PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p veikia kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio ir reglamentuoja DNR Methylation

Anotacija

Fonas "& Tikslai

Skrandžio vėžys yra dažniausias virškinimo navikas suaugusiems ir yra labiausiai mirtina forma žmogaus vėžio. Nepaisant iš būdų gerinimas, pagrindinis mechanizmas skrandžio kancerogenezėje nėra gerai žinoma. Apibrėžti naujus moduliatoriai, kurios reguliuoja jautrumą tumorgenesis, mes sutelktas į miR-219-2-3p.

Metodai

Kiekybinė PGR dirbo ištirti PPN-219-2 lygį -3p skrandžio vėžio (GC) audiniai (n = 113) ir jų suderintos gretimuose normaliuose audiniuose (n = 113). In vitro ląstelių proliferaciją, apoptozę tyrimai, ląstelių migracija, ir invazija tyrimai buvo atliekami siekiant išsiaiškinti biologinį poveikį PPN-219-2-3p. Nuo triukšmo slopinimo nuo Mirna iki promotoriaus CpG salos metilinimo gali būti svarbus mechanizmas tumorgenesis, GC ląstelės buvo gydomi 5-aza-2'-deoksicitidino ir trichostatin A, ir išraiška pokyčių PPN-219-2-3p vėliau buvo nagrinėjamas kiekybinis AT-PGR. Galiausiai, metilinimas statusas CpG salos prieš srovę miR-219-2-3p buvo

Rezultatai

Pasaulis-219- analizuojami metilinimo konkrečių PGR GC audinių (n = 22). 2-3p buvo žemyn reguliuojama GC ir ląstelių linijų. Be to, eksperimentai dokumentais apatinę išraišką PPN-219-2-3p GC egzempliorių su aukštesnio lygio ir vėliau navikų. Tuo tarpu, PPN-219-2-3p darė proliferaciją slopinančius, proapoptotic ir antimetastatic vaidmenis ir p-ERK1 /2 mažesnius lygius GC ląsteles. Be to, 5-aza-2'-dezoksicitidino ir trichostatin padidino išraišką (~2 kartus) PPN-219-2-3p GC ląsteles. Pagal metilinimo-specifinis PGR, DNR metilinimas kad prieš tai atliekamoje regione miR-219-2-3p buvo aptikta tiek gretimuose normaliuose audiniai ir vėžio audiniai. Kaip ir tikėtasi, metilinimas lygis buvo gerokai didesnis Mir-219-2-3p žemyn reguliuoja grupę kaip iki reglamentuojamo grupei.

Išvados

Pasaulis-219-2-3p yra potencialiai dalyvauja skrandžio vėžio progresavimo ir metastazių reguliuojant ERK1 /2-susijusius signalo kelius, kurie gali suteikti romaną gydymo strategiją gydyti skrandžio vėžio. Metilinimas mechanizmas gali būti įtraukti į moduliuoja raiškos lygis PPN-219-2-3p skrandžio vėžio

nurodomoji dalis. Lei O Zou D Li Z, Lo, M, L Dong Wang B ir kt , (2013) MicroRNA-219-2-3p veikia kaip auglio slopinamojo skrandžio vėžio ir reglamentuoja DNR metilinimas. PLoS ONE 8 (4): e60369. Doi: 10,1371 /journal.pone.0060369

redaktorius: Arunas Rishi Wayne State University, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gruodžio 14, 2012; Priėmė: Vasario 26, 2013 m Paskelbta: Balandžio 23, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 lėja et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos [2012, 91129716, kad JY] ir Pekino savivaldybės Mokslas & Technologijos Komisija [2010B071, kad JY]. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra 4 ^{-oji dažniausiai vėžio ir antrą aukščiausią priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje. Šiandien pacientai, sergantys vėlyvos stadijos GC yra su bendru 5 metų išgyvenamumas maždaug 20% ​​[1]. Vėžys išsivysto, kai jos buvo įvairių endogeninių ir egzogeninių priežasčių kaupimo rezultatas. Valgymo įpročiai bei Helicobacter pyloriinfection padidėjimas yra svarbūs išoriniai priežastys GC [2], o randama genetiniai, taip pat su maistu, lygiai hormono gastrino [3], ir kitų lėtinių skrandžio uždegimas sukeliančių veiksnių, į kuriuos būti susijęs su polinkį vėžio vystymąsi. Genų pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį GC, ir pakitimai daug onkogenų ir naviko slopintuvas genų jau pranešta GC.}

Kai prognostiniai naviko biologiniai žymenys GC, kaip antai žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2 ), kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR), kurie yra susiję su ligos charakteristikas ir todėl gali būti naudojamos, siekiant informuoti pacientą valdymą. Pavyzdžiui, pacientams, sergantiems navikų, išbandyti teigiamas HER2 gali būti gydomi trastuzumabu plius [4] chemoterapija, ir pacientams, kurių auglių, išbandyti teigiamas VEGF gali būti gydomi bevacizumabo plius chemoterapijos [5]. Tačiau molekulinius mechanizmus, kuriomis remiantis GC vystymas tebėra iššūkis, todėl papildomai informaciniai biologiniai žymenys yra skubiai reikia.

mikro RNR (Mirna) yra mažų RNR molekulių, dalyvaujančių reguliuojant vertimo ir degradacijos mRNR [6 klasė ]. MiRNAs jungiasi prie papildomų sekų 3 'neišverstų regionuose (UTR) jų tikslinių mRNR ir paskatinti iRNR savybių blogėjimą arba Pritaikomųjų represijas [7]. Labiausiai žinomi funkcijos miRNAs yra susiję su neigiamu genų reguliavimo: miRNAs tyla genų ekspresijos, paprastai trukdo iRNR stabilumui ar baltymų vertimas. Pastaraisiais metais miRNAs buvo manoma, kad veikia kaip onkogeno ar navikas slopinamojo geno, ir prisidėti prie vėžio inicijavimo ir progresavimo reguliuojant genų ekspresiją [8]. Vėžio konkrečiai prieš regionas hypermethylation daugelio miRNAs atradimas

žmogaus ir pelių, yra du genomo lokusų (MIR-219- parodė epigenetinius mechanizmą nukrypusiu nuo normos Mirna išraiškos [9], [10]. 1 ir Pasaulis-219-2), kuris koduoja Pasaulis-219 pirmtakų nuorašai. Pasaulis-219-1 yra chromosomos 6 (MI0000296) ir mir-219-2 yra chromosomos 9 (MI0000740) [11] (pav 1A.). Apdorojimo pirmtako nuorašai pagal Kauliukų žaidimai generuoja tris brandus miRNAs: mir-219-5p nuo 5 'galuose abiejų pirmtakų ir mir-219-1-3p ir mir-219-2-3p iš 3' gale pre- ir miR-219-1 ir iš anksto-miR-219-2, atitinkamai. Kadangi sėklų regionas šių trijų subrendusių produktų yra unikalus, kiekvienas Mirna Prognozuojama reguliuoti unikalius tikslus. Nors Pasaulis-219-5p yra žinoma, kad būti žemyn reguliuojama kelių vėžio, pavyzdžiui, piktybinės astrocitoma [12] ir kepenų vėžio [13] miR-219-1-3p ir miR-219-2-3p išraiška neturi ištirtas. Įdomu tai, kad miR-199b ir miR-219-2-3p genai yra ne arti nuo chromosomų 9q34.11 (pav. 1A) segmente. Ankstesnis tyrimas parodė, kad Pasaulis-199b-5p buvo žemyn reguliuojama meduloblastomos metilinimo tam CpG saloje 3 kb aukštyn nuo 5'-svetainėje PPN-199b-5P rengėjas [14]. Nuo DNR metilinimas gali paveikti didelius regionus chromatino ir reguliuoti tolimų genų transkripciją, būtina ištirti, ar Pasaulis-219-2-3p yra žemyn reguliuojama ir reglamentuojama metilinimo kaip miR-199b-5P vėžiu. Šiame tyrime mes nustatėme, kad Pasaulis-219-2-3p buvo žemyn reguliuojama GC audinių ir susijęs su pažangiomis fenotipų GC. Be to, iš naujo diegti miR-219-2-3p sumažino GC ląstelių ir sukeliama ląstelių apoptozės gyvybingumą, o tai rodo, kad Pasaulis-219-2-3p buvo kandidatas navikas slopintuvas GC. Daugiau metilinimas analizė Pasaulis-219-2-3p rengėjas nurodė, kad jo išraiška buvo reglamentuojama metilinimo koreliuotiems CpG salų tam tikru mastu. Galiausiai, mes nustatėme, kad Pasaulis-219-2-3p veikė kaip naviko slopintuvas per slopina ERK1 /2 signalo kelyje veiklą GC ląsteles.

Rezultatai

Pasaulis-219-2- 3p buvo skirtingai išreikštas GC ir GC ląstelių linijos

Jei įvertinti PPN-219-2-3p GC išraišką, TaqMan AT-PGR analizė buvo atlikta 113 porų GC audinių ir suderinti gretimuose normaliuose audiniuose mėginius , Lyginant su sveikų audinių pavyzdžių, daugiau nei pusė iš pirminių navikų eksponuojami žemą PPN-219-2-3p (58%, 65 113; pav. 1B). Be to, keturi pacientai, kurių išraiška miR-219-2-3p buvo reikšmingas žemyn reguliuojama buvo pasirinktas (1d pav.). Mir-219-2-3p išraiška tiems pacientams ir keturi GC ląstelių linijas (MSV-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901), buvo analizuojami atskleisti, kad Pasaulis-219-2-3p taip pat buvo žemyn, galima reglamentuoja GC ląstelių (pav. 1e). Šie rezultatai rodo, kad žemyn reguliuojama Pasaulis-219-2-3p buvo dažnas įvykis žmogaus GC ir gali būti įtraukti į skrandžio kancerogenezėje. Dėl visuotinio žemyn reguliavimo PPN-219-2-3p tirtų GC ląstelių linijų, MSV-803 ir HGC-27 buvo atsitiktinai pasirinko tolesnei analizei.

Santykiai tarp klinikos veiksnių ir miR-219- 2-3p išraiška GC

Šiame tyrime dalyvavo 113 GC pacientus. Įvertinti ryšį tarp Pasaulis-219-2-3p saviraiškos ir klinikos ypatumus koreliaciją, pacientai buvo suskirstyti į grupes su Dauno reguliavimo ir iki reglamentavimą. Kaip parodyta 1 lentelėje ir fig.1C, statistiškai reikšmingas ryšys buvo pastebėtas tarp miR-219-2-3p ir GC klinikinės etape išraiška. Į su žemesnio lygio PPN-219-2-3p išraiškos pacientai atrodė būti susijęs su aukštos kokybės ir vėlyvos stadijos navikai (p = 0,047, nepriklausomi-mėginiai t testas). Šie duomenys rodo, kad pokyčiai PPN-219-2-3p galėtų dalyvauti GC progresavimą.

Padidėjusi miR-219-2-3p GC ląstelių slopina ląstelių proliferaciją ir ląstelių išgyvenimą

puikus mažinimas Pasaulis-219-2-3p raiškos GC mėginių skatino mus ištirti galimą biologinę reikšmę PPN-219-2-3p į tumorgenesis. Atsižvelgiant į tai, kad Pasaulis-219-2-3p suvaidino vaidmenį ląstelių proliferaciją [15], MSV-803 and HGC-27 ląstelių buvo transfekuota Pasaulis-219-2-3p ir plaktai imituoja reglamentą ir analizuojami ląstelių augimą, ląstelių apoptozė ir ląstelės ciklo progresavimo atitinkamai. Visų pirma, RT-PGR buvo naudojamas po raiška eksperimentus norint įvertinti miR-219-2-3p lygį. Mes nustatėme, kad Pasaulis-219-2-3p padidėjo daugiau nei 100 sulankstyto Mirna perkeltų MSV-803 ir HGC-27 ląstelių (Fig.2A). Be to, CCK-8 proliferacijos tyrimu parodyta, kad ląstelių augimo greitis buvo sumažintas ir miR-219-2-3p imituoja-transfekuotos mgC-803 ir HGC-27 ląstelių, lyginant su plaktai transfekuotos ląstelės arba neapdorotų ląstelių (2b pav.). Po to, kai transfekciją, Slopinimo santykis buvo 26% (48 h) ir 28% (96 H) prie MGC-803 ląstelių ir 13% (72 h) ir 14% (96 h) HGC-27 ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-219-2-3p iš tiesų buvo įtrauktos į neigiamą reguliavimo ląstelių augimą. Tačiau nebuvo reikšmingas poveikis ląstelių ciklo arešto Pasaulis-219-2-3p gydytų GC ląstelių (pav. S1). Spręsti, ar iki reguliavimą PPN-219-2-3p paskatins GC ląstelių apoptozę ir ląstelių mirties, pradžioje apoptozės MGC-803 numerį ir HGC-27 ląstelių po gydymo Pasaulis-219-2-3p imituoja buvo nagrinėjama. Kaip ir tikėtasi, keletą anksti apoptozinių ląsteles (10% MGC-803 arba 2,9% HGC-27), buvo aptikta plaktai gydytų ląsteles, tuo tarpu PPN-219-2-3p imituoja gydymą padidino ankstyvųjų apoptozinių ląstelių procentas (17,5 % iš MGC-803 ar 8.3 HGC-27), taip vertinami pagal aneksinu dažymo (2C pav.). Todėl mes padarė išvadą, kad Pasaulis-219-2-3p gali turėti įtakos ląstelių išgyvenamumą GC ląsteles.

Padidėjusi miR-219-2-3p GC ląstelių slopina ląstelių migraciją ir invazija

Jei dar nustatyti, ar Pasaulis-219-2-3p yra susijęs su progresavimo GC, žaizdų gijimą ir transwell tyrimą buvo atlikta analizuoti Pasaulis-219-2-3p raiškos poveikį migracijos ir invazinę elgesio MGC-803 ir HGC- 27 ląstelės. Mes nustatėme, kad PPN-219-2-3p įvežimas į MGC-803 ir HGC-27 ląstelių lėmė dirbtinį žaizdos sukurta per susiliejantis monosluoksnio (pav. 3a) uždarymo metu gerokai sumažėjo ląstelių migraciją. Šios ląstelės ir buvo išlaikytos terpėje serumo neturinčioje per žaizdų gijimą žinoma, siekiant užtikrinti, kad bet koks papildyta migracijos elgesį negali būti paveikti pakitusio ląstelių proliferaciją. Be to, restauravimo miR-219-2-3p dramatiškai slopino paprastai stiprus invazinių pajėgumą MGC-803 ir HGC-27 ląstelių, gabenusių (3b pav.) Mažą endogeninio lygį PPN-219-2-3p. Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-219-2-3p raiškos prisideda prie reguliavimo GC ląstelių judrumui ir progresavimo in vitro.

MIR-219-2-3p išraiška yra epigenetically reguliuojama

Remiantis Pateiktos išvados, galime daryti išvadą, kad Pasaulis-219-2-3p buvo svarbus reguliatorius GC. Tačiau reguliavimo mechanizmai PPN-219-2-3p išraiška vis dar buvo nežinoma. Kadangi daugelis miRNAs buvo identifikuoti kaip taikinius metilinimo reglamento, pavyzdžiui, miR-9, PPN-34b /c ir miR-148A metastazių karcinoma [16], ir miR-137 ir miR-193a burnos vėžio [17], miR- 193b ir Pasaulis-145 prostatos vėžio [18], [19], mes nusprendėme ištirti reguliavimo mechanizmą Pasaulis-219-2-3p išraiška nuo jo genomo metilinimo. Po to, kai analizuojant genomo regioną, kurioje naudojamas ir miR-219-2-3p geną, mes nustatė didelį CPG salos (4A pav.). Ištirti, ar Pasaulis-219-2-3p buvo epigenetically reglamentuotas GC, MGC-803, HGC-27 ląstelių buvo gydomi demethyltransferase inhibitorius, 5-aza-2'-deoksicitidino (5-aza-REC) ir Histonas-deacetilazės inhibitorius trichostatin A (TSA). Tada miR-219-2-3p išraiška RT-PGR buvo analizuojami (4B pav.). Rezultatai parodė, kad miR-219-2-3p išraiška buvo reguliuojama dviem atvejais: gydymui 5-aza-CdR, miR-219-2-3p išraiška buvo-reguliuojamas MGC-803 ( 5-aza-CdR 1,5 mkmol /L; 2,14 karto) ir HGC-27 (5-aza-CdR 0,5 mkmol /L; 3,07 karto), palyginti su DMSO apdorojimo kontrolinę grupę; už 5-aza-CdR ir TSA derinys gydymą, miR-219-2-3p išraiška buvo daug didesnis MGC-803 (5-aza-CdR 1,5 mkmol /l; 1.98 kartus) ir HGC-27 (5 -aza-CdR 1,5 mkmol /l; 1.28 karto), palyginti su TSA kontroline grupe. Šie rezultatai parodė, kad Epigenetiniai veiksniai gali turėti įtakos Pasaulis-219-2-3p išraišką GC. Sinergija demetilinimu ir histono deacetilazės slopinimas buvo iš naujo išraiškos PPN-219-2-3p GC. Toliau nustatyti, ar Pasaulis-219-2-3p buvo susijęs su metilinimo GC, mes išnagrinėjo metilinimo statusą Mir-219-2-3p tiekėjų regione naudojant metilinimo konkrečių PGR (JEP; pav. 4c). 22 poros audinių (pirminius navikus ir jų suderintų gretimuose normaliuose audiniuose) į 113 porų buvo pasirinkta, įskaitant 11 pacientų, kurie turėjo mažesnes MIR-219-2-3p lygius (down-regulation grupė) ir 11 pacientų, kurie turėjo didesnį MIR-219 -2-3p lygiai (iki reguliavimą grupė). Mes nustatėme, kad DNR metilinimas aukštupio regionuose PPN-219-2-3p egzistavo tiek gretimuose normaliuose audiniuose ir vėžio audiniuose. Tačiau hypermethylation santykis tiekėjų regione PPN-219-2-3p geno žemyn reguliavimas grupėje buvo 63,6% (7 iš 11), kuris buvo didesnis nei iki reguliavimas grupėje (36,3%, 4 iš 11 ). Šie rezultatai rodo, kad metilinimas lygis tiekėjų CpG regione PPN-219-2-3p buvo didesnis Mir-219-2-3p žemyn reguliuoja grupę nei iki reguliuojama viena.

Padidėjusi miR-219-2-3p slopina ERK1 /2 signalizacijos kelią

aktyvinimas ERK1 /2 keliu buvo gerai dokumentuota įvairių vėžinių tipų, tokių kaip GC [20], kasos vėžio [21] ir krūties vėžio [ ,,,0],22]. Ankstesni tyrimai parodė, kad ERK1 /2 signalinio kelio svarbą migracijos, invazija ir metastazės vėžio ląstelių linijų [23] Reglamentas. Ištirti, ar Pasaulis-219-2-3p paveikia ląstelių veiklą per ERK1 /2 keliu, fosforilinimo lygis ERK1 /2 MGC-803 ir HGC-27 ląstelių buvo išnagrinėta po Pasaulis-219-2-3p raiškos. Mobilieji lygiai p-ERK1 /2 žymiai sumažėjo Pasaulis-219-2-3p imituoja-Transfekuoti ląstelės, palyginti su plaktai-perkeltų ar negydytų ląsteles. Tačiau, ne akivaizdus skirtumas buvo pastebėtas bendro ERK1 /2 lygio (5A pav.). Šie rezultatai parodė, kad paspartėjo GC ląstelių augimas gali būti iš dalies dėl to, aktyvintos ERK1 /2 būdus.

Bioinformatikos požiūris ieškoti potencialių taikinių PPN-219-2-3p

miRNAs moduliuoti geną išraiška, sąveikaudamas su tikslinėmis mRNR todėl iRNR degradavimą ar pritaikymo represijų. Toliau tirti PPN-219-2-3p mechanizmą GC, mes bioinformatically (TargetScan Išleidimo 5.2 ir miRDB) ir funkciškai susijęs MIR-219-2-3p GC, ir nustatė genus tikslines iki miR-219-2- 3p (lentelė S2),. Tarp 371 prognozuojama tikslų miR-219-2-3p, 31 iš jų parodyta didelį potencialą, nes jie buvo numatyti, remiantis abiejų programų, o kiti buvo vertinama tik remiantis vienu iš programų. Iš šių 31 genų, ERBB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 SOX4 buvo nustatyta, kad būti onkogeno ar apoptozės susijusių genų ankstesnių paskelbtus dokumentus. (Pav. 5B ir 5C).

Diskusijos

pastaraisiais metais sukaupta įrodymų atvedė onkologai spėlioti, kad neatskleistus molekulinius veiksnius, ypač ne kodavimo RNR anksčiau buvo klasifikuojamas kaip "šiukšlių", žaisti svarbų vaidmenį tumorigenesis ir naviko progresavimas. Priklausomai nuo jų mRNR tikslus, miRNAs gali veikti kaip naviko slopintuvai ar propaguotojų onkogenezėje. Tačiau priemonės, kuriomis dysregulated miRNAs nebuvo plačiai ištirtas, įskaitant nukrypusiu nuo normos Mirna biogenetyczne ir transkripcijos [24], [25], epigenetinio pakeitimo [26], [27], ir amplifikacijos ar praradimo genomo regionų, kurie koduoja miRNAs [28] .

Kaip parodyta šioje ataskaitoje, mes išanalizavo PPN-219-2-3p išraišką 113 GC pacientų ir nustatė, kad lygiai atrodo mažesnis GC. Nors Pasaulis-219-2-3p buvo pranešta, kad glaudžiai susijęs su diabetinės retinopatijos [29], oligodendrocytes [15], Alzheimerio liga [30] ir glioblastoma [12], jo funkcija GC dar reikia nustatyti. Be to, mes parodė, kad naujo išraiška miR-219-2-3p GC ląstelių lėmė ląstelių apoptozės indukcija ir sumažinti ląstelių gyvybingumą. Šie rezultatai leido mums spėlioti, kad žemyn reguliavimą PPN-219-2-3p gali suteikti išgyvenimo pranašumą GC ląsteles. Tačiau atsakingas Mir-219-2-3p mechanizmas žemyn reguliavimas GC vis dar nežinoma. Kadangi ne 9q34.11, kur Pasaulis-219-2-3p yra praradimas, retai aptinkamas GC [31], ji yra mažai tikėtina, kad Alelių praradimas yra atsakingas už jos žemyn reguliavimą. Kita vertus, mes nustatėme, kad miR-219-2-3p buvo žymiai iki reguliuojama, kai GC ląstelės, MGC-803 ir HGC-27, buvo gydomi tiek 5-aza-CdR ir TSA. Be to, skaičiavimo analizė rodo, kad Pasaulis-219-2-3p įsikūręs CpG salos chromosomos 9q34.11. Todėl, atrodo, įmanoma, kad DNR metilinimas ir histono deacetilinant gali būti susijęs su Pasaulis-219-2-3p reglamentą. Iki JEP, aptiktos tiekėjų regione PPN-219-2-3p mėginiai metilinimo dažnis buvo didesnis Mir-219-2-3p žemyn reguliuojama grupėje, nei iki reguliuojama grupei. Ši specifika apstatyti į santykius tarp Pasaulis-219-2-3p saviraiškos ir DNR metilinimo hipotezę. Apskritai, rezultatai parodė, kad metilinimas buvo svarbus mechanizmas Mir-219-2-3p žemyn reguliavimo GC.

Mes atlikome numatymo TargetScan ir miRDB programas ir nustatė, kad 6 genai gali būti potencialūs taikiniai PPN -219-2-3p. Tarp kandidačių tikslų PPN-219-2-3p, The tirozino kinazės receptorius ERBB3 (epidermio augimo faktoriaus receptoriaus šeimos) atkreipė mūsų dėmesį. Didelis ERBB3 stipriai susijęs su naviko progresavimo ir blogos prognozės pacientų su GC [32] - [34] ir EGFR kinazės inhibitoriai gefitinibas galėtų užkirsti kelią EGFR ir erbb2 aktyvavimo ERBB3. Tuo tarpu, ERBB3 sąvoka taip pat tarnauja kaip veiksminga prognozuoti jautrumo gefitinibui [35]. Yra žinoma, kad Nuslopintoji ERBB3 transkripcija slopina signalų kaskadomis iš ERK1 /2 keliai [36]. Tačiau, numatomą taikinio genai, reikia dar labiau eksperimentiškai patvirtinti. Be to, miRNAs gali veikti atsižvelgiant į kombinacyjne modelis, kuriame vienas Mirna, gali būti taikomi kelis mRNR, ir keletas persipynusių miRNAs gali nukreipti vieną iRNR. Naujausi tyrimai rodo, kad biologinis koncepcija "vieno hit-kelis tikslus" gali būti naudojamas klinikiniuose terapijos [37]. Tikėtina, kad tam tikra Mirna gali veikti per bendrą žemyn reguliavimo kelis tikslus ir miRNAs funkcija taip pat slopina jų tikslinių genų vertimą. Ištirti visą poveikį A Mirna, genomo proteominius tyrimų turėtų būti daroma.

Taigi, mūsų išraiškos ir funkciniai tyrimai rodo, kad Pasaulis-219-2-3p buvo skirtingai išreikšta metilinimo mechanizmu ir turėjo navikinės slopinimo funkcija reguliuojant ERK1 /2-susijusius signalo kelius GC. Tuo tarpu mažesnės išraiška miR-219-2-3p GC egzempliorių koreliavo su aukštesnio lygio ir vėliau. Atnaujinanti išraišką PPN-219-2-3p apie GC ląstelių slopino ląstelių proliferacija, migracija, invazija ir sukeltas apoptozė nurodė, kad Mirna pagrindu theraputic modelis gali tarnauti kaip už naujų potencialių terapijos skrandžio vėžio pagrindu.

medžiagos ir metodai

audinių pavyzdžiai

Skrandžio navikai ir jų morfologiškai normalių audinių (įsikūrusi > 3 cm nuo naviko) buvo gauti nuo 2009 lapkričio iki 2011 lapkričio nuo 113 GC pacientams, kuriems atliekama chirurgijos vėžio ligoninėje Kinijos medicinos mokslų akademijos (CICAMS, n = 21), kinų PLA General Hospital (301 ligoninės, N = 31) ir pirmasis filialas ligoninės Shanxi Medical University (n = 61). Iš audinių mėginių visuose eksperimentuose naudoti buvo patvirtintas etikos tarybos pagrindinio medicininio mokslų instituto kinų medicinos mokslų akademijos. Visi dalyviai, jei jų žodinį informuoto sutikimo dalyvauti šiame tyrime ir jų žodžiu informavo sutikimai užrašyti. Šis sutikimas procesas taip pat buvo patvirtinta etikos taryba. Audinio mėginiai buvo supjaustyti į dvi dalis, viena buvo nustatytas su 10% formalinu anomalijų arba klinikinių požymių diagnozės, o kitas iš karto buvo prisegami užšaldomos skystame azoto, ir saugomi -196 ° C skystame azote, kol RNR ekstrakcijos. Šią grupę sudarė 95 vyrų, 17 moterų ir vienas be lyčių informacijos kurių vidutinis amžius buvo 58 metai (diapazonas, 31-82 metų) .Formalin fiksuoto parafino įterptųjų audinio blokai GC buvo surinkti iš vėžio ligoninėje Kinijos mokslų akademijos medicinos mokslai (CICAMS, n = 4) tarp 2009 ir 2011 dėl individualių skirtumų tarp pacientų, mums trūko informacijos apie kai kurių clinicopathologic duomenis. Iš audinių mėginių visuose eksperimentuose naudoti buvo patvirtintas visų pacientų ir etikos komiteto institucijos. Pacientų charakteristikos aprašytos lentelėje 1.

Mobilaus kultūros ir transfekcijq

4 žmogaus GC ląstelių linijų MSV-803 (mucinous skrandžio vėžys, menkai diferencijuotas) iš viso, HGC-27 ( metastazavusiu limfmazgis, nediferencijuota karcinoma), MKN-45 (Signet žiedas karcinoma blogai diferencijuotas), Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 (adenokarcinoma, vidutiniškai diferencijuotas) buvo nagrinėjami šiame tyrime. MSV-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 ląstelių linija buvo įsigyta iš Cell išteklių centro instituto pagrindinės medicinos mokslų, kinų medicinos mokslų akademijos ir Pekino Sąjunga Medicinos koledžo (Pekinas, Kinija). MSV-803 buvo padauginti Dulbecco modifikuota Eagle terpė (Gibco; INVITROGEN gyvybė technologijų, Vokietija), papildyta su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS; PAA, Pašingas, Austrija) ir streptomicino (100 mikrogramų /ml) penicilino V (100 V /ml). HGC-27, MKN-45, SGC-7901 buvo prižiūrimi RPMI 1640 terpė (PAA), papildytas su 10% FBS (PAA). Žmogaus GC ląstelių linijos MSV-803, HGC-27 buvo pernešta su Pasaulis-219-2-3p imituoja ir neigiamus kontrolinius Mirna imituoja (GenePharma; Šanchajus, Kinija, Stalo S1), kurio galutinė koncentracija 10 nmol /L, naudojant Dharmafect 1 ( "Thermo Fisher; IL, JAV) pagal gamintojo instrukcijas

TaqMan AT-PGR už Mirna raiškos

viso RNR buvo išskirta iš ląstelių ir audinių su Trizol reagento (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNAs buvo kiekybiškai realaus laiko PGR naudojant TaqMan MicroRNA tyrimą (Invitrogen, JAV). Pirmasis-kryptis papildo DNR (cDNR) sintezė buvo atliktas iš 1 mikrogramų visos RNR 12 pL galutinį tūrį, turinčio 2 M kamieninių kilpa gruntą, 10 mM dNTP mišinio (Invitrogen, USA). Mišinys buvo plokštė 65 ° C temperatūroje 5 min, ir tada sumaišyti su 5 × RT buferio, 0,1 M DTT, 200 U /mikrol MultiScribe atvirkštinės transkriptazės ir 40 U /mikrol, RNaze inhibitorių (Invitrogen, JAV). Mišinys buvo plokštė 37 ° C temperatūroje 55 min, 70 ° C temperatūroje 15 min, o po to paliekamas -20 ° C temperatūroje. Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant standartinį TaqMan PGR protokolą. 20 iL PGR reakcijų reakcijos Included 1 įxL RT produkto, 1 × Universalus TaqMan magistras sumaišoma ir 1 × TaqMan zondas /pradmenų mišinys (Invitrogen, JAV, Stalo S1). Visi RT reakcijos, įskaitant NO-Šablonas buvo paleisti tris kartus. Visi iRNR kiekybinis duomenų buvo normalizuotas U6. Santykinis dydis stenograma buvo apskaičiuotas naudojant lyginamąją Ct metodą.

5-aza-CdR ir Trichostatin A ląstelių linijų valymo

GC ląstelių linijos MSV-803 buvo gydomi 5-aza- 2'-dezoksicitidino (5-aza-CdR; Sigma-Aldrich, JAV) 0,7 mkmol /l 1,5 mkmol /L, 3 mkmol /L ir HGC-27 buvo gydomi 5-aza-CdR 0,5 mkmol /l 1 mkmol /l, 1,5 mkmol /l 3 dienas arba 300 nmol /L trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, JAV) 24 valandas. Už sudėtinį vaistinį preparatą, ląstelės buvo gydomi 5-aza-CdR už 48 valandas Pirma. Tada buvo įtraukta TSA (300 nmol /L), ir ląstelės buvo gydomi dar 24 valandas. Kultūra terpėje, turinčioje narkotikų buvo pakeistas kas 24 valandas. RNR ląstelių linijas buvo gryninamas su TRIzol reagento po iš gamintojo nurodymus. kDNR sintezės buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau, ir 1 ml praskiesto kDNR kiekvieno mėginio sustiprino RT-PGR naudojant aprašyta anksčiau protokolas.

DNR išskyrimas ir bisulfito modifikacija

genomo DNR buvo gauta iš -196 ° C skystame azote pirminių auglių, ir jų atitiko gretimuose normaliuose audiniuose (n = 22, apima 11 pacientų, kurie išraiška miR-219-2-3p buvo žemyn-reguliuojamas ir kiti buvo viršuje reguliuojamo) ir Naudota Biomed DNR rinkinys (Biomed, Pekinas, Kinija) pagal gamintojo nurodymus. Bisulfite apdorojimą ir utilizavimą mėginių buvo atliekami su Epitect bisulfite komplektas (Qiagen; Hilden, Vokietija). Genominės DNR (2 mikrogramai) 20 mikrol, vandens buvo naudojamas kiekvienam reakcijos ir sumaišyti su 85 mikrol bisulfito mišinio ir 35 mikrol, DNR apsaugoti buferį. Bisulfito konversijos buvo atliktas termocikleryje taip: 99 ° C 5 min, 60 ° C temperatūroje 25 min, 99 ° C temperatūroje 5 min, 60 ° C temperatūroje 85 min, 99 ° C temperatūroje 5 min, 60 ° C temperatūroje 175 min ir 20 ° C neribotą laiką. Bisulfito gydytų DNR buvo susigrąžinta Epitect centrifugavimo kolonėlę ir vėliau sekos patvirtinti bisulfito konversijos efektyvumą.

Metilinimas analizė

JEP buvo naudojamas analizuoti metilinimas PPN-219-2-3p prieš regionas ląstelių linijų ir audiniuose. Methprimer buvo naudojamas projektuoti MSP gruntas (lentelė S1). MSP reakcijos dėl naujų pradmenų buvo optimizuota naudojant denatūruotu teigiamą, reguliuojamas (M-DNR), kuris naudojant įprastą žmogaus periferinio limfocitų DNR apdorotos in vitro su Sss Aš metiltransferazei (New England Biolabs, Beverly, MA). Dviejų įprastomis žmogaus periferinių limfocitų DNR buvo naudojamas kaip įprastu valdikliu. Tūpimo PGR sudarytas iš dviejų etapų: 1 fazės metu pradinį denatūraciją 95 ° C temperatūroje 5 min, ir po to 95 ° C temperatūroje, naudojant 45 ciklų denatūruojant 30 S, atkaitinimo skirtingose ​​temperatūrose 30 S, ir pratęsimą 72 ° C, 40 s. Pirmajame etape, esant prijungimo temperatūra buvo nustatyti iki 58 ° C ir, kiekviename iš 10 sekančių ciklų metu, esant prijungimo temperatūra buvo sumažėjo 0,6 ° C. 2 etapą sudarė 35 ciklų 95 ° C temperatūroje 30 S, 52 ° C temperatūroje 30 s, ir 72 ° C temperatūroje 40 s. MSP produktai buvo analizuojami 3% poliakrilamido geliai

ląstelių proliferacija, apoptozė ir ląstelės ciklo analizė

Ląstelės inkubuojamos 10% CCK-8. (Dojindo; Kumamoto, Japonija), praskiestas normalu kultūros terpė 37 ° C temperatūroje, kol vaizdo spalvų, kai įvyko konversija. Proliferacijos normos buvo nustatomas 0, 24, 48, 72, 96 valandoms po transfekciją. Kiekvieno šulinio absorbcija buvo matuojamas su mikroplokštelės skaitytuvą nustatytą esant 450 nM ir 630 nM. Visi eksperimentai buvo atliekami keturiais egzemplioriais. Apoptozę tyrimas buvo atliktas MGC-803 ir HGC-27 ląstelių linijas 72 valandas po transfekciją naudojant PE aneksinu Apoptozę nustatymo rinkinys I (BD Pharmingen; San Diegas, CA, JAV) ir analizuojami fluorescencijos aktyvintų ląstelių rūšiavimo (FACS) , Mobilusis ciklo analizė buvo atliekama MGC-803 ir HGC-27 ląstelių linijas 48 valandas po transfekciją su Pasaulis-219-2-3p imituoja ir peštynės atitinkamai. Ląstelės buvo surinktos, du kartus plaunamas šaltu PBS, nustatyta iš ledinio 70% etanolio, ir inkubuojami su propidiumo jodido (PI) ir RNazės A, tada analizuojami FACS. Kiekvienas mėginys

Mobilusis migracijos ir invazija mėginiuose paleisti tris kartus.

MSV-803 ir HGC-27 ląstelių buvo auginamos iki susiliejimo su 12 duobučių plastikinių indų ir gydomi užšifruoti ar miR-219 -2-3p imituoja. 24 valandas po transfekciją, linijinis įbrėžimams žaizdoms (trimis egzemplioriais), buvo sukurta susiliejantis ląstelių monosluoksnių naudojant 200 iL pipetės galiuką. Norėdami pašalinti ląsteles nuo ląstelės ciklo prieš į sužeidimo, ląstelės buvo išlaikyta vidutinės trukmės serumo nemokamai. Vizualizuoti emigravo ląsteles ir žaizdų gijimą, foto darytos esant 0, 12, 24, 36, 48, 60 ir 72 val valandas. Iš dešimties sričių iš viso buvo atsitiktinai pasirinktas iš kiekvienos duobutės, o į tris duobutes kiekvienos grupės ląstelės buvo kiekybiškai. Dėl invazija tyrimus, po 24 valandų transfekciją, 1 × 10 ^{5 ląstelės žiniasklaidos be serumo buvo pasėtos ant transwell migracijos rūmų (8 mikronų akučių dydis; MILLIPORE, Šveicarija), kurios buvo padengtos Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, JAV) ant viršutinio kameroje. Diskų, kuriuose yra 20% FBS buvo įtraukta į apatinę kamerą. Po 24 valandų, kad ne invazija ląstelės buvo pašalintas su vata, invazinių ląstelių, esančių apatiniame paviršiuje kameroje buvo tamsintas su Geg-Žalgirio-Giemsa dėmių (sigma diagnostikos srityse; St Louis, Missouri, JAV) ir skaičiuojami naudojant mikroskopą ( "Olympus"; Tokijas, Japonija). Eksperimentai buvo nepriklausomai kartojamas tris kartus.}

Baltymai izoliacija ir imunoblotingu

Tuo nurodyto laiko, MSV-803 ląstelių ir HGC-27 ląstelių buvo nukirsta ledinio PBS ir lizuoti ant ledo šalta rengimas modifikuoto radioimunoprecipitacijos buferyje papildo proteazių inhibitoriais. Baltymo koncentracija buvo nustatomas pagal BCA baltymų Analizės Kit (Bio-Rad, Milan, Italy) ir lygių kiekių buvo analizuojami SDS-PAGE (10% akrilamido) baltymų. Geliai buvo electroblotted nitroceliuliozės membranos (MILLIPORE, Bedford, MA, JAV). Už immunoblot eksperimentų, Membranos buvo užblokuotas už 2 h su 5% neriebalinė sausoji pieno tri-buferio druskų tirpalu, turinčiu 0,1% Tween-20, ir inkubuojami esant 4 ° C per naktį su pirminiais antikūnais. Aptikimo buvo atliktas peroksidaziniais-konjuguoto antrinių antikūnų, naudojant chemiliuminescencijos sustiprinimo sistemą. Pirminiai antikūnai buvo naudojamos: GAPDH nuo Zhong-Shan Jinqiao (Pekinas, Kinija); ERK1 /2 (triušis prieš ERK1 /2, Naujosios Anglijos Biolab, NVUI) ir PHOSPHO-ERK1 /2 (triušis prieš PHOSPHO-ERK1 /2, Naujosios Anglijos Biolab, NVUI)

Histologija

audiniai buvo nustatytos per naktį buferiniame formalino, įterptųjų parafinu, supjaustyti 3 mikronų storio, ir tamsintas hematoksilinu-eozinu ( "H & E). dažymosi

Bioinformatikos ir statistines analizes duomenų
<

• PLoS ONE: Aukštas išraiška Šilumos šoko baltymas 90 yra susijęs su naviko agresyvumas ir blogos prognozės pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu
• PLoS ONE: Neinvazinė vizualizacija MicroRNA-16 skrandžio vėžiu Atsparumas cheminėms Naudojant Dvigubas Žurnalistė Genų vizualizavimo sistema