PLOS ONE: Restauration de miR-1228 * Expression Elimine épithéliale-mésenchymateuses Transition dans gastrique Cancer

Résumé

dérégulée miARN jouent un rôle critique au cours de la cancérogenèse et la progression du cancer. Dans la présente étude, la fonction de miR-1228 * dans la régulation de la progression du cancer a été étudié dans le cancer gastrique. Diminution de l'expression de miR-* 1228 a été observée dans les tissus du cancer gastrique humain comparant aux tissus normaux. Par la suite, le rôle de miR-1228 a été évaluée *
in vivo en utilisant le modèle de xénogreffe de tumeur. Dans ce modèle, miR-1228 * surexpression supprimé la formation xénogreffe de tumeur. De plus, nous avons démontré miR-1228 * régulé négativement l'activité de NF-kB dans les cellules cancéreuses gastriques SGC-7901 et a constaté que CK2A2 était une cible de miR-1228 *. Régulation à la hausse miR-1228 * a diminué l'expression de marqueurs mésenchymateuses et une augmentation du marqueur E-cadhérine épithéliale, ce qui suggère son rôle potentiel dans la suppression de transition épithélio-mésenchymateuse. Collectivement, ces résultats fournissent la première preuve que miR-1228 * joue un rôle important dans la régulation de la croissance du cancer gastrique et suggèrent que la restauration sélective de miR-1228 * pourrait être bénéfique pour le traitement du cancer gastrique

Citation:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Restauration de miR-1228 * Expression Elimine épithéliale-mésenchymateuses Transition dans le cancer gastrique. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, Japon

Reçu le 25 Octobre 2012; Accepté 5 Février 2013; Publié: 12 Mars, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Jia et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Les microARN introduction (miARN) sont une classe de courte durée ( 20-23 nucleotides de longueur), des ARN simple brin endogènes qui régulent l'expression des gènes en provoquant la répression de la traduction d'ARNm ou de dégradation [1], [2]. Via ces mécanismes moléculaires miARN possèdent des fonctions biologiques normales, telles que la régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose. En outre, miARN dérégulés ont été montré à jouer un rôle critique dans la régulation de la cancérogenèse et la progression du cancer [3], [4]. expression aberrante miARN ont été observées dans de nombreux types de tumeurs malignes, y compris le cancer gastrique [5].

épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) est un événement de reprogrammation biologique qui permet cellules épithéliales de se soumettre à de multiples changements biochimiques pour acquérir une cellule mésenchymateuses phénotype. Alors que EMT est essentiel pour le développement embryonnaire approprié, en plus de preuves suggèrent que l'activation aberrante de EMT conduit à la progression de la tumeur maligne [6]. Il a été démontré que OGD est un processus clé qui contribue au développement d'un cancer, caractérisé par la perte du marqueur épithélial E-cadhérine, une augmentation du marqueur mésenchymateux vimentine, et une augmentation du comportement migratoire et envahissant [7], [8].

Dans notre étude précédente, en analysant le tableau miRNA de sphères de cancer du pancréas, miR-1228 * a été trouvé comme l'un des miARN liés au cancer (données non présentées). Ici, nous avons fourni des preuves que miR-1228 * a été régulée à la baisse dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux tissus normaux. l'expression de la restauration de miR-1228 * dans des cellules de cancer gastrique inhibe de manière significative la migration cellulaire et la croissance tumorale. Mécaniquement, nous avons démontré que miR-1228 * inhibe l'activation de NF-kB et supprime potentiellement EMT.

Matériel et méthodes

Culture
Cell

lignées cellulaires de cancer gastrique humaines SGC-7901 , AGS et BGC-823 ont été achetés auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire (Chinese Academy of Sciences). Un GES-1 normales de lignée cellulaire épithéliale gastrique a été acheté de l'Institut de recherche sur le cancer de Beijing. Ces cellules ont été maintenues à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% dans du RPMI-1640 (CGT-7901 et BGC-823), le F-12K (AGS), ou DMEM (GES-1) additionné de 10% de sérum de foetus de bovin [ ,,,0],9], [10].

des échantillons cliniques

Cinquante paires de cancer de l'estomac et des échantillons de tissus adjacents non-cancéreuses ont été obtenus chez des patients ayant subi une résection chirurgicale au deuxième hôpital affilié, College of Medicine , Université de Zhejiang. Les non-cancéreuses tissus adjacents appariés ont été obtenus au moins 5 cm de distance du site de la tumeur. Aucun des patients avaient subi une radiothérapie ou une chimiothérapie avant l'opération chirurgicale. Des échantillons de tissus ont été prélevés, soumis à une congélation dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation [11]. Tous les tissus ont été histologiquement confirmé que les adénocarcinomes gastriques. L'étude a été approuvée par le deuxième hôpital affilié Comité d'éthique du Zhejiang University College of Medicine. Le consentement éclairé signé a été obtenu à partir de tous les participants ou de représentants des patients si le consentement directe n'a pu être obtenue.

Extraction d'ARN et PCR en temps réel

L'ARN total a été extrait des cellules cultivées ou tissus à l'aide Trizol (Invitrogen), et la concentration de l'ARN total a été déterminé. Synthèse de l'ADNc et la PCR en temps réel ont été effectuées en utilisant le kit TaqMan microARN Reverse Transcription (Applied Biosystems) et le kit TaqMan microARN Assay (Applied Biosystems), respectivement. PCR en temps réel a été réalisée sur un système de PCR en temps réel Applied Biosystems StepOnePlus ™ selon le protocole. Le niveau de miR-1228 * expression a été normalisé à RNU6B. Les réactions de PCR en temps réel ont été effectuées en triple. L'expression relative de miARN a été calculé selon la méthode comparative Ct [12].

Tumeur Inoculation Assay dans

Femme BALB de souris Nu /c athymiques souris nude à l'âge de 4 semaines ont été achetés chez le Shanghai Laboratory animal Center (Chinese Academy of Sciences). Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale expérimentale, Faculté de médecine, Université de Zhejiang. miR-1228 * ou miR-NC transfection stable SGC-7901 cellules suspensions (2,5 x 10 ^{7 cellules /ml) dans un milieu sans sérum 200 pi injection sous-cutanée dans les flancs de souris nues, respectivement. La croissance tumorale a été examiné deux fois par semaine pendant 5 semaines et le volume de tumeur (V) a été surveillée en mesurant la longueur (L) et la largeur (W) de la tumeur avec des pieds à coulisse et calculé selon la formule V = 1/2 (L x W × W) [13].}

migration cellulaire

La capacité de migration de miR-1228 * ou des cellules SGC-7901 transfection stable miR-NC ont été détectés en utilisant Transwells (taille des pores de 8 mm, Corning). Les Transwells ont été mis dans les plaques à 24 puits. des cellules fraîchement trypsinisées et lavées ont été mises en suspension dans du RPMI 1640 sans sérum 100 ul contenant 1% de sérum bovin foetal. Environ 1 x 10 ^{5 cellules /puits a été placé dans la chambre supérieure de chaque insert. 200 pi de RPMI 1640 contenant 20% de sérum de veau fœtal ont été ajoutés dans les chambres inférieures. Après incubation pendant 24-48 heures à 37 ° C dans un 5% de CO _{2 incubateur humidifié, les cellules ont été fixées avec de l'alcool absolu à 95% et colorées avec du cristal violet [14]. Les cellules dans la chambre intérieure ont été enlevées avec un coton-tige et les cellules fixées à la face inférieure de la membrane ont été comptées et imagée sous un microscope inversé à un grossissement de 200 × sur cinq champs aléatoires dans chaque puits. Chaque expérience a été réalisée en triple.}}

Western Blot

Les protéines totales ont été mesurées en utilisant le kit BCA (Pierce) selon le protocole du fabricant. Les protéines de cellules ont été fractionnées par électrophorèse sur 12% de gel de SDS-polyacrylamide et électro-transférés sur nitrocellulose (NC) des membranes pendant 2,5 heures à 200 membranes V. NC ont été incubées avec du tampon de blocage pendant 1 heure à la température ambiante, suivie d'un traitement pendant la nuit avec l'anticorps primaire à 4 ° C, puis avec un anticorps secondaire conjugué à HRP (MBL). Après lavage, les bandes réactives ont été détectées en utilisant un kit de détection de transfert de Western ECL (Millipore) conformément aux instructions du fabricant. Les anticorps utilisés dans cette expérience étaient de lapin monoclonal anti-E-cadhérine (Epitomics), anti-vimentine (Epitomics), anti-β-caténine (Epitomics), anti-Snail (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) et de la souris anti-GAPDH (Kangchen Biotech).

immunohistochimie

sections de paraffine, 3- um d'épaisseur, ont été cuits pendant 2 h à 60 ° C et déparaffinées. La récupération d'antigène a été effectuée en utilisant un tampon de citrate de sodium (pH 7,2) à 95 ° C pendant 15 minutes, puis lames ont été refroidis à la température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir été traité avec 3% de peroxyde d'hydrogène pendant 15 minutes pour bloquer la peroxydase endogène, les sections ont été traitées avec du liquide de sérum de chèvre normal de confinement pendant 30 minutes pour réduire la liaison non spécifique, puis polyclonal de lapin anti-E-cadhérine (Santa Cruz), ou monoclonal de lapin anti-vimentine (Epitomics) a été incubé les sections pendant 12 h à 4 ° C. Après le réchauffement pendant 1 h et lavage pendant 5 heures, les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire pendant 30 minutes à température ambiante. Diaminobenzidine a été utilisé pour les réactions de couleur.

Construction du plasmide et Cell Transfection

Le miR-1228 * vecteur d'expression (miR-1228 *) ou le contrôle négatif (miR-NC) a été construit par clonage de oligonucleotides annelés qui contenaient l'optimisation miR-1228 * tige-boucle (oligonucleotides ont été conçus comme: brin supérieur, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ';. brin inférieur, 5'CCT GGT GGG GGG GGT GTG CGG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ') ou la tige de commande en boucle négative en pcDNA6.2-GW /EmGFP vecteur ( Invitrogen) [15]. Le miR-1228 région * promoteur de 2 kb a été amplifié (apprêts ont été conçus comme: avant, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ', à l'inverse, 5'-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) et coloned à pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], nommé pGL3-miR-1228 * -promoter. Le vide pGL3-Enhancer Vector a agi comme un contrôle négatif (pGL3-control). Le miR-1228 * région cible de la séquence 3'UTR CK2A2 a été synthétisé chimiquement par Shanghai Biotech et inséré en aval de la luciférase plasmide PMIR-RAPPORT (Applied Biosystems), nommé PMIR-CK2A2. Le clone Preceiver-c-Rel ORF avec GFP-tag a été acheté chez GeneCopoeia. Pour produire des cellules transfectées stables, le miR-1228 * et miR-NC constructions d'expression ont été transfectés dans la lignée cellulaire SGC-7901 utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Au bout de 48 heures, la blasticidine (14 pg /ml) a été ajouté au milieu. Le pGL3-miR-1228 * -promoter /contrôle, GFP-c-Rel /commande, PMIR-CK2A2 /contrôle ou vecteur rapporteur NF-kB (Promega) ont été transfectées transitoirement dans des cellules SGC-7901 en utilisant Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) a été utilisé comme normalisation interne [17].

Luciferase reporter Assay

test rapporteur luciférase a été réalisée dans des cellules SGC-7901. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et lysées dans un tampon de lyse passive (Promega) et les activités luciférase ont été mesurées à partir de 20 ul de lysat en utilisant le Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) sur le luminomètre Glomax 20/20 (Promega). Toutes les données ont été obtenues en faisant la moyenne des résultats d'au moins trois répétitions indépendantes.

Analyse statistique

Les différences entre les niveaux d'expression de la miR-1228 * chez les patients atteints de cancer gastrique ont été déterminées par le Wilcoxon essai signé rang. Les données cliniques ont été analysées en utilisant le test du chi-carré. t-test et ANOVA de Student ont été utilisées pour analyser les in vitro
et in vivo
données. Tous P
valeurs étaient des deux côtés et les différences ont été définies comme statistiquement significative pour P
< 0,05. Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel SPSS V.16.0 (SPSS Inc.). * P < 0,05, ** P < 0,01.

Résultats

miR-1228 * est souvent régulé à la baisse dans Human Cancer gastrique

Tout d'abord, pour déterminer si le miR-1228 * est exprimé de manière différentielle dans le primaire humain les cancers gastriques, le niveau de la maturité miR-1228 * expression a été examiné par PCR TaqMan en temps réel dans 50 paires de tissus de cancer gastrique et de tissus humains gastriques noncancerous adjacents paire appariés. Nos résultats ont montré que le niveau de miR-1228 * expression était significativement diminuée dans les tissus du cancer de l'estomac en comparaison avec les tissus adjacents non cancéreuses gastriques (Fig. 1A). Environ 72% des échantillons de tumeurs ont été plus faibles exprimé avec miR-1228 * (Fig. 1B). Utilisation de 2 ^{-ΔΔCT valeurs, facteur de changement de miR-1228 * < 1.0 a été considéré comme faible, alors qu'il > 1.0 a été considéré comme une expression élevée [18]. miR-1228 * expression a également été évaluée dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et une ligne immortalisa muqueuse gastrique normale des cellules épithéliales (GES-1). Comme on le voit sur la Fig. 1C, miR-1228 * était significativement plus faible expression dans toutes les lignées de cellules cancéreuses par rapport aux GES-1. Pris ensemble, ces résultats fournissent des preuves solides que miR-1228 * a été régulée à la baisse dans le cancer gastrique.}

En outre, miR-1228 * expression ont été évalués en ce qui concerne les caractéristiques clinico des patients. Tous les patients avaient pas de métastases à distance et tous les tissus ont été histologiquement confirmés avec adénocarcinomes gastriques. Tous les cas (n = 50) ont été stratifiés en deux groupes: miR-1228 * faible expression (n = 36) et miR-1228 * expression élevée (n = 14). Le groupe à faible expression miR-1228 * avait inclinations vers la taille de la tumeur plus grande. Cependant, il n'y avait pas de relation significative entre le miR-1228 * expression et d'autres caractéristiques clinicopathologiques tels que l'âge, le sexe, le type histologique ou stade TNM (tableau 1).

Augmentation de miR-1228 * Expression Supprime des xénogreffes de tumeur Formation

afin d'évaluer le rôle fonctionnel de miR-1228 * dans le cancer gastrique, le miR-1228 optimisé * tige-boucle a été clone dans pcDNA6.2-GW /EmGFP vecteur. lignée cellulaire gastrique cellules SGC-7901 ont été transfectées avec pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR-1228 * ou pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vecteurs et cellules stables lignes ont été générés et nommé miR-1228 * ou miR-NC, respectivement. Comme on s'y attendait, l'analyse par RT-PCR a montré que des cellules stables * miR-1228 ont présenté une augmentation mature miR-1228 * lorsque l'on compare l'expression dans des cellules stables miR-NC (Fig. 2A). Il n'y avait pas de changement morphologique dans les cellules stables transfectées * miR-1228 par rapport aux cellules non transfectées. cellules SGC-7901 avec ou sans transfection de miR-1228 * ont été implantés sous-cutanée dans les flancs de souris nues pour évaluer les effets potentiels de miR-1228 * sur la croissance du cancer gastrique in vivo
. La surexpression de miR-1228 * supprimé de manière significative la croissance tumorale (Fig. 2B). À la fin de la période expérimentale, la taille et le poids humide des tumeurs avec miR-1228 * surexpression était significativement plus faible et inférieur à celui du groupe témoin (Fig. 2C-D). Ainsi, les données indiquent que miR-1228 * inhibe la croissance tumorale de xénogreffes de cellules de cancer gastrique .

in vivo NF-kB activation est responsable de l'expression inférieure de miR-1228 * dans l'estomac Cancer

des travaux récents ont montré que la plupart des miARN ont facteur de transcription (TF) des sites de liaison et de nombreuses études ont rapporté que les miARN pourraient être réglementés par TFs [19]. Ici, nous avons utilisé des programmes bioinformatiques (Promoteur 2.0 et P-jeu) pour identifier les régulateurs potentiels de miARN-1228 * [16], [17]. Nous avons trouvé trois c-Rel domaines de liaison dans le 2-kb miR-1228 * région du promoteur (Fig. 3A). Etant donné que la sous-unité c-Rel est un membre de la famille NF-kB et hyperactivation de l'activité de NF-kB a été démontré être associé à un cancer gastrique [20], [21]. Nous émettons l'hypothèse que l'activation de NF-kB est attribuée à la régulation négative de miR-1228 * dans le cancer gastrique.

Pour prouver notre hypothèse, nous avons créé une luciférase construire avec miR-1228 * région de promoteur et évalué son activité en réponse à l'activation de NF-kB. Une expérience a été réalisée en cultivant des cellules CGT-7901 pendant 8 heures, en présence de TNF-α (50 ou 100 ng /ml, classique activateur de la voie NF-kB) et /ou la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC, 100 pM), largement utilisé inhibiteur du facteur de transcription NF-kB [22]. cellules SGC-7901 ont été transfectées avec pGL3-miR-1228 * -promoter ou pGL3-contrôle, 24 heures plus tard, transfectées cellules SGC-7901 ont été exposés pendant 8 heures à TNF-α avec ou sans PDTC d'examiner si NF-kB régule d'activation miR-1228 * de l'activité du promoteur. Nous avons observé que le traitement du TNF-α nettement inhibé miR-1228 * L'activité du promoteur et l'inhibition du NF-kB avec PDTC empêché la régulation négative du TNF-α induite par des niveaux d'activité (Fig. 3B), ce qui suggère que le NF-kB peut réguler négativement Mir- 1228 * expression. Pour déterminer en outre si le NF-kB sous-unité c-Rel est responsable de déréglementer miR-1228 *, nous avons transfecté des cellules SGC-7901 miR-1228 * -promoter avec ou sans GFP-c-Rel et observé une diminution significative de l'activité luciférase dans GFP groupe-Rel -c que le contrôle (Fig. 3C). Collectivement, les données suggèrent que le NF-kB sous-unités c-Rel contribue fonctionnellement à la régulation négative de miR-1228 * dans le cancer gastrique.

miR-1228 * Empêche NF-kB Activité et CK2A2 Expression dans SGC-7901

afin d'étudier l'influence de miR-1228 * sur la voie de signalisation NF-kB, NF-kB constructions rapporteurs ont été transfectées soit dans miR-1228 * ou miR-NC stable cellules transfectées SGC-7901 et l'activité de NF-kB luciférase a été déterminée au bout de 48 heures. Nos résultats ont montré que l'activité de NF-kB a été significativement diminuée par la surexpression de miR-1228 * (Fig. 4A), ce qui indique une boucle de rétroaction négative entre miR-1228 * expression et l'activité de NF-kB. Pour identifier d'autres cibles en aval de miR-1228 * dans la voie NF-kB, nous avons effectué l'analyse bioinformatique et trouvé CK2A2 était l'un des gènes cibles putatifs qui ont été prédits. Utilisation de MIRANDA et RNA22 [23], [24], nous trouve un site de liaison potentiel de miR-1228 * à la 3'UTR de CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 est une sous-unité de la protéine kinase CK2 qui est impliquée dans la voie NF-kB [25], [26] et son expression a été observée pour être régulés à la hausse dans plusieurs cancers, dont le cancer gastrique [27], [28]. D'autres études sur l'association entre CK2A2 et miR-1228 * ont démontré que les niveaux de CK2A2 de protéines était concomitantly régulé à la baisse sur miR-1228 * surexpression stable dans les cellules SGC-7901 (Fig. 4C). Afin de vérifier si CK2A2 est une vraie cible de miR-1228 *, un segment de la CK2A2 3'UTR contenant le site de liaison a été clone dans la région 3'UTR du gène de la luciférase dans le plasmide PMIR-REPORT [29]. L'intensité de fluorescence du gène rapporteur a été significativement diminué dans le groupe qui a été co-transfectée avec PMIR-CK2A2 et miR-1228 * par rapport au témoin (Fig. 4D). Ces résultats suggèrent que miR-1228 * interagit avec le CK2A2 ARNm 3'UTR.

miR-1228 * Inhibe EMT

Il a été rapporté que l'activation de NF-kB joue un rôle essentiel dans EMT pour la progression du cancer [30], [31] et l'inhibition de l'activité de NF-kB dans certaines lignées de cellules tumorales a provoqué une inversion de l'EMT [32]. Depuis miR-1228 * semble négativement régule l'activité de NF-kB, nous avons donc étudié si miR-1228 * pourrait également réguler négativement EMT dans le cancer gastrique. Western blot a montré que la surexpression de miR-1228 * dans les cellules SGC-7901 marqueurs mésenchymateuses down-régulés (Vimentin, β-caténine, escargot, Slug, et ZEB1 /2), alors que jusqu'à régulé marqueur épithélial E-cadhérine (Fig. 5A ). En outre, miR-1228 * surexpression a provoqué une diminution de la migration cellulaire (Fig. 5B-C). La coloration immunohistochimique a été utilisée pour confirmer davantage protéines EMT liées changements de miR-1228 cellules SGC-7901 * transfectées dans le modèle de xénogreffe. Il a été montré que l'expression de la vimentine a diminué et l'expression de la E-cadhérine a augmenté par rapport à ce qui dans les cellules témoins (Fig. 5D). Les résultats semblables ont été observés dans une autre lignée cellulaire de cancer gastrique AGS (Fig. S1). Les données fournissent la première preuve que miR-1228 * restauration dans le cancer gastrique régule négativement EMT.

Discussion

Le cancer gastrique est la quatrième tumeur maligne la plus fréquente dans le monde entier et est la deuxième cause principale de ce moment liée au cancer de la mortalité [33], [34]. Bien que la pratique actuelle qui combine la chimiothérapie ou la radiothérapie avec résection chirurgicale a considérablement augmenté la survie globale des patients atteints de cancer gastrique, le taux global de survie à 5 ans est encore faible. carcinogenèse gastrique est considérée comme un processus multifactoriel et en plusieurs étapes qui implique l'activation d'oncogènes et l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs [35].

miARN sont endogènes non codant pour une protéine ARN courtes qui jouent un rôle important dans cellulaire la physiologie, le développement et les maladies en régulant négativement l'expression des gènes. L'analyse des profils d'expression de miARN ont montré que de nombreux miARN sont exprimées de manière aberrante et mis en corrélation avec la tumorigenèse, la progression et le pronostic de diverses tumeurs hématologiques et solides telles que le cancer gastrique [36]. Pour identifier et élucider les fonctions biologiques de miARN déréglementation dans le cancer gastrique peut nous aider à mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie mortelle et offre de nouvelles opportunités pour développer des thérapies à base de miARN. Par exemple, miR-221 et miR-222 ont été représentés à réguler positivement gastrique prolifération des cellules cancéreuses et l'invasion, ce qui suggère que l'inhibition de sélection de ces miARN être bénéfique pour le traitement du cancer gastrique [37]. miARN jouent un rôle dans l'étiologie et la pathogenèse de divers cancers, en ciblant un certain nombre d'oncogènes ou d'une tumeur suppresseurs de gènes. miR-21 est surexprimé dans la muqueuse gastrique H. pylori infectés et les tissus de cancer gastrique. expression forcée de miR-21 augmente l'invasivité des cellules de cancer gastrique, RECK est la cible directe de miR-21 [38]. miR-218 inhibe l'invasion et les métastases du cancer gastrique en ciblant le récepteur Robo1 [39]. Ueda et al [40] ont identifié 22 régulés à la hausse et 13 miARN régulés vers le bas dans le cancer gastrique par rapport à la muqueuse non tumorale, faible expression de laisser-7g et miR-433 et une expression élevée de miR-214 ont été associés à des résultats défavorables dans l'ensemble la survie indépendante de covariables cliniques, y compris la profondeur de l'invasion, des ganglions lymphatiques métastases, et la scène. miR-375 est souvent régulé à la baisse dans le cancer et la fonction gastrique comme un suppresseur de tumeur gastrique pour réguler la prolifération des cellules cancéreuses éventuellement en ciblant le JAK2 oncogène [10]. Notre étude a montré une autre miR-1228 * a été un cancer épithélial liée miRNA (non publié). Cependant, seuls quelques recherches de miR-1228 * ont été signalés. Guled et al [41] ont démontré que miR-1228 * a été fortement exprimé dans les échantillons de mésothéliome malin par rapport aux échantillons normaux. Mais la fonction biologique de ce miARN n'a pas encore été évaluée. Dans la présente étude, nous avons identifié que miR-1228 * a été régulée à la baisse dans plus de 70% des échantillons de cancer gastrique par rapport à leurs homologues non tumorales et de fournir des preuves expérimentales qu'il peut fonctionner comme un suppresseur de tumeur en régulant négativement EMT et l'inhibition de NF -κB activité.

Nos données indiquent une régulation négative de miR-1228 * dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires de cancer gastrique. Divers mécanismes moléculaires conduisent à miRNA dysrégulation, comme mutation génétique, l'aberration épigénétique et l'activité transcriptionnelle déréglementé [42]. TFs pourrait réguler l'expression des miARN en se liant à des régions promotrices, dans des contextes non physiologiques ou pathologiques [43]. Pour étudier comment miR-1228 * a été déréglementé dans le cancer gastrique, nous avons analysé la région promotrice de 2 kb en amont du miR-1228 * et a trouvé trois domaines de liaison c-Rel putatifs. Bien que NF-kB est surtout connu pour sa fonction d'activation de la transcription, des travaux récents avec p65, RelB et c-Rel démontré que NF-kB peut réguler à la baisse des gènes spécifiques [17], [44], [45]. L'utilisation d'un miR-1228 * promoteur-rapporteur construction qui contenait des fragments de 2 kb du miR-1228 * promoteur, nous avons constaté que le NF-kB activateur de la voie TNF-α a diminué miR-1228 * activité de promoteur. Et NF-kB inhibiteur PDTC remarquablement indisposé TNF-α-médiée miR-1228 * promoteur faible activité. Nos données ont également montré que c-Rel a pu se lie directement avec miR-1228 * promoteur et réguler négativement son expression. Etant donné que c-Rel sous-unité est un membre de la famille NF-kB, l'activation de NF-kB phenocopied les effets du c-Rel dans la régulation de miR-1228 * expression, ce qui suggère que la voie NF-kB est impliquée négativement dans la régulation à la baisse miR-1228 * dans le cancer gastrique. En outre, miR-1228 * surexpression a également entraîné la régulation négative de l'activité de NF-kB. Par conséquent, nos données décrivent un négatif double boucle de rétroaction entre le NF-kB et miR-1228 *. Le mécanisme exact de la façon dont cette rétroaction négative se produit besoins encore être étudiés.

CK2A2 est une sous-unité de la protéine kinase CK2, qui est une protéine ubiquitaire sérine /thréonine kinase hautement conservée et. La surexpression de CK2 a été observée dans un certain nombre de cancers, y compris ceux de la glande mammaire, de la prostate, du rein, du poumon, la tête et du cou et de l'estomac [27], [46]. La surexpression de CK2 dans les glandes mammaires de souris transgéniques provoque une hyperplasie et la dysplasie qui a finalement conduit à adénocarcinomes [47]. CK2 ont été surexprimé dans la tête et du cou squameux lignes de carcinome des cellules et des tissus. Knockdown de CK2 sous-unités différentiellement inhibée de dégradation IKBa, NF-kB localisation nucléaire, phosphorylation, liaison à l'ADN, et l'activité de journaliste [25]. CK2 joue un rôle important dans HER-2 /neu signalisation, la promotion de la dégradation de IkB et de l'activation de NF-kB [26]. Dans cette étude, nous avons montré que miR-1228 * réduit l'expression de CK2A2 au niveau des protéines. Le dosage de la luciférase avec un journaliste contenant le miR-1228 * séquence de liaison à la 3'UTR de CK2A2 ARNm suggéré que miR-1228 * vise directement 3'UTR de CK2A2. Pris ensemble, ces données indiquent que la suppression de l'activité de NF-kB par miR-1228 * peut être en ciblant l'expression CK2A2. EMT est maintenant tout connu pour se produire dans une variété de maladies, y compris la progression du cancer. Il est reconnu que OGD est un processus important pour former histologie diffuse et initier des métastases en améliorant la motilité des cellules tumorales [48]. EMT est régi par différentes voies de signalisation oncogènes tels que AKT et NF-kB [49], [50]. Plus précisément, l'activation de NF-kB a été montré pour favoriser EMT tandis que l'inhibition de l'activité de NF-kB dans les cellules mésenchymateuses provoque une inversion de l'EMT [30]. Perte d'expression et le gain de l'expression de la vimentine E-cadhérine sont considérés comme des marqueurs moléculaires les plus importants de l'EMT [51]. TFs, comme escargots, limaces, ZEB1 et ZEB2, se sont révélés avoir un rôle critique. miARN ont des rôles clés dans la régulation du processus d'EMT. La famille miR-200 et miR-205 régulent EMT en ciblant ZEB1 et ZEB2, qui fonctionnent comme des répresseurs transcriptionnels de l'expression E-cadhérine, réduisant ainsi l'agressivité des cellules cancéreuses [52]. Une expression stable de miR-155 inhibe de manière significative les cellules de subir EMT et inhibe l'expression d'un certain nombre de gènes associés à l'induction de l'EMT [53]. La surexpression de CK2 a été impliqué dans la carcinogenèse et le développement du cancer colorectal par la régulation des gènes EMT liés [54]. L'activation de la CK2 et c-Rel induit EMT au moyen d'un récepteur d'hydrocarbures aryliques et limaces voie de signalisation [55]. Dans notre étude, la restauration de miR-1228 * supprimé EMT phénotype et réduit la migration des cellules de cancer de l'estomac, ce qui pourrait éventuellement attribuer à miR-1228 * downregulation médiée de l'activité de NF-kB et en ciblant l'expression de CK2A2.

Le ce travail identifie miR-1228 * comme un régulateur négatif de l'activité de NF-kB et met en évidence son rôle dans la répression EMT et la croissance du cancer de l'estomac, suggère que la restauration sélective de miR-1228 * pourrait être bénéfique pour le traitement du cancer gastrique.

Informations complémentaires
Figure S1.
Effet de miR-1228 * sur EMT dans les cellules AGS. (A) Western analyse par transfert de marqueur épithélial E-cadhérine et le marqueur mésenchymateuses vimentine dans miR-1228 * stables transfectées des cellules et le contrôle AGS. essai de migration (B) Transwell a montré que les cellules AGS stables transfectées avec miR-1228 * avaient plus faible potentiel migratoire dans Comparer avec miR-NC (× 100)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0058637.s001
( DOC)

Les auteurs remercient le Dr Remerciements Yongliang Zhu dans Second hôpital affilié de Zhejiang University College of Medicine pour l'assistance technique.

• PLOS ONE: surexpression de CD151 Prédit pronostic des patients avec cancer gastrique réséqué
• Paclitaxel activité antitumorale supérieure de Nanoparticules Albumine-Bound in Experimental Cancer gastrique