Абстрактный
<р> дизрегуляции микроРНК играют важную роль в процессе канцерогенеза и прогрессии рака. В настоящем исследовании, функция микроРНК-1228 * в прогрессии рака регулирующего был исследован при раке желудка. Снижение экспрессии микроРНК-1228 * наблюдалось в человеческих раковых тканей желудка по сравнению с нормальными тканями. Впоследствии роль микроРНК-1228 * оценивали <ЕМ> В естественных условиях
с использованием модели опухоли ксенотрансплантата. В этой модели, микроРНК-1228 * избыточная экспрессия подавляется образование опухолей ксенотрансплантата. Кроме того, мы продемонстрировали MIR-1228 * отрицательно регулируемая активность NF-kB в SGC-7901 рака желудка клеток и обнаружили, что CK2A2 был мишенью MIR-1228 *. Положительная регуляция микроРНК-1228 * снижало экспрессию маркеров мезенхимальных и увеличение эпителиальной маркер E-кадгерин, предполагая его потенциальную роль в подавлении эпителиально-мезенхимальных перехода. В совокупности эти результаты обеспечивают первые доказательства того, что микроРНК-1228 * играет важную роль в регуляции желудка рост рака и предполагают, что избирательное восстановление MIR-1228 * может быть полезным для терапии рака желудка
<р> Цитирование:. Цзя L , Ву J, L Чжан, Чэнь J, D Чжун, Сюй S, и др. (2013) Восстановление MIR-1228 * Expression Подавляет Эпителиальные-мезенхимальных перехода в рака желудка. PLoS ONE 8 (3): e58637. DOI: 10.1371 /journal.pone.0058637
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, Япония
<р> поступила: 25 октября 2012 года; Принято: Февраль 5, 2013 года; Опубликовано: 12 марта 2013
<р> Copyright: © 2013 Цзя и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс коротких ( 20-23 нуклеотидов в длину), эндогенные, одноцепочечной РНК, которые регулируют экспрессию генов, вызывая трансляционной репрессии или мРНК деградации [1], [2]. С помощью этих молекулярных механизмов, микроРНК обладают нормальной биологической функции, такие как регулирование пролиферации клеток, дифференцировки и апоптоза. Кроме того, микроРНК Нарушение регуляции было показано, играют важную роль в регуляции канцерогенеза и опухолевой прогрессии [3], [4]. Выражение Abberant микроРНК были обнаружены во многих видах злокачественных опухолей, включая рак желудка [5].
<р> Эпителиальные-мезенхимальных перехода (EMT) является биологическое событие перепрограммирование, которое позволяет эпителиальные клетки пройти несколько биохимических изменений, чтобы приобрести мезенхимальных клетки фенотип. В то время как ЕМТ имеет решающее значение для соответствующего эмбрионального развития, все больше доказательств свидетельствует о том, что аномальным активации EMT приводит к прогрессии злокачественных опухолей [6]. Было показано, что ЕМТ является ключевым процессом способствующим развитию рака, характеризуется потерей эпителиального маркера Е-кадгерина, увеличение мезенхимального маркера Виментин, и увеличение проходных и инвазивного поведения [7], [8].
<р> В нашем предыдущем исследовании, на основе анализа массива микроРНК панкреатических раковых сфер, микроРНК-1228 * был найден, как один из связанных с раком микроРНК (данные не показаны). Здесь мы представили доказательства, что микроРНК-1228 * подавлялась в желудочном раковых тканях по сравнению с нормальными тканями. Восстановление экспрессии микроРНК-1228 * в клетках рака желудка значительно ингибирует миграцию клеток и рост опухоли. Механически, мы показали, что микроРНК-1228 * ингибирует активацию NF-кВ и потенциально подавляет EMT.
Культура клеток
<р> человека линии клеток желудка SGC-7901 , АГС и КУП-823 были приобретены из Института биохимии и клеточной биологии (китайской академии наук). Один нормальный желудка эпителиальных клеток линии ГЭС-1 был приобретен у Пекинского института по исследованию рака. Эти клетки выдерживали при 37 ° С в инкубаторе с 5% СО2 в среде RPMI-1640 (СГК-7901 и КУП-823), F-12K (АГС) или DMEM (ГЭС-1), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки [ ,,,0],9], [10].
Клинические образцы
<р> Пятьдесят пар рака желудка и прилегающих к нему образцов ткани нераковых были получены у пациентов, перенесших хирургическую резекцию на второй филиал больницы, медицинский колледж , Zhejiang University. Согласованные неонкологические прилегающие ткани были получены по меньшей мере, в 5 см от опухоли. Ни один из пациентов не подверглись лучевой терапии или химиотерапии до операции. Образцы ткани были собраны, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования [11]. Все ткани гистологически подтверждено, что желудочные аденокарциномы. Исследование было одобрено второй филиал больницы комитетом по этике Чжэцзян университетского колледжа медицины путем. Подписанное информированное согласие было получено от всех участников или от представителей пациентов, если прямое согласие не может быть получено.
Женский BALB /с бестимусных голых мышей в возрасте 4-х недель были приобретены у Шанхайский лабораторный центр для животных (Китайская академия наук). Все процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по этике экспериментального животного, медицинский колледж, Чжэцзян университета им. MIR-1228 * или микроРНК-NC стабильной трансфекции SGC-7901 клетки суспензии (2,5 × 10 7 клеток /мл) в 200 мкл бессывороточной среды вводили подкожно в бок голых мышей, соответственно. Рост опухоли исследовали два раза в неделю в течение 5 недель, а объем опухоли (V) контролировали путем измерения длины (L) и ширина (W) опухоли с суппортами и вычисляется по формуле V = 1/2 (L × W × W) [13]. миграция клеток Immunohistochemistry Парафиновые срезы, 3- мкм в толщину, обжигали в течение 2 ч при температуре 60 ° C и депарафинировали. Антиген поиска проводили с использованием цитратного буфера натрия (рН 7,2) при 95 ° С в течение 15 минут, а затем Срезы охлаждают при комнатной температуре в течение 30 минут. После обработки 3% раствором перекиси водорода в течение 15 минут, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали нормальной козьей сыворотки удерживающего жидкость в течение 30 минут, чтобы уменьшить неспецифическое связывание и затем кроличьи поликлональные анти-Е-кадгерина (Santa Cruz) или кролика моноклональное анти-Виментин (Epitomics) инкубировали секции в течение 12 ч при температуре 4 ° с. После согревания в течение 1 ч и промывки в течение 5 раз, срезы инкубировали с вторичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Диаминобензидин был использован для цветных реакций. люциферазы анализ микроРНК-1228 * часто вниз регулируется в рака желудка человека для того чтобы исследовать влияние MIR-1228 * на сигнализации NF-kB пути, NF-kB репортерные конструкции трансфицировали в любом MIR-1228 * или микроРНК-NC устойчиво трансфицировали SGC-7901 клеток и активность NF-kB люциферазы определяли через 48 часов. Наши результаты показали, что активность NF-kB была значительно снизилась сверхэкспрессией микроРНК-1228 * (рис. 4, а), что указывает на отрицательную обратную связь между микроРНК-1228 * экспрессии и активности NF-kB. Для дальнейшей идентификации вниз по течению целей микроРНК-1228 * в пути NF-kB, мы провели анализ биоинформатики и обнаружили CK2A2 был одним из предполагаемых генов-мишеней, которые были предсказаны. Используя Miranda и RNA22 [23], [24], мы обнаружили один потенциальный сайт связывания микроРНК-1228 * на 3'UTR из CK2A2 (рис. 4б). CK2A2 является одной субъединицей протеинкиназы СК2, который участвует в пути NF-kB [25], [26] и его экспрессия наблюдалась быть повышающей регуляции в некоторых видов рака, включая рак желудка [27], [28]. Дальнейшие исследования по взаимосвязи между CK2A2 и MIR-1228 * показали, что уровни протеина CK2A2 был одновременно вниз регулируется на MIR-1228 * стабильной избыточной экспрессии в SGC-7901 клеток (рис. 4в). Для того чтобы проверить CK2A2 является ли истинной целью микроРНК-1228 *, сегмент CK2A2 3'-UTR, содержащий сайт связывания, был клонирован в 3'-UTR гена люциферазы в pMIR-REPORT плазмиды [29]. Интенсивности флуоресценции гена-репортера была значительно снижена в группе, которая была котрансфицируют pMIR-CK2A2 и микроРНК-1228 * по сравнению с контролем (рис. 4D). Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-1228 * взаимодействует с CK2A2 мРНК 3'UTR. микроРНК являются эндогенными небелковой кодирования коротких РНК, которые играют важную роль в сотовой связи физиология, развитие и заболевания путем негативной регуляции экспрессии генов. Анализ профилей экспрессии микроРНК показали, что многие микроРНК аберрантно выражены и коррелируют с онкогенеза, прогрессии и прогноз различных гематологических и солидных опухолей, включая рак желудка [36]. Для того, чтобы определить и выяснить биологические функции микроРНК дерегулирование при раке желудка может помочь нам лучше понять патогенез этой смертельной болезни и предоставляет новые возможности для развития микроРНК основе терапии. Например, микроРНК-221 и микроРНК-222 было показано, положительно регуляции желудочной пролиферации раковых клеток и инвазии, предполагая, что выбор ингибирование этих микроРНК быть полезным для лечения раковых заболеваний желудка [37]. микроРНК играют определенную роль в этиологии и патогенезе различных видов рака путем охвата ряда онкогенов или генов супрессоров опухолей. микроРНК-21 гиперэкспрессируется в H. Pylori-инфицированной слизистой оболочки желудка и желудочных раковых тканей. Принудительная экспрессия микроРНК-21 увеличивает инвазивность клеток рака желудка, RECK является прямой мишенью MIR-21 [38]. микроРНК-218 ингибирует инвазию и метастазирование рака желудка путем воздействия на рецептор Robo1 [39]. Уэда и др [40] идентифицировали 22 до регулируемых и 13 вниз регулируется микроРНК при раке желудка против слизистой оболочки неопухолевой низкая экспрессия LET-7g и MIR-433 и высокой экспрессии микроРНК-214 были связаны с неблагоприятным исходом в целом выживание зависит от клинических ковариатами, включая глубину вторжения, лимфатических узлов, метастазирование и стадии. микроРНК-375 часто подавляется при раке желудка и функции как подавитель опухоли, чтобы регулировать пролиферацию клеток рака желудка потенциально путем воздействия на JAK2 онкоген [10]. Наше другое исследование показало микроРНК-1228 * был один эпителиального рака, связанных с микроРНК (неопубликованные). Тем не менее, было зарегистрировано лишь несколько исследования микроРНК-1228 *. Guled и др [41] показали, что микроРНК-1228 * высоко выражена в образцах злокачественных мезотелиомы по сравнению с нормальными образцами. Но биологическая функция этого микроРНК еще не была оценена. В настоящем исследовании мы определили, что микроРНК-1228 * подавлялась в более чем в 70% образцов желудочного рака по сравнению с их nontumor коллегами и представить экспериментальные доказательства того, что она может функционировать как супрессор опухоли через негативной регуляции EMT и ингибирования NF -κB активность. поддержка информация Выражение признательности авторы благодарят доктора Yongliang Чжу во Второй филиал больницы Чжэцзян университетского колледжа медицины для оказания технической помощи.
<р> миграция способность MIR-1228 * или микроРНК-NC стабильной трансфекции SGC-7901 клетки были обнаружены с помощью Transwells (8-мм размер пор, Корнинг). В Transwells были введены в 24-луночные планшеты. Свеже трипсином и промытые клетки суспендируют в 100 мкл бессывороточной RPMI 1640, содержащей 1% сыворотки плода коровы. Около 1 × 10 5 клеток /лунку помещали в верхнюю камеру каждой вставки. 200 мкл RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки добавляли в нижнюю часть камеры. После инкубации в течение 24-48 ч при 37 ° С в 5% CO <югу> 2 увлажненном инкубаторе клетки фиксировали 95% абсолютного спирта и окрашивали кристаллическим фиолетовым [14]. Клетки во внутренней камере были удалены с помощью ватного тампона, и клетки, прикрепленные к нижней стороне мембраны, были подсчитаны и получено при инвертированным микроскопом при увеличении × 200 в течение пяти случайных полей в каждую лунку. Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.
Вестерн-блот
<р> Всего белков измеряли с помощью набора ВСА (Pierce) в соответствии с протоколом производителя. Белки клеток фракционировали с помощью электрофореза в 12% ПААГ в полиакриламидном геле и электромеханических блоттинг на нитроцеллюлозных (NC) мембраны в течение 2,5 ч при температуре 200 мембран В. ЧПУ, инкубировали с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи лечения с первичным антителом при 4 ° с, а затем с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичного антитела (MBL). После промывки, реактивные полосы были обнаружены с использованием набора для обнаружения блот ECL Western (Millipore) в соответствии с инструкциями изготовителя. Антитела, используемые в этом эксперименте, были кролика моноклональное анти-Е-кадгерин (Epitomics), анти-Виментин (Epitomics), анти-β-катенин (Epitomics), анти-улитка (Cell Signaling), анти-Слаг (Cell Signaling), анти -ZEB1 (Cell Signaling), анти-ZEB2 (Santa Cruz), анти-CK2A2 (Santa Cruz) и мышиное анти-GAPDH (KangChen Biotech).
Плазмида Строительство и Cell Трансфекция
<р> микроРНК-1228 * выражение вектор (MIR-1228 *) или отрицательный контроль (MIR-NC) был построен путем клонирования отожженные олигонуклеотиды, которые содержали оптимизированный микроРНК-1228 * стволовую петлю (олигонуклеотиды были сконструированы как: верхней нити, 5'-ТГК TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG ТТТ TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC ССА C-3 ';. нижняя нить, 5'- ССТ ГГТ GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ') или отрицательный контроль стволовых петля в pcDNA6.2-GW /EmGFP вектора ( Invitrogen) [15]. 2-кб микроРНК-1228 область * промотор амплифицировали (праймеры были сконструированы как: вперед, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ', обратный, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) и coloned к pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], названный как pGL3-Mir-1228 * -promoter. Пустой pGL3-Enhancer Вектор выступал в качестве отрицательного контроля (pGL3-контроль). МикроРНК-1228 * целевая область последовательности CK2A2 3'UTR был химически синтезирован Shanghai Biotech и вставлен ниже люциферазы плазмиды pMIR-REPORT (Applied Biosystems), названный как pMIR-CK2A2. Клон pReceiver-с-Rel ORF с GFP-таг был приобретен у GeneCopoeia. Для создания устойчивых трансфицированных клеток, Мирский-1228 * и экспрессирующие конструкции микроРНК-NC трансфицировали в линию SGC-7901 клеток с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Через 48 часов, бластицидин (14 мкг /мл) добавляли к среде. PGL3-Mir-1228 * -promoter /контроль, GFP-с-Rel /контроль, pMIR-CK2A2 /управления или репортер вектор NF-kB (Promega) были трансфицированы в SGC-7901 клеток с использованием Липофектамина 2000, PRL-ТЗ ( Promega), был использован в качестве внутренней нормализации [17].
<р> люциферазы репортер проводили в СГК-7901 клеток. Клетки промывали PBS дважды и лизировали в пассивном лизирующего буфера (Promega) и люциферазы деятельности были измерены с 20 мкл лизата с использованием двойной люциферазы репортерной системы анализа (Promega) на GloMax 20/20 люминометра (Promega). Все данные были получены путем усреднения результатов по меньшей мере трех независимых повторах.
Статистический анализ
<р> Различия между уровнями экспрессии микроРНК-1228 * в больных раком желудка определяли с помощью Вилкоксона знаково-ранговый критерий. Клинические данные были проанализированы с использованием критерия хи-квадрат. T-критерий Стьюдента и дисперсионный анализ были использованы для анализа в пробирке
и виво
данные. Все значения P
были двусторонними и различия были определены как статистически значимое для P &
ЛТ; 0.05. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения V.16.0 SPSS (SPSS Inc.). * P &л; 0,05, ** Р &л; 0.01.
Результаты
<р> Во-первых, определить, является ли микроРНК-1228 * дифференциально экспрессируется в человеческой первичной рака желудка, уровень экспрессии зрелого микроРНК-1228 * исследовали с использованием TaqMan ПЦР в реальном времени в 50 пар желудка раковых тканей человека и парных подобранная смежных нераковых желудка тканей. Наши результаты показали, что уровень экспрессии микроРНК-1228 * значительно снизилась в желудочном раковых тканей по сравнению с соседними нераковых желудочных тканей (рис. 1А). Около 72% образцов опухолей были ниже, выражены с микроРНК-1228 * (рис. 1, б). Используя 2 -ΔΔCT значения, кратное изменение MIR-1228 * &ЛТ; 1,0 рассматривалась как низкий, пока он > 1,0 рассматривалось как высокий уровень экспрессии [18]. микроРНК-1228 * выражение также оценивали в желудочном линиях раковых клеток и один иммортализованные нормальную слизистую оболочку желудка эпителиальную клеточную линию (ГЭС-1). Как показано на рис. 1C, микроРНК-1228 * была значительно низкая экспрессия во всех линиях раковых клеток по сравнению с ГЭС-1. Взятые вместе, эти результаты дают убедительные доказательства того, что микроРНК-1228 * подавлялась при раке желудка.
<Р> Кроме того, микроРНК-1228 * выражение оценивали по отношению к клинико-патологическими характеристик пациентов. Все пациенты не имели отдаленных метастазов и все ткани были гистологически подтверждены желудка аденокарциномы. Во всех случаях (n = 50) были разделены на две группы: микроРНК-1228 * низкая экспрессия (п = 36) и микроРНК-1228 * высокое выражение (п = 14). МикроРНК-1228 * с низким уровнем экспрессии группа имела наклоны в сторону большего размера опухоли. Тем не менее, не было никаких существенных отношений между MIR-1228 * выражение и другие клиникопатологическими функции, такие как возраст, пол, гистологического типа или стадии TNM (таблица 1).
Увеличение микроРНК-1228 * Expression Подавляет ксенотрансплантата опухоли Формирование
<р> для того чтобы оценить функциональную роль MIR-1228 * при раке желудка, оптимизированная микроРНК-1228 * стволовых петля клонировали в pcDNA6.2-GW /EmGFP вектор. Желудочный клеточная линия СГК-7901 клетки были трансфицированы pcDNA6.2-GW /EmGFP-Mir-1228 * или pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC вектор и стабильные клеточные линии были получены и названы микроРНК-1228 * или микроРНК-NC, соответственно. Как и следовало ожидать, ОТ-ПЦР анализ показал, что микроРНК-1228 * стабильные клетки имели увеличение зрелого MIR-1228 * экспрессии при сравнении с микроРНК-NC устойчивых клеток (рис. 2А). Там не было никаких изменений в морфологическом микроРНК-1228 * стабильные трансфицированные клетки по сравнению с nontransfected клетками. SGC-7901 клетки с добавлением или без трансфекции MIR-1228 * имплантировали подкожно в бок голых мышей, чтобы оценить потенциальные эффекты MIR-1228 * на желудочную роста рака В естественных условиях
. Сверхэкспрессия MIR-1228 * значительно подавляли рост опухоли (рис. 2В). К концу экспериментального периода, размер и вес во влажном состоянии опухолей с MIR-1228 * избыточная экспрессия была значительно меньше, и ниже, чем у контрольной группы (рис. 2C-D). Таким образом, данные указывают на то, что микроРНК-1228 * ингибирует рост опухоли ксенотрансплантата клеток рака желудка В естественных условиях
.
NF-kB активации отвечает за нижней экспрессии микроРНК-1228 * в желудочном Рак
<р> Недавние работы показали, что большинство микроРНК имеют фактор транскрипции (TF) сайты связывания и многие исследования показали, что микроРНК может регулироваться ТФ [19]. Здесь мы использовали биоинформатики программы (Promoter 2.0 и P-матч) для идентификации потенциальных регуляторов микроРНК-1228 * [16], [17]. Мы нашли три с-Rel-связывающие домены в 2-кб MIR-1228 * область промотора (рис. 3А). Так как С-Rel-субъединица является членом семейства NF-kB и гиперактивации активности NF-kB было показано, что связано с раком желудка [20], [21]. Мы предположили, что активация NF-kB связывается с подавлением микроРНК-1228 * при раке желудка.
<Р> Чтобы доказать нашу гипотезу, мы создали люциферазы построить с MIR-1228 * области промотора и оценивали его активность в ответ к активации NF-kB. Эксперимент проводили при культивировании СГК-7901 клеток в течение 8 часов в присутствии TNF-alpha (50 или 100 нг /мл, классический NF-kB путь активатора) и /или пирролидиновое дитиокарбамата (PDTC, 100 мкМ), широко используемый ингибитор фактора транскрипции NF-kB [22]. SGC-7901-клетки трансфицировали pGL3-MIR-1228 * -promoter или pGL3-контроль, 24 часов спустя, трансфицированных SGC-7901 клетки подвергали воздействию в течение 8 часов TNF-alpha с или без PDTC расследовать ли NF-kB регламентирует активации микроРНК-1228 * активность промотора. Мы наблюдали, что лечение TNF-альфа заметно угнетается микроРНК-1228 * активность промотора и ингибирование NF-kB с PDTC предотвращено TNF-альфа-опосредованной понижающей регуляции уровней активности (рис. 3б), предполагая, что NF-kB может негативно регулировать зер- 1228 * выражение. Для дальнейшего определения NF-kB с субъединицей-Rel отвечает за дерегулирование микроРНК-1228 *, мы трансфецировали SGC-7901 клетки микроРНК-1228 * -promoter с или без GFP-C-Rel и наблюдается значительное снижение активности люциферазы в GFP -с-Rel группа, чем контроль (рис. 3С). В совокупности данные свидетельствуют о том, что NF-kB с субъединиц-Rel функционально способствует понижающей регуляции MIR-1228 * при раке желудка.
микроРНК-1228 * Подавляет NF-kB и активность CK2A2 Выражение в SGC-7901 <бр>
микроРНК-1228 * Тормозит EMT
<р> Сообщалось, что активация NF-kB играют существенную роль в ЕМТ для прогрессирования рака [30], [31], и ингибирование активности NF-kB в некоторых линий опухолевых клеток вызвало разворот EMT [32]. Так как MIR-1228 *, кажется, негативно регулирует активность NF-kB, поэтому мы исследовали, если микроРНК-1228 * может также негативно регулирует EMT при раке желудка. Вестерн-блот показал, что избыточная экспрессия микроРНК-1228 * в SGC-7901 клеток вниз регулируемые маркеры мезенхимальных (Виментин, β-катенин, Snail, Slug, и ZEB1 /2), в то время как до регулируемых эпителиальной маркер E-кадгерина (Рис. 5А ). Кроме того, микроРНК-1228 * избыточная экспрессия приводит к уменьшению миграции клеток (рис. 5B-C). Иммуногистохимическое окрашивание использовали для дальнейшего подтверждения EMT-родственных белков изменения MIR-1228 * трансфицированные SGC-7901-клеток в модели ксенотрансплантата. Было показано, что экспрессия Виментин уменьшается, а экспрессия Е-кадгерина увеличилась по сравнению с которой в контрольных клетках (рис. 5D). Аналогичные результаты наблюдались в другом желудочной линии раковых клеток AGS (рис. S1). Эти данные дают первое доказательство того, что микроРНК-1228 * восстановление при раке желудка негативно регулирует EMT.
Обсуждение
<р> Рак желудка является четвертым наиболее распространенной злокачественной опухоли во всем мире и в настоящее время является второй ведущей причиной рак смертность, связанная с [33], [34]. Хотя существующая практика, которая сочетает в себе химиотерапии или лучевой терапии с хирургической резекции значительно увеличило общую выживаемость больных раком желудка, общий показатель 5-летней выживаемости все еще остается низким. Желудочный канцерогенез считается многофакторным и многоэтапный процесс, который включает в себя активацию онкогенов и инактивации генов-супрессоров опухолей [35].
<р> Наши данные указывают на понижающей регуляции MIR-1228 * в желудочных тканях рака желудка и линий раковых клеток. Различные молекулярные механизмы приводят к микроРНК дерегуляции, такие как генетическая мутация, эпигенетической аберрацией и нерегулируемого транскрипционной активности [42]. ТФ может регулировать экспрессию микроРНК путем связывания с промоторной области, либо в физиологических или патологических контекстах [43]. Для того, чтобы исследовать, как микроРНК-1228 * был дерегулированы при раке желудка, мы проанализировали промоторную область 2 т.п.н. вверх по течению от MIR-1228 * и нашли три мнимых с-REL связывающие домены. Хотя NF-kB лучше всего известен своей функции активации транскрипции, недавней работе с р65, RelB и с-Rel показали, что NF-kB может понижающей регуляции специфических генов [17], [44], [45]. Использование MIR-1228 * промотор-репортер конструкцию, которая содержала 2 т.п.н. фрагменты микроРНК-1228 * промотор, мы обнаружили, что NF-kB путь активатора TNF-α снизился микроРНК-1228 * активность промотора. И NF-kB ингибитор PDTC удивительно антагонистом TNF-α-опосредованной MIR-1228 * промотор низкой активности. Наши данные также показали, что с-Rel был в состоянии непосредственно связывается с микроРНК-1228 * промотор и негативно регулирует его экспрессию. Так как с-Rel субъединица является членом семейства NF-kB, активация NF-kB phenocopied эффекты с-Rel в регуляции микроРНК-1228 * выражение, предполагая, что NF-kB путь отрицательно участвует в понижающей регуляции MIR-1228 * при раке желудка. Кроме того, микроРНК-1228 * избыточная экспрессия также привела к понижающей регуляции активности NF-kB. Таким образом, наши данные очертить двойной отрицательной обратной связи между NF-kB и MIR-1228 *. Точный механизм того, как это отрицательная обратная связь возникает потребности в дальнейшем изучении.
<Р> CK2A2 является одной субъединицей протеинкиназы СК2, который является высоко консервативным и повсеместный белок серин /треонин киназа. Сверхэкспрессия CK2 наблюдается в ряде видов рака, в том числе молочной железы, предстательной железы, почек, легких, головы и шеи и желудка [27], [46]. Сверхэкспрессия СК2 в молочных железах трансгенных мышей вызывает гиперплазию и дисплазию, что в конечном итоге привести к аденокарциномы [47]. CK2 были избыточно экспрессируется в головы и шеи плоскоклеточного линии клеток карциномы и тканей. Нокдаун СК2 субъединиц дифференцированно ингибированию разложения IκBα, NF-kB ядерной локализации, фосфорилирования, связывания ДНК, и репортер активности [25]. СК2 играет важную роль в ее 2-/сигнализации Neu, способствуя деградации IκB и активации NF-kB [26]. В этом исследовании мы показали, что микроРНК-1228 * снижала экспрессию CK2A2 на уровне белка. Анализ люциферазы с репортером, содержащим MIR-1228 * последовательность связывания на 3'-UTR мРНК CK2A2 предположил, что микроРНК-1228 * непосредственно нацелен на 3'UTR из CK2A2. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что подавление активности NF-kB с помощью MIR-1228 * может быть через выражение таргетинга CK2A2. ЕМТ теперь все известно, имеет место в различных заболеваний, в том числе и прогрессированию рака. Признано, что ЕМТ является важным процессом для формирования диффузного гистологии и инициировать метастазирование путем усиления перистальтики опухолевых клеток [48]. EMT регулируется различными онкогенных сигнальных путей, таких как АКТ и NF-kB [49], [50]. В частности, активация NF-kB, как было показано способствовать EMT в то время как ингибирование активности NF-kB в мезенхимальной клетки вызывает реверсирование EMT [30]. Потеря экспрессии E-кадгерина и усиления виментина выражения считаются наиболее важными молекулярных маркеров EMT [51]. ТФ, такие, как улитка, Slug, ZEB1 и ZEB2, как было показано, играют важную роль. микроРНК играют ключевую роль в регулировании процесса ЕМТ. Семейство микроРНК-200 и микроРНК-205 регулирует EMT путем охвата ZEB1 и ZEB2, которые функционируют как транскрипционные репрессоры экспрессии E-кадгерина, тем самым уменьшая агрессивность раковых клеток [52]. Стабильная экспрессия микроРНК-155 значительно ингибирует клетки подвергаются ЕМТ и ингибирует экспрессию ряда генов, связанных с индукцией EMT [53]. Сверхэкспрессия CK2 был вовлечен в канцерогенеза и развития колоректального рака посредством регуляции EMT-родственных генов [54]. Активация СК2 и С-Rel индуцирует EMT через рецептор арила углеводородов и Slug сигнального пути [55]. В нашем исследовании, восстановление MIR-1228 * подавляется EMT фенотип и уменьшение желудка миграции раковых клеток, это могло бы приписать MIR-1228 * -опосредованного подавление активности NF-kB и через выражение таргетинга CK2A2.
<Р> Настоящая работа идентифицирует MIR-1228 * как негативный регулятор активности NF-kB и подчеркивает его роль в подавлении EMT и желудочный рост рака, позволяет предположить, что селективное восстановление микроРНК-1228 * может быть полезным для терапии рака желудка.
Рисунок S1.
Влияние MIR-1228 * на ЕМТ в AGS клетках. (A) Вестерн-блот-анализ эпителиального маркера Е-кадгерина и мезенхимальных маркера Виментин в MIR-1228 * стабильные трансфицировали AGS клеток и управления. (B) Transwell миграции Анализ показал, что AGS клетки стабильно трансфицированных с MIR-1228 * имели более низкий миграционный потенциал в сравнении с MIR-NC (× 100)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0058637.s001
( DOC)
Пища избирательно влияет на кишечные микробы - результаты исследования
Половина используемых лекарств повреждает кишечные бактерии,
Антиоксиданты в рационе могут повысить риск рака кишечника.
Язвенный колит и отсутствие микробов в кишечнике
Водородное дыхание исходит не с атолла Бикини
Биологическая терапия может снизить риск тяжелой формы COVID-19
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Исследователи из Университета Южной Калифорнии (USC) на ежегодном собрании Американского общества микробиологов обнаружили, что растительная пища может передавать микробиому кишечника устойчивость к а
PENTAX Medical собирает 125 долларов,
000 для Всемирного фонда исследования рака в рамках кампании МИЛИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ПЕНТАКС Медикал, ведущий поставщик решений для эндо-визуализации, празднует 100 th годовщина основания Asahi Optical Jo
Микробы могут предсказать летальный исход у пациентов с COVID-19 на ИВЛ
Наличие Микоплазма саливарий в нижних дыхательных путях вентилируемых пациентов с инфекцией COVID-19 связано с повышенными шансами смерти. Результат стал частью молекулярного исследования, в ходе ко