Ploche ONE: Renovácia Mir-1228 * Expression Potláča epitelu mezenchymálnych prechod v žalúdočnej Cancer

abstraktné

dysregulovaný miRNA zohrávajú kľúčovú úlohu v priebehu karcinogenézy a progresiu rakoviny. V tejto štúdii, je funkcia MIR-1228 * v regulácii progresii rakoviny bola skúmaná v karcinómu žalúdka. Znížená expresia MIR-1228 * bola pozorovaná v ľudských tkanivách karcinómu žalúdka v porovnaní s normálnou tkanív. Následne role MIR-1228 * bol hodnotený in vivo
pomocou modelu nádoru xenoštěpem. V tomto modeli, MIR-1228 * nadmerná expresia potlačená tvorba xenoimplantátu nádoru. Ďalej sme ukázali MIR-1228 * negatívne regulovaná aktivitou NF-kB v SGC-7901 rakovinových buniek žalúdočnej a zistil, že CK2A2 bol terčom MIR-1228 *. Zvýšená expresia MIR-1228 * znížil expresiu mezenchymálnych markerov a zvýšenú epiteliálne markerovou E-cadherin, čo naznačuje potenciálnu úlohu pri potlačení epiteliálne-mezenchýme prechod. Súhrnne tieto výsledky poskytujú prvý dôkaz, že mier-1228 * hrá dôležitú úlohu v regulácii žalúdočnej rast rakoviny, a naznačujú, že selektívne obnovenie MIR-1228 * môže byť prospešné pre liečbu rakoviny žalúdka

Citácia :. L Jia , Wu J, L Zhang, J Chen, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Renovácia MIR-1228 * Expression Potláča epitelu-mezenchymálnych Transition v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

Prijaté: 25. októbra 2012; Prijaté: 05.02.2013; Publikované: 12.03.2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov: .. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

mikroRNA (miRNA) sú skupinou krátky ( 20-23 nukleotidov), endogénne, jednovláknové RNA, ktoré regulujú expresiu génu tým, že spôsobí alebo transláciu mRNA degradácia [1], [2]. Prostredníctvom týchto molekulárnych mechanizmov, miRNA majú normálnu biologické funkcie, ako je napríklad regulácia bunkovej proliferácie, diferenciácie a apoptózy. Okrem toho sa ich poškodeniu miRNA bolo preukázané, že hrajú kľúčovú úlohu v regulácii karcinogenéze a progresie rakoviny [3], [4]. Abberant miRNA expresie boli pozorované u mnohých druhov malignít vrátane karcinómu žalúdka [5].

epiteliálne-mezenchýmových prechod (EMT) je biologická preprogramovanie udalosť, ktorá umožňuje, epitelové bunky prejsť viac biochemické zmeny získať mezenchýme bunky fenotyp. Kým EMT je rozhodujúci pre zodpovedajúce vývoj embrya, zvyšuje dôkazov naznačuje, že k aktivácii aberantne EMT vedie k malígny progresii nádoru [6]. Bolo preukázané, že EMT je kľúčový proces prispieva k rozvoju rakoviny, vyznačujúci sa stratou epitelu markeru E-cadherinu, zvýšenie mezenchýme markeru vimentin, a zvýšenie migrácie a invazívnym správaním [7], [8].

V našej predchádzajúcej štúdii, analýzou miRNA polia s rakovinou slinivky brušnej gulí, MIR-1228 * bolo zistené, ako jeden z miRNA nádorových ochorení (dáta nie sú uvedené). Tu sme poskytli dôkaz, že mier-1228 * bol down-regulované v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s normálnymi tkanivami. Obnovenie expresie MIR-1228 * do buniek karcinómu žalúdka významne spomaľuje migráciu buniek a rast nádoru. Mechanicky sme ukázali, že mier-1228 * inhibuje aktiváciu NF-kB a potenciálne potláča EMT.

materiáloch a metódach

Cell Culture

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC-7901 , AGS a BGC-823 boli zakúpené z ústavu biochémie a bunkovej biológie (čínskej akadémie vied). Jeden normálny žalúdočné epiteliálne bunkové línie GES-1 bol zakúpený od pekinského Inštitútu pre výskum rakoviny. Tieto bunky boli udržiavané pri teplote 37 ° C v inkubátore s 5% CO2 v médiu RPMI-1640 (SGC-7901 a BGC-823), F-12K (AGS) alebo DMEM (GES-1), doplnenom 10% fetálnym bovinným sérom [ ,,,0],9], [10].

klinických vzoriek

Päťdesiat párov rakovinou žalúdka a priľahlých vzorky nenádorových tkanív boli získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgickú resekciu na druhom Affiliated Hospital, College of Medicine , Zhejiang University. Krytej non-rakovinové priľahlé tkanivá boli získané aspoň 5 cm od miesta nádoru. Žiadny z pacientov podstúpilo rádioterapii alebo chemoterapii pred operáciou. Vzorky tkaniva boli zhromaždené, snap-zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované pri teplote -80 ° C až do použitia [11]. Všetky tkanivá boli histologicky potvrdené, že adenokarcinóm žalúdka. Štúdia bola schválená etickou komisiou prepojeným druhej nemocnice Zhejiang University College of Medicine. Podpísaný informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov alebo od zástupcov pacientov, ak nebolo možné získať priamy súhlas.

RNA Extraction a Real-time PCR

Celková RNA bola extrahovaná z kultivovaných buniek alebo tkaniva pomocou TRIzolu (Invitrogen), a koncentrácia celkovej RNA bola stanovená. Syntéza cDNA a real-time PCR boli vykonané za použitia TaqMan microRNA reverznej transkripcie Kit (Applied Biosystems) a Kit TaqMan microRNA metóda (Applied Biosystems), resp. Real-time PCR bola vykonaná na ™ PCR systému Applied Biosystems StepOnePlus v reálnom čase v súlade s protokolom. Hladina expresie MIR-1228 * je normalizované na RNU6B. V reálnom čase PCR reakcie boli vykonané v troch opakovaniach. Relatívna expresia miRNA bola vypočítaná za použitia komparatívnej metódy Ct [12].

inokulácii nádoru u nahých myší Test

Balb /c athymických nahých myší vo veku 4 týždňov boli získané od Shanghai Laboratory Animal Center (Chinese Academy of Sciences). Všetky postupy zahŕňajúce zvieratami boli schválené pre pokusné zvieratá etickou komisiou, College of Medicine, Zhejiang University. MIR-1228 * alebo MIR-NC stabilný transfekciu SGC-7901 bunky suspenzie (2,5 x 10 ^{7 buniek /ml) v 200 ul média bez séra boli podkožne injikované do bokov holých myší, v danom poradí. Rast nádoru bol dvakrát skúmaná týždenne po dobu 5 týždňov a objem nádoru (V) bol monitorovaný meraním dĺžky (L) a šírky (W) nádoru posuvným meradlom a vypočíta podľa vzorca: V = 1/2 (L x W x W) [13].}

Cell Migration

migrácie schopnosť MIR-1228 * alebo MIR-NC stabilný transfekciu buniek SGC-7901 boli detekované s použitím Transwells (veľkosť pórov 8 mm, Corning). Tieto Transwells boli umiestnené do 24-jamkových doštičiek. Čerstvo trypsinizovány a premyté bunky boli suspendované v 100 ul RPMI 1640 bez séra obsahujúcim 1% fetálne hovädzie sérum. Asi 1 x 10 ^{5 buniek /jamku bolo umiestnených do hornej komory každej vložky. 200 ul RPMI 1640 obsahujúcom 20% fetálne hovädzie sérum bolo pridané do spodných komôr. Po inkubácii 24-48 hodín pri teplote 37 ° C v 5% CO a _{2 zvlhčenom inkubátore boli bunky fixované 95% absolútneho alkoholu a zafarbené kryštálovou violeťou [14]. Bunky vo vnútornej komore boli odstránené bavlneným tampónom a bunky prichytené na dolnú stranu membrány boli počítané a zobrazený pod inverzným mikroskopom pri zväčšení 200 x viac ako päť náhodných polí v každej jamke. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.}}

Western Blot

Celkové proteíny boli merané za použitia súpravy BCA (Pierce) podľa protokolu výrobcu. Proteíny buniek bola frakčnom elektroforézou na 12% SDS polyakrylamidovom gélu a electro-prenesené na nitrocelulózu (NC) membrány po dobu 2,5 hodiny pri 200 V. NC membrány boli inkubované s blokujúcim pufru po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a následne cez noc ošetrenie s primárnou protilátkou pri 4 ° C, a potom s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou (MBL). Po premytí reaktívne pásy boli detekované s použitím detekčnej súpravy ECL Western blot (Millipore) podľa pokynov výrobcu. Protilátky použité v tomto experimente boli králičie monoklonálne anti-E-cadherin (Epitomics), anti-Vimentin (Epitomics), anti-β-katenin (Epitomics), anti-Slimák (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) a myší anti-GAPDH (KangChen Biotech).

Imunohistochémia

parafínové rezy, 3- um hrúbky, sa pečie po dobu 2 hodín pri teplote 60 ° C a zbavené parafínu. Antigén vyhľadávania bola vykonaná za použitia citrátu sodný (pH 7,2) pri teplote 95 ° C počas 15 minút a potom sa sklíčka sa ochladí na teplotu miestnosti po dobu 30 minút. Potom, čo bol spracovaný 3% peroxidu vodíka po dobu 15 minút k zablokovaniu endogénnej peroxidázy boli rezy liečení normálne kozie sérum zvažujúcemu kvapaliny počas 30 minút k zníženiu nešpecifické väzby a králičie polyklonálne anti-E-cadherin (Santa Cruz) alebo králičie monoklonálne anti-Vimentin (Epitomics) bol inkubuje sa s ním v častiach po dobu 12 hodín pri teplote 4 ° C. Po rewarming po dobu 1 hodiny a umývanie na 5 krát, boli rezy inkubované s sekundárnou protilátkou počas 30 minút pri teplote miestnosti. Diaminobenzidine bol použitý pre farebné reakcie.

Plasmid Výstavba a transfekciu buniek

MIR-1228 * expresný vektor (MIR-1228 *) alebo negatívna kontrola (MIR-NC) bol konštruovaný klonovaním žíhané oligonukleotidy, ktoré obsahovali optimalizované MIR-1228 * stonku-slučka (oligonukleotidy boli navrhnuté ako: horná prameň, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ' ,. spodné vlákno, 5'-CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 '), alebo negatívna kontrola kmeňových slučky do pcDNA6.2-GW /EmGFP vektora ( Invitrogen) [15]. 2-kb MIR-1228 * oblasť promotora bol amplifikovaný (Primery boli navrhnuté ako: vpred, 5'-ATC ACC TAG GGT ACT CTC TGG AG CCA CAC AGA-3 ', zvrátenie, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC AGA TCA GTT GGG GTG TG-3 '.) a coloned na pGL3-Enhancer vektor (Promega) [16], pomenovaný ako pGL3-MIR-1228 * -promoter. Prázdny pGL3-Enhancer Vector pôsobí ako negatívna kontrola (pGL3-kontrola). MIR-1228 * cieľová oblasť sekvencie CK2A2 3 'UTR bol chemicky syntetizovaný Shanghai Biotech a vložený po smere od pMIR-REPORT luciferázy plazmidu (Applied Biosystems), pomenovaný ako pMIR-CK2A2. PReceiver-c-Rel ORF klon s GFP-tag bol zakúpený od GeneCopoeia. K vytvoreniu stabilných transfekciou buniek sa MIR-1228 * a mier-NC expresné konštrukty boli transfekovány do bunkovej línie SGC-7901 za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Po 48 hodinách, blasticidin (14 ug /ml), bol pridaný do média. PGL3-MIR-1228 * -promoter /kontrola, GFP-c-Rel /kontrola, pMIR-CK2A2 /kontrola alebo NF-kB reportér vektor (Promega) boli prechodne transfekovány do SGC-7901 buniek použitím Lipofectamine 2000, SLO-TK ( Promega) bol použitý ako interný normalizácie [17].

Luciferase Reporter Assay

luciferázy reportér test bol vykonávaný v SGC-7901 bunky. Bunky boli premyté dvakrát PBS a lyžujú v pasívnej lyzačného pufra (Promega) a luciferázové aktivity boli merané z 20 ul lyzátu pomocou Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) na GloMax 20/20 Luminometer (Promega). Všetky údaje boli získané spriemerovaním výsledkov z najmenej troch nezávislých opakovaní.

Štatistická analýza

Rozdiely medzi úrovňami expresie MIR-1228 * u pacientov s karcinómom žalúdka boli stanovené pomocou Wilcoxon podpísal-rank test. Klinické údaje boli analyzované pomocou testu chí-kvadrát. T test a ANOVA boli použité na analýzu in vitro stroje a in vivo
dáta. Všetko P
hodnoty boli obojstranné a rozdiely boli definované ako štatisticky významné pre P Hotel < 0.05. Výsledky boli analyzované pomocou softwaru V.16.0 SPSS (SPSS Inc.). * P < 0,05, ** P < 0.01.

Výsledky

MIR-1228 * je často down-regulované v rakovina žalúdka u ľudí

Po prvé, aby sa zistilo, či je MIR-1228 * je rôzne vyjadrené v ľudských primárnych rakoviny žalúdka, hladina expresie maturovaného MIR-1228 * bola skúmaná s použitím TaqMan PCR v reálnom čase v 50 párov rakovina žalúdka u tkanív a paru-uzavreté priľahlé nenádorové žalúdočné tkaniva. Naše výsledky ukazujú, že hladina expresie MIR-1228 * sa významne znížila v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní so susednými nenádorové žalúdočné tkaniva (obr. 1A). Asi 72% nádorových vzoriek boli nižšie vyjadrená MIR-1228 * (Obr. 1B). Použitie 2 ^{-ΔΔCT hodnoty, násobnú zmenu Mir-1228 * < 1,0 bola považovaná za nízku, zatiaľ čo IT > 1.0 bola považovaná za vysokú expresiu [18]. MIR-1228 * expresie sa hodnotil aj v žalúdočných bunkových línií karcinómu a jeden imortalizované normálne žalúdočnej sliznice epiteliálne bunkové línie (GES-1). Ako je znázornené na Obr. 1C, mier-1228 * bol výrazne nízka expresia vo všetkých bunkových línií karcinómu v porovnaní s GES-1. Dohromady tieto výsledky poskytujú silný dôkaz, že mier-1228 * bol down-regulovaná u karcinómu žalúdka.}

Okrem toho, MIR-1228 * expresie boli hodnotené s ohľadom na klinicko-charakteristiky pacientov. Všetci pacienti nemali vzdialenej metastázy a všetky tkanivá boli histologicky potvrdené s žalúdočnými adenokarcinómy. Vo všetkých prípadoch (n = 50) boli rozdelení do dvoch skupín: Mir-1228 * nízka expresia (n = 36) a mier-1228 * vysoká expresia (n = 14). MIR-1228 * low-výraz skupina mala sklony k väčšej veľkosti nádoru. Avšak, tam neboli žiadne významné vzťahy medzi Mir-1228 * expresie a ďalšie patologickým funkcie, ako je vek, pohlavie, histologický typ alebo TNM štádiu (tabuľka 1).

Zvýšená MIR-1228 * Expression Potláča xenografe nádoru Formation

záujme posúdiť funkčné úlohu MIR-1228 * u karcinómu žalúdka, optimalizovaný MIR-1228 * kmeňových slučky bol klonovaný do pcDNA6.2-GW /EmGFP vektora. Žalúdočné bunková línia SGC-7901 bunky boli transfekovány /EmGFP-MIR-1228 * alebo pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektor a stabilné bunkové línie pcDNA6.2-podzemnej vody boli vytvorené a pomenované Mir-1228 * alebo MIR-NC, resp. Ako sa dalo očakávať, RT-PCR analýza ukázala, že mier-1228 * stabilný bunky mali zvýšenie zrelé MIR-1228 * expresie pri porovnaní s Mir-NC stabilných buniek (obr. 2A). Nebolo morfologické zmeny v Mir-1228 * stabilných transfekciou buniek v porovnaní s bunkami nontransfected. SGC-7901 bunky s alebo bez transfekcia MIR-1228 * boli implantované podkožne do bokov holých myší zhodnotiť potenciálne účinky MIR-1228 * Na žalúdka rast rakoviny in vivo
. Nadmerná expresia MIR-1228 * významne potlačil rast nádoru (Obr. 2B). Do konca experimentálneho obdobia, je veľkosť a hmotnosť vo vlhkom stave nádorov s Mir-1228 * zvýšená expresia bola významne menšie a nižšie ako u kontrolnej skupiny (obr. 2C-D). To znamená, že údaje naznačujú, že mier-1228 * inhibuje rast nádoru xenoštěpem rakovinových buniek žalúdka in vivo
.

NF-kB aktivácie je zodpovedný za zníženú expresiu MIR-1228 * žalúdočné rakovina

Nedávne práce ukázali, že väčšina miRNA majú transkripčný faktor (TF) väzobné miesta a mnohé štúdie preukázali, že miRNA by mohli byť regulované TFS [19]. Tu sme použili bioinformatiky programy (Promotér 2,0 a P-match) identifikovať potenciálne regulátory miRNA-1228 * [16], [17]. Zistili sme tri c-Rel väzbové domény do 2 kb MIR-1228 * promotorová oblasť (obr. 3A). Vzhľadom k tomu, c-Rel podjednotky je členom rodiny NF-kB a hyperaktivace NF-kB aktivity bolo preukázané, že sú spojené s rakovinou žalúdka [20], [21]. Predpokladali sme, že aktivácia NF-kB je pripočítaný downregulace MIR-1228 * v rakoviny žalúdka.

Ak chcete ukázať našu hypotézu, sme vytvorili luciferázového konštruktu MIR-1228 * promotorové oblasti a vyhodnotiť svoju činnosť v odozve k aktivácii NF-kB. Bol vykonaný experiment kultiváciou SGC-7901 buniek po dobu 8 hodín v prítomnosti TNF-a (50 alebo 100 ng /ml, v klasickom NF-kB cesta aktivátora) a /alebo pyrrolidinový ditiokarbamátov (PDTC, 100 uM), čo je široko používaný inhibítor transkripčného faktoru NF-kB [22]. SGC-7901 bunky boli transfekovány pGL3-MIR-1228 * -promoter alebo pGL3-control, o 24 hodín neskôr, transfekované SGC-7901 bunky boli vystavené po dobu 8 hodín na TNF-a s alebo bez PDTC zistiť, či je NF-kB aktivácia reguluje MIR-1228 * promotorovou aktivitu. Pozorovali sme, že TNF-a liečbu výrazne inhibuje MIR-1228 * Aktivita promótorom a inhibícia NF-kB sa PDTC zabránené TNF-sprostredkovanej down-reguláciu úrovňou aktivity (obr. 3B), čo naznačuje, že NF-kB sa môže negatívne regulovať spätných 1228 * výraz. Pre ďalšie určenie, či NF-kB podjednotky c-Rel je zodpovedný za dereguláciu MIR-1228 *, sme transfekované SGC-7901 bunky MIR-1228 * -promoter s alebo bez GFP-c-Rel a pozorovalo významné zníženie luciferázové aktivity v GFP -c-Rel skupina ako kontroly (obr. 3C). Dohromady dáta naznačujú, že NF-kB podjednotky c-Rel funkčne prispieva k down-regulácii Mir-1228 * u rakoviny žalúdka.

MIR-1228 * Potláča NF-kB aktivity a CK2A2 Expresia v SGC-7901

Za účelom skúmanie vplyvu MIR-1228 * na NF-kB signálne dráhy, NF-kB reportéri konštrukty boli transfekovány buď do MIR-1228 * alebo MIR-NC stabilný transfekovaná SGC-7901 buniek a aktivitu NF-kB luciferázy bola stanovená po 48 hodinách. Naše výsledky ukazujú, že aktivita NF-kB sa významne znížil o nadmerné expresie MIR-1228 * (obr. 4A), čo ukazuje na negatívnej spätnej väzby medzi MIR-1228 * expresiu a NF-kB aktivity. Pre ďalšiu identifikáciu downstream cieľov MIR-1228 * v NF-kB dráhy, sme vykonali analýzu bioinformatiky a bolo zistené, CK2A2 bol jeden z predpokladaných cieľových génov, ktoré boli predvídať. Za použitia Miranda a RNA22 [23], [24], sme sa nachádza jeden potenciálny väzobné miesto pre mier-1228 * na 3 'UTR CK2A2 (obr. 4B). CK2A2 je jednou podjednotkou proteínovej kinázy CK2, ktorý je zapojený do cesty NF-kB [25], [26] a jeho expresie bola pozorovaná byť up-regulované v rôznych druhov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka [27], [28]. Ďalšie vyšetrovanie na spojenie medzi CK2A2 a mier-1228 * preukázané, že hladiny proteínové CK2A2 bol súčasne down-regulované na MIR-1228 * stabilný nadmernou expresiou v SGC-7901 buniek (obr. 4C). Aby sa overilo, či CK2A2 je skutočný cieľ MIR-1228 *, je segment CK2A2 3 'UTR obsahujúca väzobné miesto bol klonovaný do 3'UTR génu luciferázy v pMIR-Report plazmidu [29]. Fluorescenčné intenzita reportérového génu bola významne znížila v skupine, ktorá bola kotransfekovány pMIR-CK2A2 a mier-1228 * v porovnaní s kontrolou (obr. 4D). Tieto výsledky naznačujú, že mier-1228 * interaguje s CK2A2 mRNA 3 'UTR.

MIR-1228 * inhibuje EMT

Bolo zistené, že aktivácia NF-kB zohráva zásadnú úlohu pri EMT progresie rakoviny [30], [31], a inhibícia NF-kB aktivity v niektorých nádorových bunkových línií spôsobil obrátenie EMT [32]. Vzhľadom k tomu, Mir-1228 * Zdá sa negatívne reguluje NF-kB aktivita, preto sme skúmali, či MIR-1228 * by tiež mohla negatívne regulovať EMT v rakoviny žalúdka. Western blot ukazuje, že zvýšená expresia MIR-1228 * v SGC-7901 bunky down-regulované mezenchýmových markery (vimentin, β-katenin, Slimák, Slug, a ZEB1 /2), zatiaľ čo up-regulovaný epiteliálne značka E-cadherinu (obr. 5A ). Okrem toho, mier-1228 * nadmerná expresia spôsobil zníženie migrácie buniek (Obr. 5B-C). Imunohistochemické farbenie bol použitý pre ďalšie potvrdenie EMT-príbuzné proteíny zmeny MIR-1228 * transfekované SGC-7901 buniek v modeli xenoimplantátu. Bolo ukázané, že expresia vimentin znížená a expresie E-cadherinu zvýšila v porovnaní s kontrolnými bunkami, ktoré v (obr. 5D). Obdobné výsledky boli pozorované v inom žalúdočné rakovina bunkové línie AGS (obr. S1). Tieto údaje poskytujú prvý dôkaz, že mier-1228 * obnova u karcinómu žalúdka negatívne regulujúci EMT.

Diskusia

Karcinóm žalúdka je štvrtým najčastejším zhubným nádorom po celom svete a v súčasnosti je druhou najčastejšou príčinou rakoviny súvisiace úmrtnosti [33], [34]. Hoci súčasná prax, ktorá v sebe spája chemoterapie alebo rádioterapie s chirurgickou resekciou výrazne zvýšilo celkové prežívanie pacientov s rakovinou žalúdka, celkovo 5-ročné prežitie je stále nízka. Žalúdočné karcinogenézy je považovaná za multifaktoriálne a viacstupňový proces, ktorý zahŕňa aktiváciu onkogénov a inaktivácia tumor supresorových génov [35].

miRNAs sú endogénne non-proteín-kódujúci krátke RNA, ktoré hrajú dôležitú úlohu v bunkovom fyziológie, vývoj, a ochorení tým, že negatívne regulovať génovú expresiu. Analýzy miRNA profilov expresie ukázali, že mnohé miRNA sú nenormálne exprimované a koreluje s tumorigenezí, progresie a prognózy rôznych hematologických a solídnych nádorov, vrátane rakoviny žalúdka [36]. Na identifikáciu a objasnenie biologickej funkcie miRNA deregulácie v karcinómu žalúdka nám môže pomôcť lepšie pochopiť mechanizmy vzniku tejto smrtiacej choroby a poskytuje nové príležitosti na rozvoj terapie miRNA báze. Napríklad, Mir-221 a mier-222 bolo preukázané, že pozitívne regulovať žalúdočné proliferáciu nádorových buniek a inváziu, čo naznačuje, že inhibícia vyberte z týchto miRNA byť prínosné pre liečbu karcinómu žalúdka [37]. miRNA zohrávajú úlohu v etiológii a patogenéze rôznych druhov rakoviny zameraním množstvo onkogénov a nádorových supresor génov. Mier-21 je nadmerne exprimovaný u H. pylori infikovaných žalúdočnej sliznice a žalúdočných rakovinových tkanív. Nevykonalo expresie MIR-21 zvyšuje invasiveness buniek karcinómu žalúdka, RECK je priamym cieľom MIR-21 [38]. MIR-218 inhibuje inváziu a metastázovaniu rakoviny žalúdka zacielením Robo1 receptor [39]. Ueda et al [40] identifikoval 22 up-regulované a 13 down-regulované miRNA u karcinómu žalúdka oproti nenádorových sliznicu, nízka expresia rokov-7g a mier-433 a vysokú expresiou Mir-214 bolo spojené s nepriaznivým výsledkom v celkovej prežitie nezávisle na klinických kovariátov, vrátane hĺbky invázie, lymfatických uzlín, a fázu. Mier-375 je často down-regulované v karcinómu žalúdka a funkcie ako nádorový supresor regulovať žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek potenciálne zacielením JAK2 onkogén [10]. Naše ďalšie štúdia ukázala, MIR-1228 * bol jedným epitelové rakoviny súvisiace s Mirna (nepublikované). Boli však hlásené len málo výskumy MIR-1228 *. Guled et al [41] preukázali, že mier-1228 * bol vysoko exprimovaný v malígne tkanive mezoteliomu v porovnaní s normálnymi vzorkami. Ale biologická funkcia tohto miRNA nebol doteraz vyhodnotený. V tejto štúdii sme zistili, že mier-1228 * bol down-regulované vo viac ako 70% karcinómov žalúdka v porovnaní s ich nontumor náprotivkami a poskytujú experimentálny dôkaz, že môže pôsobiť ako nádorový supresor cez negatívne reguláciu EMT a inhibícia NF -κB aktivitu.

Naše dáta ukazujú, znižujúce množstvo MIR-1228 * v žalúdočných rakovinových tkanív a žalúdočných nádorových bunkových línií. Rôzne molekulárne mechanizmy vedú k miRNA poruchy regulácie, ako je genetická mutácia, epigenetické aberácie a deregulované transkripčný aktivity [42]. TFS mohol regulovať miRNA expresiu väzbou na promotorových oblastí, v oboch fyziologických alebo patologických súvislostiach [43]. Pre zistenie, ako sa MIR-1228 * bol deregulované v karcinómu žalúdka, sme analyzovali promotorovou oblasť 2-kb proti smeru MIR-1228 * a zistili, že tri predpokladané c-Rel väzbové domény. Hoci NF-kB je najlepšie známy pre jeho aktivačný transkripčný funkcie, nedávne práce s P65, eľba a c-Rel preukázali, že NF-kB môže down-regulovať špecifické gény [17], [44], [45]. Za použitie MIR-1228 * promótor-reportér konštrukt, ktorý obsahoval 2-kb fragmenty promótorom * MIR-1228, sme zistili, že NF-kB cesta aktivátor TNF-α znížila MIR-1228 * promotorovou aktivitu. A NF-kB inhibítor PDTC pozoruhodne znepriatelil TNF-α-sprostredkovanej MIR-1228 * promotér nízku aktivitu. Naše dáta tiež ukazujú, že c-Rel bol schopný sa viaže priamo s Mir-1228 * promótorom a negatívne regulujú jeho expresiu. Vzhľadom k tomu, c-Rel podjednotky je členom rodiny NF-kB, aktivácia NF-kB phenocopied účinky c-Rel pri regulácii MIR-1228 * expresie, čo naznačuje, že NF-kB cesta bola negatívne podieľa na downregulace Mir-1228 * u karcinómu žalúdka. Okrem toho, mier-1228 * nadmerná expresia tiež za následok down-reguláciu NF-kB aktivity. Preto naše dáta načrtnúť dvojaký negatívnej spätnej väzby medzi NF-kB a mier-1228 *. Presný mechanizmus, ako sa táto negatívna spätná väzba musí byť ďalej skúmaná.

CK2A2 je jedným podjednotky proteín kinázy CK2, čo je vysoko konzervatívny a všadeprítomný proteín serín /treonín kinázy. Nadmerná expresia CK2 bol pozorovaný v celej rade nádorov, vrátane tých, mliečne žľazy, prostaty, obličiek, pľúc, hlavy a krku a žalúdka, [27], [46]. Nadmerná expresia CK2 v mliečnej žľazy transgénnych myší spôsobuje hyperplázie a dysplázia, ktoré nakoniec vedú k adenokarcinómu [47]. CK2 boli nadmerne exprimované v oblasti hlavy a krku karcinóm skvamóznych bunkových línií a tkanív. Vyradenie CK2 podjednotky rozdielne potlačený degradácie IκBα, NF-kB nukleárnej lokalizácie, fosforylácie, viažuci DNA a reportér činnosti [25]. CK2 hrá dôležitú úlohu v HER-2 /neu signalizácie, propagáciu degradácii IKB a aktiváciu NF-kB [26]. V tejto štúdii sme ukázali, že mier-1228 * znižuje expresiu CK2A2 na úrovni proteínu. Luciferázy test s reportérom, ktorý obsahuje MIR-1228 * väzbovú sekvenciu na 3 'UTR CK2A2 mRNA naznačujú, že mier-1228 * priamo zameriava na 3' UTR CK2A2. Vzaté dohromady, tieto dáta ukazujú, že potlačenie NF-kB aktivity MIR-1228 * môže byť prostredníctvom zacielenia CK2A2 výraz. EMT je teraz všetky známe, aby sa vyskytujú v rôznych ochorení, vrátane progresie rakoviny. Je známe, že EMT je dôležitý proces pre vytvorenie difúzne histológiu a začať metastáz zvýšením motilitu nádorových buniek [48]. EMT je regulovaná rôznymi onkogénnych signálnych dráh, ako sú AKT a NF-kB [49], [50]. Špecificky, aktivácia NF-kB bolo preukázané, že podporuje EMT, zatiaľ čo inhibícia NF-kB aktivity v mezenchýme bunky spôsobí obrátenie EMT [30]. Strata E-cadherin expresie a zisk vimentinu expresie sú považované za najdôležitejšie molekulárne markery EMT [51]. TFS, ako je Slimák, Slug, ZEB1 a ZEB2, bolo preukázané, že hrajú zásadnú úlohu. miRNA zohrávajú kľúčovú úlohu v regulácii procesu EMT. Rodina Mir-200 a mier-205 reguluje EMT zacielením ZEB1 a ZEB2, ktoré fungujú ako transkripčný represor z E-cadherin prejavu, čím sa znižuje agresivitu nádorových buniek [52]. Stabilná expresia MIR-155 významne inhibuje bunky z prechádza EMT a inhibuje expresiu radu génov súvisiacich s indukciou EMT [53]. Zvýšená expresia CK2 sa podieľala na karcinogenéze a vznikom rakoviny konečníka a hrubého čreva prostredníctvom regulácie EMT súvisiacich génov [54]. Aktivácia CK2 a C-Rel indukuje EMT prostredníctvom aryl uhľovodíkového receptora a Slug signálne dráhy [55]. V našej štúdii obnova MIR-1228 * potlačená EMT fenotyp a znížená žalúdočná migráciu nádorových buniek, čo by mohlo prípadne pripisujú MIR-1228 * sprostredkovanú zníženie expresie NF-kB aktivity a prostredníctvom cielenia CK2A2 výraz.

súčasná práca identifikuje MIR-1228 * ako negatívny regulátor NF-kB aktivity a zdôrazňuje svoju úlohu pri potlačení EMT a rast rakoviny žalúdka, naznačuje, že selektívna obnova MIR-1228 * môže byť prospešné pre liečbu rakoviny žalúdka.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Vplyv MIR-1228 * o EMT v AGS bunkách. (A) Analýza Western blot epitelové markerov E-cadherinu a mezenchymálnych markeru vimentin v Mir-1228 * stabilný transfekovaná AGS bunky a ovládanie. (B) Transwell migračné test ukázal, že AGS bunky stabilný transfekovány MIR-1228 * mali nižšie migračný potenciál v porovnaní s Mir-NC (x 100)
doi :. 10,1371 /journal.pone.0058637.s001
( DOC)

poďakovanie

autori ďakujú Dr. Yongliang Zhu v Second Affiliated nemocnici Zhejiang University College of Medicine na technickú pomoc.

• Ploche ONE: Zvýšená expresia CD151 predpovedá prognóza pacientov s resekciou rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Superior protinádorovú aktivitu nanočastíc na albumín viazaného paklitaxelu v experimentálnom rakoviny žalúdka