PLoS ONE: Kraujagyslių CXCR4 išraiška - romano antiangiogeniniai Tikslinė skrandžio vėžio

Anotacija

Fonas

G baltymu sujungto receptoriai (GPCRs) yra pagrindiniai kandidatai naujų vėžio prevencijos ir gydymo strategijas. Mes ieškoma skirtingai išreikštas GPCRs mazge teigiamų skrandžio karcinoma.

Metodologija /Pagrindinės išvados

diferencinė ekspresija GPCRs į tris mazgo teigiamą vs trijų mazgų neigiamas žarnyno tipas skrandžio karcinoma buvo analizuojami genų masyvo technologija. Kandidatės genai CXCL12 ir jo receptorių CXCR4 buvo patvirtintas realaus laiko atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos nepriklausomai rinkinį 37 skrandžio karcinoma. Vertimas buvo tiriamas imunohistocheminiu 347 skrandžio karcinoma, naudojant audinių mikrogardelių taip pat metastazių limfmazgiuose 61 atitikimo. Baltymų raiška koreliavo su klinikos pacientų charakteristikas ir išlikimui. 52 GPCRs ir GPCR susiję genai buvo aukštyn arba žemyn reguliuojama mazgo teigiamą skrandžio vėžio, įskaitant CXCL12. Skirtumas išraiška CXCL12 buvo patvirtinta RT-PGR ir koreliuoja su vietos naviko augimui. CXCL12 immunopositivity buvo neigiamai susijęs su tolimų metastazių ir naviko laipsnio. Tik 17% skrandžio karcinomos parodė, CXCR4 imunoteigiamų auglio ląstelių, kurios buvo susijęs su didesne vietos naviko mastu. 29% skrandžio karcinoma parodė CXCR4 teigiamas naviko kraujagyslėms. Kraujagyslių CXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su didesne vietos naviko poveikio, taip pat aukštojo UICC-etapais. Kai išreikšti tiek, CXCL12 naviko ląstelėse ir CXCR4 naviko kraujagyslėms šie navikai taip pat buvo labai smarkiai susijęs su didesne T- ir UICC-etapais. Trys limfmazgių metastazių atskleidė kraujagyslių CXCR4 išraiška, o naviko ląstelės visiškai trūko CXCR4 visais atvejais. Iš CXCL12 ir CXCR4 išraiška neturėjo įtakos pacientų išgyvenimo.

Išvados /Reikšmė

Mūsų rezultatai pagrįsti GPCRs reikšmę nuo skrandžio karcinoma biologijos ir pateikti įrodymus, kad CXCL12-CXCR4 kelias gali būti romanas perspektyvus antiangiogeninio taikiniu skrandžio karcinomos gydymui

nurodomoji dalis:. Ingold B Simonas E Ungethüm U Kuban RJ, Mülleris BM Lupp A et al., (2010) Kraujagyslių CXCR4 išraiška - romano antiangiogeniniai Tikslinė skrandžio vėžio? PLoS ONE 5 (4): e10087. Doi: 10,1371 /journal.pone.0010087

redaktorius: Irena oi Lin ng, Honkongo universitetas, Honkongo

Įstojo rugsėjo 22, 2009 m Priėmė: Kovo 16 ", 2010; Paskelbta: Balandžio 8, 2010

Visos teisės saugomos: © 2010 Ingold et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijų Berliner Krebshilfe (Berlyno Canceraid). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje, reitingai ketvirtą bendrą dažnį ir sudaro daugiau nei 650.000 mirčių per metus [1]. Skrandžio vėžio mirtingumo yra įvaldęs tik plaučių vėžio. Ankstyvas skrandžio vėžys dažnai nesukelia jokių specifinių simptomų. Iš ankstyvųjų simptomų nebuvimas atitolina diagnozę. Todėl, 80-90% Vakarų pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu šiuo metu su pažangių navikų, kai vietos ar tolimi metastazių jau įvyko [1]. Limfmazgių būklė, ypač metastazių-teigiamas /metastazės neigiamas limfmazgių santykis, yra stipriausia prognostinis faktorius skrandžio vėžio [2]. 5 metų išgyvenamumas pacientams, sergantiems 1-6 limfmazgių metastazių limfmazgiuose yra 44% ir baigiant tik 11% pacientams, kuriems daugiau nei 15 teigiamų limfmazgiai. Dalinis ar visiškas skrandžio pašalinimas, kartu su palaikomąja radioterapija ir /ar chemoterapija, kaip nurodyta, žada visiškai išgydyti tik pacientams su ankstyvos stadijos ligą. Be metastazavusio, šiuo metu naudojamas spindulinės terapijos ir chemoterapiniai režimai turi prasta veiksmingumas ir gydymas atsparus ligos progresavimo veda į mirtį per kelis mėnesius [3]. Iki šiol nėra jokio konkretaus nuspėjimo žymeklį kaip HER2 krūties karcinoma, EGFR nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžio arba "K-RAS į gaubtinės ir tiesiosios žarnos karcinoma, kuri leidžia labiau individualizuotą gydymo strategiją. Todėl naujų molekulinės orientuojasi gydymo metodai yra reikalingi.

G-baltymu sujungto receptoriai (GPCRs) atstovauja iki šiol didžiausio šeimos ląstelių paviršiaus molekulių, kurios relės signalai per GTP surišančio baltymo (G-baltymo ) -initiated antrojo mesendžerio kaskadų į ląstelę [4]. GPCRs reguliuoja daugelį agonistais, bet visi turi tas pačias savybes branduolį sudaro septyni transmembranines alfa-spiralės, kuri sieja tris vidaus ir trijų ekstraląsteliniuose kilpų. Šie receptoriai kontroliuoti pagrindines fiziologines funkcijas, įskaitant impulso, hormonų ir fermentų išsiskyrimą iš endokrininių ir egzokrininės liaukos, imuninės reakcijos, raumenų susitraukimą ir kraujospūdžio reguliavimo ir malonumui [4].

piktybinių ląstelių dažnai pagrobti normalų fiziologinį funkcijos GPCRs išgyventi, daugintis savarankiškai ir išvengti imuninę sistemą. Be to GPCRs vaidinti pagrindinį vaidmenį navikų sukeltos angiogenezę ir vėžio metastazių. Daug kietos navikai remtis GPCRs, siekiama sukelti angiogeninf atsaką arba veikdamas endotelio arba stromos komponentų tiesiogiai arba per reguliavimo išleidimo į aplinką ar veiklos kitų angiogeninių tarpininkų, pvz kaip kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) arba pagrindinis fibroblastų augimo faktoriaus (bFGF) pagal stromos ir imuninės ląstelės [5]. Vėžio ląstelės manipuliuoti GPCRs pritraukti endotelio ląsteles ir sukelti jiems įsiveržti į auglio masę, taip formuojant naujus laivus teikti maistinių medžiagų ir deguonies. Daugelis vėžio metastazuoti į konkrečius organus, ką dažnai sukelia nukrypusiu nuo normos išraiškos GPCRs į vėžines ląsteles - ypač chemokino receptorių - gretutinės su chemokinus išsiskyrimą iš antrinių organų [6]

Narkotikų pristatymas, navikas vaizdavimo. ir biologiniai žymenys prognozuoti piktybinių navikų yra taikymas GPCRs pabrėžti: radioaktyviu izotopu žymėto peptidų, kad jungiasi prie GPCRs gali turėti plačias paraiškas vėžio diagnozės ir gydymo [7]. Ligandų, kad jungiasi GPCRs taip pat buvo konjuguoto su citotoksiniais preparatais konkrečiai taikyti pagal vėžinių ląstelių, kad superekspresuotų šiuos receptorius, todėl sumažinti šalutinį poveikį [8]. Be to, GPCRs gali būti vertingi biologiniai žymenys dėl vėžio diagnozę, nes įrodyta tyrimais, prostatos vėžio [9].

Todėl siekiama (i) įvertina skirtingai išreikštas GPCRs į mazgų neigiamas, palyginti su mazgo teigiamą žarnyno tipo skrandžio karcinoma pagal GeneChip masyvo technika. (II) Transkribavimas kandidačių genų buvo patvirtintas realaus laiko atvirkštinio transkripcija polimerazės grandininė reakcija (realaus laiko AT-PGR). Mes įvertino vertimą ir histoanatomical paskirstymą chemokino CXCL12 ir jo atitinkamą chemokino receptorių CXCR4 didelėje serijos 347 skrandžio karcinoma mėginių immunohistochemically naudojant audinių mikrogardeliq technologijų, taip pat į 61 atitikimo limfmazgiuose metastazių apie įprastinių skaidres (III). Mes koreliuoja transliacijos raiškos modelius su gausaus rinkinį klinikos pacientų charakteristikas, įskaitant pacientų išgyvenimo (IV).

Rezultatai

Diferencialo genų ekspresija mazgas neigiamas ir teigiamas mazgas skrandžio vėžio audinių pervežimas

Pirmiausia, mes studijavo diferencialinę išraišką mRNR per 6 žarnyno tipo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams serija (3, ir 3 be metastazių limfmazgiuose), naudojant GeneChip® žmogaus genomo U133 Plus 2.0 Array nuo Affymetrix kuri aptinka 47000 nuorašai ir jo atmainos taip pat kaip 38.500 pat būdingas žmogaus genai. mRNR buvo ekstrahuojamas ir transkripcija tik iš audinių pavyzdžiais, gautais iš pirminių auglių. A 115 nuorašai iš viso buvo nustatyta, kad aukštyn ir 219 turi būti žemyn reguliuojama mazgo teigiamą skrandžio vėžiu, palyginti su mazgo neigiamų skrandžio vėžio (lentelė S1). Kitas mes ieškoma skirtingai išreikštas GPCRs. Mes nustatė 52 GPCRs ir GPCR susijusius genus, kurie buvo aukštyn arba žemyn reguliuojama kartų kaitos veiksnį > 1.5. (Lentelė s2)

silikochromatas pervežimas analizės

Mes tada ieškoma ENTREZ
duomenų bazė " Nacionalinės centro biotechnologijos informacija (NCBI) UAB" įrašų iš GPCRs ir GPCR ligandų ir jų spėjamas vaidmuo naviko biologijos , Iš angiotenzino II tipo 1-receptoriumi skrandžio vėžio reikšmė anksčiau buvo patikrinti mūsų pačių grupės [10]. Keletas tyrimų parodė, kad Duffy kraujo grupės chemokino receptorių raiška (Darc) koreliuoja atvirkščiai paplitimą ir prognozės prostatos vėžio [11] - [13]. Į gyvūnų modelyje krūties vėžiu EDG2 išraiška koreliuoja su plaučių metastazių [14] dažnis. FPRs tarpininkauti aneksino 1 poveikį ląstelių judrumui ir invazijos, kurios yra svarbios metastazavusiu potencialo vėžinių ląstelių [15]. LGR5 neseniai buvo įrodyta, kad kamieninių ląstelių žymuo ląstelių plonosios žarnos ir storosios žarnos ir kamieninių ląstelių konkretus nuostolis APC rezultatus pamažu augančių neoplasias [16]. Bendrai, šie duomenys pateikti įrodymų, kad mūsų požiūris nustatė GPCRs ir GPCR ligandų, kurie gali būti susiję su skrandžio vėžio biologija. Dėl chemokino receptorius ir chemokinus, iš chemokinus CCL2 ir CXCL12 išraiška buvo padidintas mazgų teigiamą skrandžio vėžiu, palyginti su mazgų neigiamų atvejų (papildoma lentelė S2). Kadangi CXCL12-CXCR4 ašis vaidina svarbų vaidmenį tumorogenezės, skatinti angiogenezę ir migracijos vėžinių ląstelių metastazių vietose [17] - [19], mes išrinkome CXCL12 ir jo receptorių CXCR4 išsamesnei analizei

transkriptazės. CXCL12 ir CXCR4 skrandžio vėžio

skirtumas išraiška CXCL12- ir CXCR4 mRNR buvo patvirtintas realaus laiko AT-PGR nepriklausomai rinkinį 37 žarnyno tipo skrandžio karcinoma pavyzdžius. Mes palyginti ne neoplastinį gleivinę su pirminio naviko, taip pat pirminius auglius mazgas neigiamą su pirminių navikų mazguose teigiamų vėžio.

CXCL12 išraiška buvo žymiai padidėjęs skrandžio karcinoma, palyginti su ne neoplastiniu gleivinės (p = 0,033 ). Patvirtindamas masyvo duomenis, CXCL12 sąvoka taip pat buvo-reguliuojami mazgų teigiamą skrandžio karcinoma, palyginti su mazgų neigiamų atvejų. Tačiau, šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmę (p = 0,132; figūra 1A). Dėl vietos naviko augimą, nebuvo reikšmingo skirtumo CXCL12 raiškos PT1 /T2 stadijos auglys palyginti PT3 /T4 navikai. Bet įdomiai, CXCL12 išraiška rodė didelę asociaciją PT1 /pT2a palyginti pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; 1b paveikslas)

nebuvo nei iš CXCR4 išraiška skirtumas skrandžio karcinoma, palyginti su ne neoplastiniu audinio. (p = 0,229), nei mazgų neigiamas, palyginti su mazgo teigiamą skrandžio karcinoma (p = 0,22; 1c paveikslas). Lyginant CXCR4 išraišką su vietos naviko mastu CXCR4 iRNR kiekis padidėjo su vietos naviko augimą. (P = 0,079; figūra 1d)

vertimas CXCL12 skrandžio karcinoma, koreliacija su klinikos parametrus ir išlikimo analizuoja

vertimas ir histoanatomical platinimas CXCL12 vėliau buvo tiriamas imunohistocheminiu 347 skrandžio karcinoma pavyzdžius. 291 atvejais CXCL12 reaktyvumas buvo išmatuojamą. Auglio ląstelių išreikštas CXCL12 į 244 291 (84%) mėginius. Stiprus citoplazmos ir membraninis imuninė reakcija buvo pastebėtas 143 (49%) atvejais ir silpna dažymą 101 (35%). 47 auglių (16%) neturėjo CXCL12-reaktyvumas. Visi navikų mėginiuose parodė ryškų CXCL12 pozityvumo iš kraujagyslių endotelio ląstelių, kurios tarnavo kaip vidaus teigiamos kontrolės (2a pav-C). Statistinės analizės parodė reikšmingą koreliaciją tarp CXCL12 išraiška vėžinių ląstelių ir tolimų metastazių (p = 0,043), taip pat naviko laipsnio (p = 0,0064). Visi kiti klinikos parametrai nebuvo susijęs su CXCL12 raiškos vėžinių ląstelių (1 lentelė). Kai dalijant kohortos į dvi grupes, t.y. žarnyno tipo ir difuzinis tipas skrandžio karcinoma, ne koreliacija buvo nustatyta tarp CXCL12 saviraiškos ir bet klinikos parametras vienoje grupėje (duomenys neparodyti). CXCL12 išraiška vėžinių ląstelių neturėjo įtakos pacientų išgyvenamumas (visa grupė: p = 0,830; žarnyno tipas karcinoma: P = 0,766; difuzinis tipo karcinoma: p = 0,817).

vertimas CXCR4 skrandžio karcinoma, koreliacija su klinikos parametrus ir išlikimo analizuoja

vertimas CXCR4 taip pat buvo tiriamas imunohistocheminiu. Reaktyvumas naviko ląstelėse buvo išmatuojamą 293 navikų mėginiuose, iš kurių tik 6 (2%) parodė nedviprasmišką membraninis dažymo (2+ kategorija; figūra 2d). Dauguma CXCR4 teigiamas naviko egzempliorių tik atskleidė silpną citoplazmos CXCR4 reaktyvumas (1+ kategorija, 44 atvejais 15%; figūra 2e). Branduolinės CXCR4 reaktyvumas nebuvo pastebėta bet kuriuo atveju ir bet ląstelių tipo. Kurio 83% (243 iš 293), skrandžio karcinoma bendras buvo immunonegative už CXCR4, dauguma jų rodo, kartu vartojantiems CXCR4 teigiamų leukocitų kaip vidaus teigiamos kontrolės (pav 2f). Įdomu tai, kad kaip ir anksčiau pastebėtas storosios žarnos karcinoma, 86 293 skrandžio karcinoma (29%) parodė CXCR4 teigiamų Mikrokraujagysles į naviko stromos su stipriu CXCR4 reaktyvumas endotelio ląstelių (3a pav.) Kraujagyslių pobūdis šių subtilių struktūrų buvo patvirtinta CD34 imunodažymu (3b pav).

koreliacijos CXCR4 išraišką vėžinių ląstelių su įvairiais klinikos parametrų, CXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su didesne vietos naviko kiek (T-statusas; p = 0,030). Tačiau jokių kitų asociacijų auglio CXCR4 saviraiškos ir kitų klinikos kintamųjų buvo nustatyta (2 lentelė). Analizuojant žarnyno tipo skrandžio karcinoma pogrupį, jokių asociacijų buvo rasta su bet klinikos parametro (duomenys neparodyti).

Tada mes studijavo tarp CXCR4 išraiška endotelio ląstelių (kraujagyslių CXCR4 išraiška, vCXCR4) naviko koreliaciją mikrokraujagyslės ir įvairių klinikos parametrai. Įdomu tai, kad CXCR4 išraiška mikrokraujagyslių koreliuoja labai žymiai su vietos naviko augimui (T-kategoriją; p = 0,0001), taip pat su UICC-navikas etapas (p = 0,0059). Net ir žarnyno tipo ir difuzinio tipo skrandžio karcinoma pogrupius, vCXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su vietos naviko kiek (žarnyno tipas: p = 0,004; difuzinis tipas: p = 0,030) ir UICC-naviko stadijos (žarnyno tipo: p = 0,020) , Be to, vCXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su paciento amžių, (p = 0,0148) į visos grupės (3 lentelė).

išgyvenimo analizė parodė, kad CXCR4 išraiška auglio ląstelėse skrandžio karcinoma, taip pat naviko mikrokraujagyslių neturėjo jokio poveikio . išgyvenimo pervežimas

kartu CXCL12 /vCXCR4 raiškos skrandžio karcinoma

Kadangi CXCL12-CXCR4 ašies buvo įrodyta, kad būti įtraukti į naviko progresavimo [17] - [19], mes ištirti ryšį iš kartu išraiška CXCL12 ir vCXCR4 su klinikos parametrus. Iš tiesų, CXCL12-vCXCR4 teigiami navikai buvo susijęs su didesne vietos naviko kiek (p = 0,0014) ir aukštojo UICC etapais (p = 0,017). Tačiau tai neturėjo įtakos pacientų išgyvenimo, net žarnyno ir difuzinio tipo skrandžio karcinoma pogrupius.

išraiška modelio CXCL12 ir CXCR4 derančios limfmazgių metastazių

CXCL12-CXCR4 ašių buvo pranešta, kad dalyvauja metastazavusiu procesus įvairiose naviko subjektams. Todėl mes išnagrinėjo CXCL12 ir CXCR4 reaktyvumas į metastazių limfmazgiuose 61 atitikimo pogrupyje. CXCL12 išraiška modelis buvo skirta 46 metastazių. Apskritai, 4 limfmazgiuose metastazių buvo CXCL12 neigiamas kaip ir jų atitinkamą pirminio naviko. 40 metastazių limfmazgiuose parodė aiškų CXCL12 pozityvumo pagal pirminio naviko. Dažymo intensyvumas buvo labai nevienalytė rodo stipriai teigiamą navikines ląsteles ribojasi su silpnai tamsintas naviko ląstelių branduoliai. Tačiau du metastazių atskleidė CXCL12 reaktyvumas, nors joks CXCL12 išraiška buvo aptikta pirminio naviko.

CXCR4 reaktyvumas buvo įvertintas 54 metastazių limfmazgiuose. Įdomu tai, kad nė vienas iš jų buvo bent CXCR4 išraiška. Net ir tie navikai (n = 6), rodo silpną CXCR4 pozityvumo į pirminio auglio, trūko CXCR4 išraišką atitinkamų limfmazgiuose metastazių. Tačiau visi metastazių limfmazgiuose aiškiai atskleidė CXCR4 teigiamų limfocitus, kurie tarnavo kaip vidaus teigiama kontrole. Įdomu tai, kad trimis atvejais intratumoural CXCR4 teigiami mikrokraujagyslės buvo aptikti.

Diskusijos

G baltymu sujungto receptorių sudaro didžiausią šeimą transmembranines receptorius. Penki procentai visų žmogaus genų kodą daugiau nei 800 skirtingų GPCRs ir maždaug 80 skirtingų ligandų buvo nustatyta iki šiol [20]. GPCRs yra dažniausi farmakologiniai tikslai medicinoje, t.y. beveik 30% visų vaistų yra nukreipti prieš GPCRs. Įrodymai didėja, kad GPCRs taip pat gali būti perspektyvūs tikslai vėžio gydymo. Šiame tyrime siekėme rasti GPCRs, kurie skirtingai išreikštas mazguose teigiamų skrandžio vėžio ir todėl gali būti laikomi ateities tikslus skrandžio vėžio gydymo. Mes nustatėme, 52 GPCRs ir GPCR susijusius genus, kurie yra aukštyn arba žemyn reguliuojama mazgo teigiamą pirminės skrandžio vėžio audinyje lyginant su mazgo neigiamas vėžio. Keletas GPCRs anksčiau buvo įrodyta, kad būti įtraukti į naviko biologijos, pavyzdžiui, AT1R, EDG2, Darc ir FPR1 [10], [11], [14], [15]. Įdomiausia, mūsų sąraše taip pat įtraukti LGR5 [16], kuri neseniai buvo įrodyta, kad kamieninių ląstelių žymeklis plonojoje žarnoje ir storosios žarnos. Be to, konkretus nuostolis APC į LGR5 teigiamas ląsteles rezultatų palaipsniui auga neoplasias. Taigi, silikochromatas pervežimas įteisinimo mūsų duomenų palaikė hipotezę, kad GPCRs dalyvauja naviko biologijos skrandžio vėžio.

Mūsų patvirtins tyrimai, naudojant nepriklausomų pacientų grupėje parodė, kad GPCR- ligandas CXCL12 yra išreikšta naviko ląstelių skrandžio karcinomos dauguma. Be to, CXCL12 išraiška neigiamai susijęs su tolimų metastazių ir naviko laipsnio. Priešingai, tik 17% skrandžio karcinomos parodė, CXCR4 imunoteigiamų auglio ląstelių, kurios buvo susijęs su didesne vietos naviko mastu. Įdomu tai, kad apie trečdalis skrandžio karcinoma parodė CXCR4 teigiamas naviko kraujagyslėms. Kraujagyslių CXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su didesne vietos naviko poveikio, taip pat aukštojo UICC-etapais. Kai išreikšti tiek, CXCL12 naviko ląstelėse ir CXCR4 naviko kraujagyslėms šie navikai taip pat buvo ženkliai susijęs su didesne T- ir UICC-etapais, padedant vykdyti CXCL12-CXCR4 ašies vaidmenį neoangiogenesis skrandžio vėžio.

tarp GPCRs, chemokino valdymo sistema smarkiai prisideda prie auglio progresavimo per moduliavimo vietos uždegiminė reakcija, naviko ląstelių dauginimosi, migracijos ir išlikimo taip pat neoangiogenesis [4]. Chemokino receptoriaus CXCR4 iš pradžių buvo nustatyta, kad reguliuoti limfocitų dažniais uždegimas ir reiškia co-receptoriaus žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) [21]. Fiziologiškai, CXCL12-CXCR4 ašis dalyvauja migracijos embrioninių ląstelių centrinę nervų sistemą, kaulų čiulpų ir širdies [22], [23]. Ji vaidina svarbų vaidmenį metastazavusiu procesus, kaip parodyta krūties [24], [25], kiaušidžių [26] ir prostatos vėžio [27] ir CXCL12 yra labai išreikštas organų, kurie dažnai svetainės tolimų metastazių kaip plaučių, kepenų ir limfos mazgai [28]. Skrandžio karcinoma, duomenys apie CXCL12-CXCR4 kelias yra negausūs [29]. Yra įrodymų, kad CXCR4 išreikšti skrandžio karcinomos labiau tikėtina sukurti peritoninė plitimą naviko ir Piktybinis ascitas yra didelės koncentracijos CXCL12 [30].

Lyginant mūsų genų masyvo duomenis, gautus RT-PGR ir imunohistocheminis, buvo įdomu pastebėti, kad skirtumas išraiška CXCL12 mazge teigiamą skrandžio karcinoma buvo patvirtinta transkripcijos bet ne pritaikymo lygį. Čia imunohistochemiškai nustatyti CXCL12 naviko ląstelėse susijęs tik su tolimų metastazių ir naviko laipsnio, bet ne su mazgo plitimą. Tačiau, CXCL12 buvo nustatyta, ne tik auglio ląstelėse, bet taip pat ir endotelio ir stromos ląstelių [31], ir bendrą išraiškos visą audinių sluoksniuose yra sunkiau įvertinti imunohistocheminiu. Priešingai, mūsų transkripcijos tyrimai naudojami audinių homogenatai kurie integruoti visus CXCL12 išreiškė naviko ląstelės audinį. Nepaisant to, jis turi būti laikomas omenyje, kad genų transkripcija ne visada koreliuoja su iRNR vertimą ir kad auglys biologinis poveikis CXCL12 taip pat gali priklausyti nuo buvimo ir histoanatomical paskirstymo CXCR4. Grįsdama šį teiginį, mes galėjome parodyti, kad kartu išraišką CXCL12 naviko ląstelių ir CXCR4 į naviko kraujagyslėms koreliuoja su vietos naviko augimui ir UICC-auglio stadijoje.

Buvo pranešta, kad tumoural CXCR4 pozityvumo reikšmingai koreliuoja su peritoninės karcinomatoze [30] plėtros. Be to, stipri CXCR4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su limfmazgių metastazių, aukštojo UICC etapus ir sumažintą 5 metų išgyvenamumas [32]. Mūsų rezultatai atrodo skiriasi nuo šių ankstesnių tyrimų. Vertinant CXCR4 reaktyvumas į auglio ląsteles, buvo pastebėtas mažas išraiška rodiklis. Tik 17% navikų mėginiuose parodė daugiausia silpną CXCR4 reaktyvumas. Be to, visi limfmazgiuose metastazių 61 atitikimo trūko CXCR4 išraiška. Tai dažymo modelis gali paaiškinti, kodėl pavyzdžiui žarnyno tipo skrandžio karcinoma, CXCR4 išraiška tik buvo reikšmingai susijęs su vietos naviko augimą (T kategorijos), bet ne su kitais klinikos veiksnių kaip buvo aprašyta anksčiau. Mes naudojome kruopščiai būdingas CXCR4 antikūno su didesniu specifiškumu, nei komerciškai prieinamų antikūnų kaip parodyta Fisher su kolegomis [33]. Tai skirtumas specifiškumo gali tarnauti įvairiems dažymo modelius. Pavyzdžiui, atominės CXCR4 išraiška, kuri buvo pranešta, kad būti susijęs su limfmazgių metastazių į gaubtinės žarnos vėžio, nebuvo matyti mūsų serijos [34]. Be to, mes niekada aptikta CXCR4 teigiamas, stromos ląstelėse, kaip aprašyta iš Saigusa ir kolegų [35] tyrime. Siekiant paaiškinti, jei CXCR4 CXCL12 kelias galiausiai prisideda prie kartos metastazių skrandžio karcinoma, ypač limfinių metastazes mazgas, yra reikalingi tolesni tyrimai.

Apie trečdalis tirtų skrandžio karcinoma parodė CXCR4 teigiamą naviku aplinkinių Mikrokraujagysles , Augliai ląstelės reikalauja pakankamą deguonies ir maistinių medžiagų išlaikyti išlikimą. Net su genetiniais sutrikimais, kad dysregulate augimą ir išlikimą atskirų ląstelių navikai negali padidinti po 1-2 mm ^{3 be kraujagyslių sistemą ir hipoksija sukelta ląstelių žūva. Ji buvo parodyta, kad CXCR4 yra išreiškiamas endotelio ląstelių ir stimuliacijos CXCR4 pagal CXCL12 turi proangiogenic poveikį [36]. Be to, CXCR4 yra hipoksija indukuojamąją genas, reglamentuoja hipoksija sukeltos faktoriaus 1α (HIF1α). Kai deguonies trūksta, kaip ir sparčiai augančių navikų, HIF1α pagerina išraiška CXCR4 [37]. Padidėjęs išraiška CXCR4 nagrinėtuose mūsų naviko kolektyvo endotelio ląstelių gali būti integruoto hipoksinio atsakas į augantį auglį, kuris leidžia už naujų kraujagyslių susidarymo. Mūsų tyrimo grupės, kraujagyslių CXCR4 išraiška labai koreliuoja su vietos naviko augimo mastą. 8% t1 /pT2a navikų (4 iš 52), o 34% T2B /T3 /PT4 navikų (81 239) CXCR4 teigiami mikrokraujagyslės buvo aptikti. T2B /T3 /T4 stadijos skrandžio karcinoma dažniau priglausti hipoksinio mikroaplinka nei T1 /T2a etapo navikų ir taip gali sukelti CXCR4 genų ekspresiją bei angiogenezę. Aptikta CXCR4 teigiamų kraujagyslėms dideliais metastazių limfmazgiuose (> 9 mm skersmens) patvirtina šias pastabas. Be to, mes jau anksčiau parodė palyginamus rezultatus gaubtinės ir tiesiosios žarnų karcinoma [38]. Be to, kaip parodyta glioblastoma [39], navikų mėginiuose, atskleidžiantys tiek CXCL12 teigiamas naviko ląsteles ir CXCR4 teigiamų Mikrokraujagysles buvo labai reikšmingai susijęs su aukštos vietos naviko apimtį ir aukštos UICC etapais, toliau remiant funkcinio CXCL12-CXCR4 ašies reikšmę skrandžio vėžio biologija}

Apibendrinant, mes parodome, kad GPCRs yra skirtingai išreikštas skrandžio vėžio audinyje ir gali prisidėti prie naviko biologijos. navikai išreikšti tiek, CXCL12 naviko ląstelėse ir CXCR4 naviko aplinkinių mikrokraujagysles, rodo labai reikšmingas ryšys su vietos naviko augimui ir UICC etapais. Šie rezultatai, kartu su mūsų ankstesnių duomenų apie storosios žarnos karcinoma, pagrįsti iš CXCL12-CXCR4 ašies vaidmenį navikų neoangiogenesis virškinimo trakto navikų. CXCL12-CXCR4 kelias gali būti naujas perspektyvus antiangiogeninio taikiniu skrandžio karcinomos gydymui.

Medžiagos ir metodai

navikų mėginiai

Audinių mėginiai skrandžio vėžio buvo gauti chirurginiu būdu ne Charite universiteto ligoninės Berlynas (1995-2008). Šviežia sušaldyta audinių 6 atvejais žarnyno tipo skrandžio karcinoma buvo naudojamas GeneChip analizė (mazginis neigiamas: 3 pacientams; mazgų teigiami: 3 pacientams; moteriškas Vyriška santykis: 01:02). Nepriklausomas serijos suporuotas vėžinių ir naviko greta įprastų audinių iš 37 žarnyno tipo skrandžio karcinoma išnagrinėjo realiu laiku RT-PCR (mazginis neigiamas: 12 ligonių; mazgų teigiami: 25 pacientus; moterų-vyrų-santykis: ~1:1 , už išsamius pacientų charakteristikos matyti lentelė S3). Dėl Imunohistocheminiais analizių, buvo ištirta, pacientas kohortos 347 pacientų eilės, kurių skrandžio vėžio, kurį sudaro 194 žarnyno tipo ir 122 difuzinių tipo karcinomos Pasak Lauren klasifikacija. 31 mėginiai parodė kitų histologinių potipių (t mucinous, vamzdiniai, nediferencijuotą). Trumpai tariant, kohortos sudarė 220 vyrų ir 127 moterų. Vidutinis pacientų amžius diagnozės metu buvo 64 metai. Išgyvenimo duomenys buvo gauti iš 196 šių pacientų. Tolesni duomenys ir kitiems pacientams trūksta, nes šie pacientai buvo negyvena netoli ligoninės ir buvo prarasta tolesnius veiksmus. Iš 196 pacientų, 124 mirė per tolesnius. Stebėjimo trukmės mediana tiems pacientams gyvam analizės pasekmės buvo 33 mėnesių. 61 pacientų, audinių limfinių metastazių atitikimo mazguose buvo prieinama (27 žarnyno tipas, 26 difuzinis tipas, 8 kiti histologiniai potipiai). Tik pacientai su histologiškai patvirtinta skrandžio vėžio ir tinkamą audinį turimą buvo įtraukti. Pacientai, sergantys neoadjuvantly apdorotą skrandžio karcinoma ar kitų žinomų piktybinių navikų buvo pašalinti iš tyrimo. Šis projektas buvo patvirtintas vietos etikos komiteto (teisėjas. Numeris EA1 /06/2004).

GeneChip analizė

Viso RNR buvo išskirta fenolio-chloroformo naudojant mirVana ™ Mirna išskyrimas komplektas ( Ambion, Ostinas, JAV). Užteršimo DNR buvo pašalintas DNaze gydymo (Turbo DNAfree rinkiniu; Ambion, Austin, JAV), esant 37 ° C temperatūroje 30 min. Mes naudojome GeneChip® žmogaus genomo U133 Plus 2.0 matricos (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą analizuoti iRNR raiškos lygį. Affymetrix GeneChip® Operacinė programinė įranga (GCOS 1.4) automatizuoja GeneChip® Fluidics stotys ir GeneChip® Skeneriai 3000.
kontrolę

Bioinformatikos

Žalios duomenys buvo analizuojami su Affymetrix GeneChip operacinės sistemos programinė įranga (GCOS 1.4) , Aptikimo p-reikšmė iš stenograma lemia aptikimo skambutį, kuris parodo, ar stenograma yra patikimai nustatyti (p < 0,05; dabar), ar ne aptiktą (nebūna). Tam, kad tarp žetonų duomenys buvo mastelis pasaulio intensyvumo 500. duomenų gavybos įrankių 3.0 (Affymetrix) ir GeneSpring programinės įrangos paketo 7.2 (Si genetika, Redwood City, Kalifornija) palyginti buvo naudojami vidutiniškai rezultatus iš skirtingų mėginių ir atlikti statistinę analizė lyginti skrandžio vėžio (N1) ir be metastazių (N0) limfmazgis. Šešių masyvų duomenys buvo standartizuoti sudaro kintamumą hibridizacijos už zondas porų ir kitų hibridizacijos artefaktų. Normalizavimo susideda iš šių trijų etapų: pirma, duomenų transformavimo (SET matavimai mažiau nei 300,0 iki 300,0); antra, už lustą (normalizuoti kiekvieną mikroschemą į 50 procentilių atliktų matavimų nuo tos mikroschemos); ir trečia, už geno (normalizuoti kiekvieną geną į per šią geno matavimų mediana). Sulenktas pokytis buvo apskaičiuojamas kiekvieno geno kaip aritmetinis vidurkis iš normalizuotų raiškos vertybių N1, padalinta iš aritmetinio vidurkio normalizuotų raiškos vertybių N0. Žalios duomenys microarray eksperimentų buvo įkeltas į genų ekspresijos Omnibus duomenų bazės (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininę reakciją

sintezei, 2 mikrogramų visos RNR buvo atvirkštinis transponuoti naudojant Omniscript RT rinkinį (QIAGEN). Geno-specifinius pradmenis buvo suprojektuotas BioTeZ Berlynas-Buch GmbH (Berlynas, Vokietija). Gruntas sekas buvo taip: CXCR4 5 "PVG PVG GTA GCA AAG TGA CG, 3 'PVG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 "CGA TTC TTC GAA" AGC CAT GT 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT PVG; beta2 mikroglobulinas 5 "ACC BMK AKTAS GAA" AAA GAT G., 3 ", ATC TTC AAA BMT CCA TGA TG. Realaus laiko atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (Realaus laiko PGR) buvo atliekamas naudojant QuantiTect ™ SYBR® Žalioji PCR Kit (QIAGEN) ir LIGHTCYCLER sistema (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija). Lyginamieji C _{t vertės buvo normalizuotas, kad iš namų ruošos genų beta2-mikroglobulinas. Nėra šablono kontrolė (nėra PGR kDNR) buvo skaičiuojamas kiekvienam geno aptikti nekonkrečios arba genomo sustiprinimą ir gruntą dimerizaciją.}

Histologija

histologinių analizių, audinių mėginiai buvo nustatytas 10% neutralizuotas formalinu ir įdėta į parafiną. Deparaffinized skyriai buvo dažomi hematoksilinu ir eozino. Skrandžio vėžys buvo klasifikuojami pagal klasifikacijos PSO [1]. PTNM etapas

Audinių Mikrogardelė statybos

formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų audinio mėginiai buvo naudojamas generuoti audinių mikrogardelių kaip aprašyta anksčiau [40], [41 buvo nustatomas pagal UICC gaires. ]. Trumpai tariant, buvo pasirinktos trijų iki šešių morfologiškai tipiškos sritys, parafino donoras blokus.

• PLoS ONE: Genų ekspresijos Parašai galima išskirti skrandžio vėžio rūšių ir Stages
• PLoS Genetics: mir-218 Slopina invazija ir metastazių skrandžio vėžio nukreipiant Robo1 receptorius