPN-221 ir Pasaulis-222 buvo įrodyta, kad būti teigiamai reguliuojant skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir invazija, tai rodo, kad pasirinkite slopinimas tų miRNAs būti naudingas skrandžio vėžio gydymo [37]. miRNAs vaidinti vaidmenį etiologijos ir patogenezės įvairių vėžio nukreipiant onkogenų ar naviko slopintuvai genų skaičių. Pasaulis-21 ekspresija H. pylori užsikrėtę skrandžio gleivinės ir skrandžio vėžio audiniuose. Vykdomas išraiška miR-21 padidina skrandžio vėžio ląstelių invazyvumas, RECK yra tiesioginis taikinys miR-21 [38]. Pasaulis-218 slopina invazija ir metastazes skrandžio vėžio nukreipiant Robo1 receptorių [39]. Ueda ir kt [40] nustatė 22 iki reguliuojama ir 13 žemyn reguliuojamos miRNAs skrandžio vėžiu, lyginant su naviko gleivinės, žemos raiškos atvangos 7g ir miR-433 ir aukštos raiškos PPN-214 buvo susiję su nepalankia baigtimi bendras išlikimo nepriklauso nuo klinikinių kintamųjų, įskaitant gylio invazijos, limfos-mazgo metastazėmis ir stadijos. Pasaulis-375 yra dažnai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ir veikti kaip naviko slopintuvas reguliuoti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją potencialiai nukreipiant JAK2 onkogeną [10]. Mūsų kitas tyrimas parodė, Pasaulis-1228 * buvo vienas epitelio vėžys susijusių Mirna (nepublikuotą). Tačiau buvo pranešta tik keletą tyrimai PPN-1228 *. Guled ir kt [41] parodė, kad Pasaulis-1228 * buvo labai išreikštas piktybinių mezoteliomą mėginių, palyginti su normaliomis pavyzdžius. Tačiau biologinės funkcijos šio Mirna dar nebuvo įvertintas. Šioje studijoje, mes nustatė, kad Pasaulis-1228 * buvo žemyn reguliuojama daugiau nei 70% skrandžio vėžio mėginių, palyginti su jų nontumor kolegomis ir teikti eksperimentinę įrodymų, kad jis gali veikti kaip naviko slopintuvas per neigiamai reguliavimo EMT ir slopina NF -κB veikla.

Mūsų duomenys rodo, downregulation PPN-1228 * skrandžio vėžio audiniuose ir skrandžio vėžio ląstelių linijas. Įvairūs molekulinius mechanizmus sukelti Mirna disreguliacija, pavyzdžiui, genetinės mutacijos, epigenetinio aberacijos ir nereguliuojamos transkripcijos veiklos [42]. TFS gali reguliuoti Mirna išraišką, prisijungdamas prie promotoriaus regionuose, arba fiziologinių ar patologinių kontekstuose [43]. Ištirti, kaip Pasaulis-1228 * buvo liberalizuotas skrandžio vėžio, mes analizavo 2-kb promotoriaus regione prieš srovę Mir-1228 * ir rado tris spėjamus C-REL privalomus domenus. Nors NF-κB yra geriausiai žinomas už savo transkripcijos aktyvavimo funkcija, neseniai darbą su 65 psl, RelB ir C-ed parodė, kad NF-κB gali žemyn reguliuoti konkrečius genus [17], [44], [45]. Naudojant MIR-1228 * rengėjas-reporteris konstrukto pateikta 2-kb fragmentų Mir-1228 * promotoriaus, mes nustatėme, kad NF-κB kelias aktyvatorius TNF-α sumažėjo Pasaulis-1228 * promotoriaus aktyvumą. Ir NF-κB inhibitorius PDTC nepaprastai slopinti TNF-α-tarpininkaujant MIR-1228 * rengėjas mažo aktyvumo. Mūsų duomenys taip pat parodė, kad C-ed galėjo tiesiogiai jungiasi su Pasaulis-1228 * promotoriaus ir neigiamai reguliuoti savo išraišką. Nuo C-ed subvieneto yra NF-κB šeimos narys, NF-κB aktyvacijos phenocopied C-Rel poveikį reguliuojant Pasaulis-1228 * išraiška, o tai rodo, kad NF-κB kelias buvo neigiamai dalyvauja PPN-1228 downregulation * skrandžio vėžio. Be to, PPN-1228 * raiška taip pat lėmė NF-κB veiklos downregulation. Todėl, mūsų duomenys išdėstyti dvigubą neigiamą grįžtamąjį ryšį tarp NF-κB ir miR-1228 *. Tikslus mechanizmas, kaip tai neigiamas grįžtamasis ryšys atsiranda, reikia tirti toliau.

CK2A2 yra vienas subvieneto baltymų kinazės CK2, kuris yra labai užkonservuoti ir visur baltymų serino /treonino kinazės. Padidėjusi CK2 buvo pastebėtas vėžio, įskaitant tuos, kurie iš pieno liaukų, prostatos, inkstų, plaučių, galvos ir kaklo ir pilvo [27], [46]. Padidėjusi CK2 į pieno liaukų transgeninių pelių sukelia hiperplazija ir displazija, kad galiausiai bus adenokarcinomos [47]. CK2 buvo ekspresija galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma linijų ir audiniuose. Nokdaunas iš CK2 padalinių diferencijuotai slopino IκBα skilimo NF-κB atominės lokalizavimo, fosforilinimo, DNR privalomas ir žurnalistė veiklos [25]. CK2 vaidina svarbų vaidmenį savo-2 /neu signalizacijos, skatinti IκB degradaciją ir NF-κB aktyvacijos [26]. Šiame tyrime, mes parodė, kad miR-1228 * sumažino CK2A2 išraiška tuo baltymų lygiu. Liuciferazės tyrimas su reporteriu, kuriame Mir-1228 * privalomą seka ne iš CK2A2 mRNR 3'UTR srities pasiūlė, kad Pasaulis-1228 * tiesiogiai nukreiptas į CK2A2 3'UTR. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad NF-κB veiklos slopinimas miR-1228 * gali būti per orientacija CK2A2 išraiška. EMT yra dabar visi žinoma, kad pasireikšti ligų, įskaitant vėžio progresavimo įvairovė. Jis pripažino, kad EMT yra svarbus procesas suformuoti Difuzinis histologijos ir inicijuoti metastazių didinant vėžinių ląstelių [48] motoriką. EMT reglamentuoja skirtingų onkogeniniam signaliniu keliu, pavyzdžiui, AKT ir NF-κB [49], [50]. Tiksliau, aktyvavimo NF-κB buvo įrodyta, kad skatinti EMT o slopinimas NF-κB veiklos mezenchimos ląstelės sukelia EMT pasikeitimams [30]. Praradimas El cad saviraiškos ir pelnas vimentin išraiška yra laikoma svarbiausia molekuliniai žymenys EMT [51]. TFS, pavyzdžiui, sraigė, šliužas, ir ZEB1 ir ZEB2, buvo įrodyta, kad labai svarbų vaidmenį. miRNAs turėti pagrindinius vaidmenis reguliuojant EMT procesą. Mir-200 šeima ir Pasaulis-205 reguliuoti EMT nukreipiant ZEB1 ir ZEB2, kuri veiktų kaip transkripcijos repressors E-cad išraiška, taip sumažinant vėžinių ląstelių agresyvumą [52]. Stabilus išraiška miR-155 žymiai slopina ląsteles nuo išgyvena EMT ir slopina genų, susijusių su EMT indukcijos [53] skaičius išraiška. Padidėjusi CK2 dalyvavo kancerogenezėje ir plėtros kolorektalinio vėžio per reguliavimo EMT susijusių genų [54]. Aktyvinimas CK2 ir C-Rel skatina EMT per arilo angliavandenilių receptorių ir slunkius signalinio kelio [55]. Mūsų tyrimo duomenimis, restauravimas miR-1228 * slopino EMT fenotipą ir sumažinta skrandžio vėžio ląstelių migraciją, tai galbūt atributas PPN-1228 * sąlygojamą downregulation NF-κB veiklos ir per orientacija CK2A2 išraiška.

Šis darbas identifikuoja MIR-1228 * kaip neigiamas reguliatorius NF-κB veiklos ir pabrėžia savo vaidmenį malšinant EMT ir skrandžio vėžio augimą, rodo, kad selektyvus restauravimas Pasaulis-1228 * gali būti naudingas skrandžio vėžio gydymo.

Parama Informacija
S1 paveiksle.
Poveikis miR-1228 * ant EMT į AGS ląsteles. (A), Vakarų dėmė analizė epitelio žymeklio E-cad ir mezenchimos persekiotoją Vimentin į miR-1228 * stabilios perkeltų AGS ląstelių ir kontrolė. (B), Transwell migracijos tyrimas parodė, kad AGS ląstelės stabili perkeltų su miR-1228 * turėjo mažesnės migracijos potencialą palyginti su miR-NC (× 100)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0058637.s001
( IOA)

Padėka

autoriai dėkoja dr Yongliang Zhu Second filialas ligoninės Zhejiang universiteto medicinos koledžo techninei pagalbai.

• PLoS ONE: Padidėjusi CD151 prognozuoja prognozę pacientams, sergantiems rezekcijos skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Geresnis priešvėžiniai veikla nanodalelių albuminu sujungto Paklitakselis eksperimentinėmis Skrandžio Cancer