Plos ONE: MicroRNA-219-2-3p Funkcije kot zaviralnih želodčnega raka in je urejena z DNK Methylation

Povzetek

Ozadje & Cilj

rak želodca je najpogostejši gastrointestinalni tumor pri odraslih in je najbolj smrtonosna oblika raka pri človeku. Kljub izboljšavam pri zdravljenju, je osnovni mehanizem želodca rakotvornost ni znana. Če želite določiti nove modulatorji, ki urejajo dovzetnost za tumorgenesis, smo se osredotočili na pokoj-219-2-3p.

Metode

Kvantitativne RT-PCR je bil zaposlen, da se ugotovi raven miR-219-2 -3p na raka želodca (GC) tkiva (n = 113), in njihove poveže in sosednjih normalnih tkiv (n = 113). V celično proliferacijo in vitro, apoptoze testih, celični migraciji in invazijo testi so bili izvedeni za pojasnitev bioloških učinkov pokoj-219-2-3p. Ker utišati Mirna promotor CpG otoku metilacije je lahko pomemben mehanizem v tumorgenesis, so GC celice zdravljenih s 5-aza-2'-deoksicitidinska in trichostatin A, in izražanja spremembe miR-219-2-3p jih kvantitativno nato preučila, RT-PCR. Končno se je stanje metilacija otoka CpG gorvodno miR-219-2-3p analiziramo s metilacije specifične PCR v GC tkivih (n = 22).

Rezultati

miR-219- 2-3p je navzdol urejena v GC in celičnih linijah. Poleg tega so poskusi dokumentirani spodnji izraz pokoj-219-2-3p v GC osebkov z višjo stopnjo in kasneje tumorjev fazi. Medtem, miR-219-2-3p deluje antiproliferativno, proapoptotičnih in antimetastatsko vloge in nižjih ravni p-ERK1 /2 v GC celicah. Poleg tega je 5-aza-2'-deoksicitidin in trichostatin na večje izražanje (~2 krat) Mir-219-2-3p v GC celicah. Z metilacije specifične PCR, smo DNA metilacije v toku regiji miR-219-2-3p odkriti v obeh sosednjih normalnih tkiv in rak tkiva. Kot je bilo pričakovati, je bila stopnja metilacije v pokoj-219-2-3p precej višja navzdol urejeno skupino kot do urejene skupine.

Sklepi

miR-219-2-3p potencialno vpleten v želodčnem napredovanje raka in metastaz z ureditvijo povezane-2 ERK1 /poti signalov, ki lahko nudijo nov terapevtski strategijo za zdravljenje raka želodca. Mehanizem metilacija lahko sodelujejo v zvezni ravni ekspresije pokoj-219-2-3p raka želodca

Navedba. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et al . (2013) MicroRNA-219-2-3p Funkcije kot zaviralnih želodčnega raka in ureja DNA metilacije. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369

Urednik: Arun Rishi, Wayne State University, Združene države Amerike

Prejeto: 14. december 2012; Sprejeto: 26. februar 2013; Objavljeno: 23. april 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Kitajske [2012, 91129716, za JY] in Beijing Municipal Science & [2010B071, da JY] Tehnologija komisija. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je 4 ^{th najpogostejši rak in druga najvišja vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu. Danes, bolniki z pozni fazi GC so s celotno 5-letno preživetje približno 20% [1]. Rak razvije zaradi kopičenja različnih endogenih in eksogenih vzrokov. Prehranjevalnih navad ter povečan Helicobacter pyloriinfection so pomembni eksogeni vzroki za GC [2], pri čemer se je dalo genetskih kot tudi dietni, nivoji gastrina hormona [3], in drugih kroničnih želodca vnetnih povzročajo dejavniki, ki so povezani z nagnjenostjo za razvoj raka. Genske spremembe igrajo pomembno vlogo pri GC in spremembe v velikem številu onkogenov in tumorskih supresorskih genov smo že poročali GC.}

Nekateri prognostični tumor biomarkerjev v GC kot rast človeškega faktorja epidermalne receptorja 2 (HER2 ), vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF), epidermalni rastni faktor receptor (EGFR), ki so bile povezane z značilnostmi bolezni in se zato lahko uporabi za obveščanje upravljanje pacientov. Na primer, lahko bolniki s tumorji, ki test pozitiven za HER2 zdraviti s trastuzumabom plus [4] kemoterapije, in bolniki s tumorji, ki preskušajo pozitiven za VEGF je mogoče zdraviti z bevacizumabom in kemoterapijo [5]. Vendar pa molekularni mehanizmi, na katerih temelji razvoj GC ostaja izziv, zato so nujno potrebni dodatno informativnih biomarkerjev.

MicroRNAs (miRNA) so razred majhnih molekul RNA, vključenih v ureditev prevajanja in razgradnje mRNA [6 ]. MiRNAs veže na komplementarnih sekvenc v 3 'neprevedenih regijah (UTR) svojih ciljnih mRNA in povzroči razgradnjo mRNA ali premočrtno represijo [7]. Najbolj znana funkcije miRNAs se nanašajo na negativne regulacije gena: miRNAs tišina izražanje genov, navadno z vmešavanjem stabilnost mRNA ali prevod beljakovin. V zadnjih letih je bilo miRNAs verjeli, da deluje kot onkogen ali tumor supresorski gen, in prispevajo k začetku in napredovanja raka z regulacijo genskega izražanja [8]. Odkritje raka specifične pred regije hypermethylation številnih miRNAs je pokazala epigenetsko mehanizem za odklonskega miRNA izražanja [9], [10].

Pri človeku in miših, obstajata dve genomskih lokusov (miR-219- 1 in miR-219-2), ki kodirajo miR-219 predhodnikov prepise. miR-219-1 se nahaja na kromosomu 6 (MI0000296) in Mir-219-2 se nahaja na kromosomu 9 (MI0000740) [11] (sl. 1A). Obdelava prepise predhodnikov po Kocka ustvari tri zrele miRNAs: MIR-219-5p od 5 'koncih obeh predhodnimi sestavinami in MIR-219-1-3p in MIR-219-2-3p od 3' koncu pred- miR-219-1 in pre-miR-219-2, oz. Ker je seme območje teh treh zrelih izdelkov edinstven, vsak miRNA predvidoma urejanje edinstvene ciljev. Čeprav je miR-219-5p znano, da je navzdol urejeno v multiplo raka, kot so maligni astrocitom [12] in karcinomom jetrnih celic [13], izraz miR-219-1-3p in pokoj-219-2-3p nima proučevali. Zanimivo je, da so miR-199b in miR-219-2-3p geni nahaja v bližini segmentu kromosomskih 9q34.11 (sl. 1A). Predhodna študija pokazala, da je bila miR-199b-5p navzdol urejeno v meduloblastoma s metilacije otoku CpG 3 kb navzgor od 5'- strani miR-199b-5P promotorja [14]. Ker lahko DNA metilacija vplivajo velike regije kromatina in urejajo prepis oddaljenih genov, je treba preučiti, ali je miR-219-2-3p navzdol regulirane in ureja metilacije kot pokoj-199b-5p raka. V tej študiji smo ugotovili, da je miR-219-2-3p navzdol regulirano v GC tkivih in je povezano s progresivno fenotipe GC. Poleg tega je ponovna uvedba pokoj-219-2-3p zmanjšano preživetje GC celic in inducirane celične apoptoze, kar kaže, da je bil miR-219-2-3p kandidat zaviralnih v GC. Nadaljnja analiza metilacija miR-219-2-3p promotorja je pokazala, da je bil njen izraz ureja metilacije soodvisnih CpG otokov do neke mere. Na koncu smo ugotovili, da miR-219-2-3p deloval kot zaviralnih z zaviranjem aktivnosti ERK1 /2 signala poti v GC celicah.

Rezultati

miR-219-2- 3p je različno izražena v GC in GC celične linije

Za oceno izraz pokoj-219-2-3p v PK, je bila analiza TaqMan RT-PCR poteka v 113 parov GC tkiv poveže in sosednjih običajne vzorce tkiva . V primerjavi z običajnimi vzorcev tkiva, več kot polovica primarnih tumorjev razstavljeni nizke nivoje miR-219-2-3p (58%, 65 od 113;. Slika 1B). Poleg tega so bili štirje bolniki, katerih izraz miR-219-2-3p pomemben navzdol urejeno so bili izbrani (sl. 1D). MIR-219-2-3p izraz pri bolnikih in štirih GC celičnih linijah (MGC-803, HGC-27, podjetja MKN-45, SGC-7901) smo analizirali razkrila, da je bila miR-219-2-3p tudi navzdol urejeno v GC celic (sl. 1E). Ti rezultati kažejo, da je bil navzdol urejeno miR-219-2-3p pogost dogodek v človeški GC in bi lahko bile vključene v želodcu rakotvornost. Zaradi univerzalnega zmanjšanjem števila pokoj-219-2-3p v testiranih celičnih linijah GC, so MGC-803 in HGC-27 naključno izbrana za nadaljnji študij.

Razmerje med clinicopathological dejavnikov in pokoj-219- 2-3p izraz v GC

To študijo je bilo vključenih 113 bolnikov GC. Za oceno korelacije med miR-219-2-3p izražanja in clinicopathological značilnosti so bolnike razdelili v skupine z zmanjšanjem števila predpisov in up-ureditev. Kot je prikazano v tabeli 1 in fig.1C, so ugotovili statistično značilno povezavo med izražanjem pokoj-219-2-3p in GC klinični fazi. Bolniki z nižjo stopnjo miR-219-2-3p izražanja je zdelo, da je povezana z visoko kvalitetnega in pozni fazi tumorjev (p = 0,047, neodvisni-vzorce, t test). Ti podatki kažejo, da bi se spremembe Mir-219-2-3p vključeni v napredovanje GC.

Čezmerno pokoj-219-2-3p v GC celicah zavira proliferacijo in celično preživetje

izjemen zmanjšanje miR-219-2-3p izražanja v vzorcih GC nas spodbuja, naj prouči možni biološki pomen pokoj-219-2-3p v tumorgenesis. Glede na to, da miR-219-2-3p igral pomembno vlogo pri regulaciji celične proliferacije [15], so MGC-803 and HGC 27-celice vnese miR-219-2-3p in žoga posnema in analizirajo za rast celic, celice apoptoza in napredovanje celičnega ciklusa oz. Najprej, RT-PCR smo uporabili za merjenje ravni miR-219-2-3p po čezmernim eksperimentov. Ugotovili smo, da miR-219-2-3p povečala za več kot 100 gub na Mirni transfektirali MGC-803 in HGC-27 celice (Fig.2A). Poleg tega je test širjenje CCK-8 so pokazale, da stopnja rasti celic se je zmanjšala v miR-219-2-3p posnema-transfektirane MGC-803 in HGC-27 celic v primerjavi z bitki transfekcije celic ali neobdelanih celic (sl. 2B). Po transfekciji razmerje inhibicije je bila 26% (48 ur) in 28% (96 h) v celicah MGC-803 in 13% (72 ur) in 14% (96 h) v HGC-27 celice. Ti rezultati kažejo, da je miR-219-2-3p dejansko vpletena v negativni regulaciji celične rasti. Vendar pa ni bilo pomembnega vpliva na ustavitev celičnega cikla v miR-219-2-3p zdravljenih GC celic (sl. S1). Za odpravo ali regulacijo navzgor pokoj-219-2-3p bi povzročilo GC apoptozo celic in celične smrti, število zgodnje apoptoze MGC-803 in HGC-27 celic po zdravljenju z miR-219-2-3p posnema bila preučena. Kot je bilo pričakovati, malo zgodaj apoptotičnih celic (10% v MGC-803 ali 2,9% HGC-27) so bile odkrite v celicah bitki obdelan, medtem ko obdelavo miR-219-2-3p posnema povečala delež zgodnjih apoptotskih celic (17,5 % v MGC-803 ali 8.3 v HGC-27), ki ga aneksin barvanjem (sl. 2C) ocenjevala. Zato smo sklenili, da bi miR-219-2-3p vplivajo na preživetje celic v GC celicah.

Čezmerno pokoj-219-2-3p v GC celicah zavira migracijo celic in invazija

nadalje ugotoviti, ali je miR-219-2-3p povezana z napredovanjem GC, celjenje ran in transwell testu so bile izvedene analize vpliva mir-219-2-3p izražanja na migracijski in invazivnega vedenja MGC-803 in HGC- 27 celice. Ugotovili smo, da je za vnos miR-219-2-3p v MGC-803 in HGC-27 celic je povzročilo znatno zmanjšanje celični migraciji v času zapiranja umetnega rane ustvaril preko Strnjena enoplastni (sl. 3A). Te celice smo vzdrževali v mediju brez seruma med celjenje ran, da se zagotovi, da vsak povečan migracijski obnašanje ne more vplivati ​​proliferacijo spremenjeni celic. Poleg tega je obnova miR-219-2-3p močno zaviral običajno močno invazivno sposobnost MGC-803 in HGC-27 celic, ki se izvaja nizko endogene raven pokoj-219-2-3p (sl. 3B). Ti rezultati so pokazali, da miR-219-2-3p prekomerno prispeva k ureditvi GC celične gibljivosti in napredovanje in vitro.

MIR-219-2-3p izraz epigenetically regulirana

Glede na Zgoraj navedene ugotovitve, ugotovimo, da je bil miR-219-2-3p pomemben regulator v GC. Vendar pa so še vedno neznan regulatorni mehanizmi miR-219-2-3p izražanja. Ker je bilo veliko miRNAs opredeljeni kot cilji regulacije metilacije, kot so pokoj-9, MIR-34b /c in pokoj-148a v metastatskim karcinomom [16], in pokoj-137 in pokoj-193.a oralno raka [17], miR- 193b in miR-145 pri raku prostate [18], [19], smo se odločili za analizo regulativnega mehanizma miR-219-2-3p izražanja iz svojega genomske metilacije. Po analizi genomske regije se razprostira gen MIR-219-2-3p smo ugotovili velik otok CpG (sl. 4A). Da razišče, ali je miR-219-2-3p epigenetically urejena v GC, MGC-803, HGC-27 celice so bili zdravljeni z demethyltransferase zaviralec, 5-aza-2'-deoksicitidinsko (5-aza-CdR) in histon-deacetilaze inhibitor trichostatin A (TSA). Nato je izraz miR-219-2-3p z RT-PCR analizo (sl. 4B). Rezultati so pokazale, da je bil izraz pokoj-219-2-3p up-urejeno v dveh primerih: za zdravljenje 5-aza-CdR je bil izraz pokoj-219-2-3p up-urejena v MGC-803 ( 5-aza-CdR 1,5 mol /l, 2,14-krat) in HGC-27 (5-aza-CdR 0,5 mol /l, 3,07-kratno) v primerjavi z DMSO obdelamo kontrolno skupino; za kombinirano zdravljenje 5-aza-CdR in TSA, je bil izraz pokoj-219-2-3p v MGC-803 (5-aza-CdR 1,5 mol /L; 1,98-krat) precej višja in HGC-27 (5 aza-CdR 1,5 mol /l, 1,28-krat) v primerjavi s kontrolno skupino TSA. Ti rezultati so pokazali, da bi lahko epigenetski dejavniki vplivajo miR-219-2-3p izraz v GC. Sinergija demetilacija in histon deacetilaze inhibicije pripeljala do ponovnega izražanja pokoj-219-2-3p v PK. Da bi še ugotoviti, ali je bila miR-219-2-3p povezana z metilacije GC, smo pregledali metilacijskega statusa pridobivalnem območju MIR-219-2-3p uporabo metilacijo specifični PCR (PPN;. Slika 4C). Izbrali so 22 parov tkiv (primarnih tumorjev in njihovih izravnanih sosednjih normalnih tkiv) v 113 parov, vključno z 11 bolniki, ki poseduje nižje ravni MIR-219-2-3p (down-ureditev skupina) in 11 bolnikov, ki so imele višjo MIR-219 -2-3p ravni (up-ureditev skupina). Ugotovili smo, da DNA metilacija prehodnih regijah pokoj-219-2-3p obstajala v obeh sosednjih zdravih tkiv in rak tkiva. Vendar je bilo razmerje hypermethylation po toku regije miR-219-2-3p gena v skupini navzdol-regulacijski 63,6% (7 od 11), ki je višja od skupini up-regulacijski (36,3%, 4. 11 ). Ti rezultati kažejo, da je bila raven metilacija nabavnem CpG regiji pokoj-219-2-3p višje v pokoj-219-2-3p navzdol urejeno skupino kot v enem do regulirane.

Čezmerno miR-219-2-3p pokvari ERK1 /2 signalno pot

Aktivacija ERK1 /2 poti, je dobro dokumentiran v različnih vrstah tumorjev, kot so GC [20], raka trebušne slinavke [21] in raka dojke [ ,,,0],22]. Prejšnje študije so pokazale, da je pomembno ERK1 /2 signalne poti pri urejanju migracij, invazijo in zasevke raka celičnih linij [23]. Da razišče, ali miR-219-2-3p vpliva celic dejavnosti prek ERK1 /2 poti, je preučila raven fosforilacijo ERK1 /2 v MGC-803 in HGC-27 celic po miR-219-2-3p prekomerno. Celični ravni p-ERK1 /2 bistveno zmanjšal v miR-219-2-3p posnema-transfektiranih celic v primerjavi z bitki transfekcije ali neobdelanih celic. Vendar pa ni bilo očitne razlike opaziti v skupni ravni ERK1 /2 (sl. 5A). Te ugotovitve kažejo, da bi lahko bila pospešena rast GC celic deloma zaradi aktiviranih ERK1 /2 poti.

Bioinformatika pristop za iskanje potencialnih tarč Mir-219-2-3p

MiRNAs modulirajo gen izraz, ki v stiku s svojimi ciljnimi mRNA, ki izhajajo iz razgradnje mRNA ali translacijske represije. Da bi še dodatno raziskati mehanizem pokoj-219-2-3p v GC, smo bioinformatically (TargetScan Release 5.2 in miRDB) in funkcionalno vpleten MIR-219-2-3p v GC, in ugotovila, gene, ki so namen miR-219-2- 3p (tabela S2). Med 371 napovedanih ciljev pokoj-219-2-3p, 31 od njih pokazala velik potencial, saj so napovedali obeh programov, medtem ko so napovedali le eden od programov. Od teh 31 genov, erbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 so SOX4 ugotovljeno, da so onkogena ali v zvezi z apoptosis geni po zadnjih objavljenih dokumentov. (Sl. 5B in 5C).

Pogovor

V zadnjih letih nabrali dokazov je onkologi špekulirati, da unrevealed molekularnih dejavnikov, predvsem nekodiran RNA že razvrščeni kot "junk" play pomembne vloge v tumorigeneze in napredovanje tumorja. Odvisno od njihovih ciljev mRNA, lahko miRNAs delujejo kot tumorskih razbijal ali nosilce onkogenezo. Vendar pa mehanizmi, ki dysregulated miRNAs niso obširno raziskan, vključno z odklonsko miRNA BIOGENESIS in prepisovanje [24], [25], epigenetske spremembe [26], [27], in ojačanje ali izgubo genomskih regij, ki kodirajo miRNAs [28] .

Kot je prikazano v tem poročilu, smo analizirali izražanje pokoj-219-2-3p pri 113 bolnikih, GC in ugotovila, da je raven se zdi, da so nižje v GC. Čeprav je bil miR-219-2-3p poročali, da je tesno povezana z diabetične retinopatije [29], oligodendrocitov [15], Alzheimerjeve bolezni [30] in glioblastoma [12], ostaja njena funkcija v GC je treba določiti. Poleg tega smo pokazali, da ponovno izražanje miR-219-2-3p v GC celic za posledico indukcijo celične apoptoze in zmanjšano sposobnost preživetja celic. Ti rezultati nam je omogočilo, da špekulirajo, da je navzdol ureditev pokoj-219-2-3p lahko zagotovi prednost preživetja za GC celic. Vendar pa je mehanizem, odgovoren za pokoj-219-2-3p navzdol ureditev v GC še ni znan. Ker je izguba na 9q34.11, v kateri se nahaja miR-219-2-3p, redko odkriti v GC [31], je malo verjetno, da je alelna izguba odgovoren za down-uredbo. Po drugi strani pa smo ugotovili, da je miR-219-2-3p izrazito navzgor regulirano ko GC celice, MGC-803 in HGC-27 smo obdelali z obema 5-aza-CdR in TSA. Poleg tega je računska analiza kaže, da je miR-219-2-3p nahaja na otoku CpG na kromosomu 9q34.11. Zato se zdi možno, da se DNA metilacija in histonov Deacetilacijo lahko povezana z miR-219-2-3p uredbe. Z PPN, odkrite na nabavnem regiji pokoj-219-2-3p vzorci metilacije frekvence je bil v miR-219-2-3p navzdol urejene skupine višja kot v up-urejena skupine. Ta specifičnost opremljena hipotezo o odnosu med miR-219-2-3p izražanja in DNA metilacije. Na splošno so rezultati kažejo, da je metilacija pomemben mehanizem za pokoj-219-2-3p navzdol-ureditev v PK.

Opravili smo napovedi, ki jih TargetScan in miRDB programe in ugotovili, da bi bilo 6 geni možni cilji miR -219-2-3p. Med cilji kandidatk pokoj-219-2-3p, tirozin receptor kinaz erbB3 (epidermalni družina receptorja rastnega faktorja) je pritegnila našo pozornost. Visoke stopnje erbB3 je močno povezana z napredovanja tumorja in slabo prognozo bolnikov z [32] GC - [34] in zaviralci EGFR kinaze gefitinib bi preprečili EGFR in erbB2 aktiviranje erbB3. Medtem, erbB3 izraz služi tudi kot učinkovit pokazatelj občutljivosti na gefitinib [35]. Znano je, da potlačeno erbB3 transkripcija zavira signalnih kaskad iz ERK1 /2 poteh [36]. Vendar pa se je treba še bolj eksperimentalno potrjeni predvidene ciljne geni. Poleg tega lahko miRNAs deluje v skladu s kombinatorne vezja model, v katerem lahko ena miRNA usmerjeni več mRNK in več hkrati izraženi miRNAs lahko ciljno eno samo mRNA. Nedavne študije so pokazale, da bi se biološka pojem "en hit-multiple ciljev", uporabljen v kliničnih terapij [37]. Verjetno je, da lahko posamezen miRNA deluje prek zadruge navzdol-ureditev več ciljev ter miRNAs funkcijo tudi z odpravo prevod svojih ciljnih genov. Raziskati celoten vpliv miRNA, genomu vsej proteomskimi študij bi bilo treba storiti.

Skratka, naš izraz in funkcionalne študije kažejo, da je bila miR-219-2-3p mehanizem metilacije različno izražena in je imel funkcija protitumorski zatiranje z zakonsko ureditvijo, povezanih z 2 ERK1 /poti signala v GC. Medtem pa je bila nižja izraz miR-219-2-3p v GC osebkov povezana z višjo stopnjo in pozneje. Ponovno uvaja izraz pokoj-219-2-3p na GC celic potlačenih celično proliferacijo, migracijo, invazijo in inducira apoptozo je pokazala, da bi na osnovi miRNA theraputic vzorec služi kot osnova za razvoj novih potencialnih terapij raka želodca.

materiali in metode

Tissue osebki

želodcu tumorji in njihovi morfološko normalna tkiva (ki se nahaja > 3 cm stran od tumorja) so bili pridobljeni od novembra 2009 do novembra 2011 od 113 bolnikov GC postopku kirurgije v bolnišnici raka kitajske akademije medicinskih znanosti (CICAMS, n = 21), kitajski PLA Splošni bolnišnici (301 bolnišnica, n = 31) in prvi odvisnimi bolnišnici Shanxi Medical University (n = 61). Uporaba vzorcev tkiv za vse poskuse je odobril etičnega sveta Inštituta za osnovne medicinske vede, kitajske akademije medicinskih znanosti. Vsi udeleženci pod svojo ustno privolitev za sodelovanje v tej študiji, in njihove verbalne obveščeni soglasij so zapisali. Ta proces soglasje je odobril tudi etičnega krovu. Vzorce tkiva smo razrezali na dva dela, eden je določen s 10% formalinom za histopatološko diagnozo in drugi je takoj snap-zamrznemo v tekočem dušiku in shranili pri -196 ° C v tekočem dušiku, dokler ekstrakcijo RNA. V to skupino je sestavljalo 95 moških, 17 žensk in enega brez informacij spolov s srednjo starostjo 58 let (razpon, 31-82 let) .Formalin fiksni so-parafinske vgrajeni bloki tkiv GC, zbranih iz bolnišnice raka kitajske akademije medicinske vede (CICAMS, n = 4), med letoma 2009 in 2011. Zaradi individualnih razlik med bolniki, nismo imeli informacije o nekaterih clinicopathologic podatkov. Uporaba vzorcev tkiv za vse poskuse je bil odobren s strani vseh bolnikov in Odbor za etiko institucije. Značilnosti bolnikov so opisani v tabeli 1.

celičnih kultur in Transfekcija

Skupno 4 GC humanih celičnih linijah MGC-803 (mucinozni rakom na želodcu, slabo diferenciran), HGC-27 ( metastatskega bezgavko, nediferencirani karcinom), MKN-45 (Pečatnjak karcinom slabo diferenciran), so bile pregledane SGC-7901 (adenokarcinom, zmerno diferenciran) v tej študiji. MGC-803 HGC-27, MKN-45, je SGC-7901 celična linija, kupljena v celici Resource Center Inštituta za osnovne medicinske vede, kitajske akademije medicinskih znanosti in Peking Union Medical College (Peking, Kitajska). MGC-803 smo razmnožili v Dulbeccovem modificiranem Eagle mediju (Gipco; Invitrogen; Life Technologies, Nemčija), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS, poplitealne anevrizme, Pasching, Avstrija) in streptomicin (100 mg /ml), penicilin (100 U /ml). HGC-27, MKN-45, SGC-7901 smo vzdrževali v RPMI 1640 medija (poplitealne anevrizme), dopolnjena z 10% FBS (PAA). V GC humane celične linije MGC-803, HGC-27 so transfekciji s miR-219-2-3p mimike in negativna kontrola miRNA posnema (GenePharma, Šanghaj, Kitajska, tabela S1) v končni koncentraciji 10 nmol /L z uporabo Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca

TaqMan RT-PCR za miRNA izražanja

Total RNA je bila vzeta iz celic in tkiv s Trizol reagenta (Invitrogen, Calsbad. , CA, ZDA). MiRNAs smo kvantificirali s PCR v realnem času z uporabo TaqMan MicroRNA testa (Invitrogen, ZDA). Prvi sklop komplementarne DNA (cDNA) Sintezo smo izvedli od 1 ug celotne RNA v 12 ul končne prostornine z 2 M izvornih zanke premaz, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, ZDA). Mešanica je bila plošča pri 65 ° C za 5 minut, nato pa zmešamo s 5 x RT pufer, 0,1 M DTT, 200 U /ul MultiScribe reverzne transkriptaze in 40 U /ul RNaze inhibitor (Invitrogen, ZDA). Mešanica je bila plošča pri 37 ° C za 55 minut, 70 ° C za 15 minut, nato pa je potekala pri -20 ° C. PCR v realnem času smo izvedli z uporabo standardnega TaqMan protokol PCR. V 20 ul PCRs reakcije so vključevale 1 xl RT izdelka, 1 x Univerzalna TaqMan Master Mix in 1 × TaqMan sonda /primer mešanica (Invitrogen, ZDA, tabela S1). Vse RT reakcije, vključno z ne-template kontrole smo izvedli v treh izvodih. Vse mRNA količinska podatki so bili normalizirani na U6. Relativna količina prepisa bila izračunana na podlagi primerjalne metode CT.

5-aza-CdR in Trichostatin Nega celičnih linij

GC celične linije MGC-803 so bili zdravljeni s 5-aza 2'-deoksicitidin (5-aza-CdR; Sigma-Aldrich, ZDA) v 0,7 mol /L, 1,5 mol /l, 3 mol /L in HGC-27 so bili zdravljeni s 5-aza-CdR 0,5 mol /L, 1 mol /L, 1,5 mol /L za 3 dni ali 300 nmol /L trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, ZDA) za 24 ur. Pri kombinacijskem zdravljenju, smo celice obdelali s 5-aza-CdR za 48 ur prvič. Nato dodamo TSA (300 nmol /L), in celice obdelamo še dodatnih 24 ur. Gojišče, ki vsebuje zdravilo bil nadomeščen vsakih 24 ur. RNA celičnih linij smo očistili z TRIzola reagentom po navodilih od proizvajalca. Sintezo cDNA smo izvedli kot je opisano zgoraj, in 1 ml razredčenega cDNA za vsak vzorec smo pomnožili z RT-PCR z uporabo protokola prej opisali.

izolacija DNK in bisulfit modifikacija

genomske DNK smo dobili od -196 ° C v tekoči dušik primarnih tumorjev, in njihovo ujema sosednjih normalnih tkiv (n = 22, vključujejo 11 bolnikov, ki je izraz miR-219-2-3p so dol-urejena in ostali so up-urejena) in Rabljeni Biomed DNA Kit (Biomed, Peking, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Bisulfit obdelavo in predelavo vzorcev so bile izvedene z Epitect bisulfitom kit (Qiagen, Hilden, Nemčija). Genomsko DNA (2 mikrogramov) v 20 ul vode je bila uporabljena za vsako reakcijo in zmešamo z 85 ul bisulfita mešanici in 35 ul DNA zaščite pufer. Bisulfit konverzija je bila izvedena na termostat, kot sledi: 99 ° C za 5 minut, 60 ° C za 25 minut, 99 ° C za 5 minut, 60 ° C za 85 minut, 99 ° C za 5 minut, 60 ° C 175 min in 20 ° C za nedoločen čas. The-bisulfit obdelano DNA izoliramo s Epitect spin kolono in nato zaporedje za potrditev učinkovitosti bisulfita pretvorbe.

metilacije analiza

MSP je bila uporabljena za analizo metilacije Mir-219-2-3p gorvodno regija v celičnih linijah in tkivih. Methprimer je bila uporabljena za oblikovanje PPN premaz (Tabela S1). Izrabe PPN reakcije na nove primerji bila optimizirana z uporabo metiliranih pozitivno kontrolo (M-DNA), ki s pomočjo normalno človeško perifernih limfocitov DNK obdelan in vitro s sss sem methyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA dveh normalnih humanih perifernih limfocitov smo uporabili kot normalno kontrolo. Dotika PCR sestavljena iz dveh fazah: faza 1 vključeni začetni denaturaciji 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 45 ciklov denaturacijo pri 95 ° C 30 sekund, žarjenje pri spremenljivih temperatur za 30 sekund, in podaljšanje pri 72 ° C za 40 s. V prvem ciklu smo temperaturo kaljenja nastavljena na 58 ° C, in na vsaki od 10 naslednjih ciklih, se je temperatura žarjenje zmanjšala za 0,6 ° C. Faza 2 sestavljalo 35 ciklov 95 ° C za 30 sekund, 52 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 40 sekund. Izrabe PPN izdelki so bili analizirani na 3% poliakrilamidnih gelih

Cell proliferacija, apoptoza in celični cikel testu

Celice smo inkubirali v 10% CCK-8. (Dojindo, Kumamoto, Japonska), razredčenega v normalnih gojišče pri 37 ° C, dokler vizualno barvno pretvorbo pojavila. Stopnje širjenja smo določili pri 0, 24, 48, 72, 96 ur po transfekciji. Absorbanco vsake vdolbine smo izmerili z mikroploščnega čitalnika, nastavljenega na 450 nm in 630 nm. Vse poskuse smo izvajali v štirih izvodih. Apoptozo Test je bil opravljen na MGC-803 in HGC-27 celičnih linijah 72 ur po transfekciji uporabo PE aneksin V Apoptoza Detection Kit I (BD Pharmingen; San Diego, CA, ZDA) in analizirali s fluorescenco aktivira celice sortiranje (FACS) . Analiza celični cikel je bila opravljena na MGC-803 in HGC-27 celičnih linijah 48 ur po transfekciji z miR-219-2-3p mimike in žoga oz. Celice smo zbrali, sprali dvakrat z mrzlo PBS, določen v ledeno mrzlo 70% etanola, in inkubiramo z propidijevim jodidom (PI) in RNazo A, nato analiziran s FACS. Vsak vzorec je bilo teči v treh izvodih.

migracije celic in invazijo teste

MGC-803 in HGC-27 celice smo gojili do sotočja na 12-tudi plastične posode in obdelamo s žoga ali miR-219 -2-3p posnema. 24 ur po transfekciji smo linearno praskam rane (v trojniku) proizvedena od konfluentne celične monoplasti z uporabo 200 ul vrh pipete. Za odstranitev celic iz celičnega cikla pred poškodbi, smo celice vzdržujejo v mediju brez seruma. Za vizualizacijo preseljeni celice in celjenje ran so posnetkih pri 0, 12, 24, 36, 48, 60 in 72 h urah. Skupno deset področij so bili naključno izbrani iz vsako jamico in jih količinsko celice v treh vodnjakov vsake skupine. Za invazijo testih po 24 urah transfekciji 1 x 10 ^{5 celic v mediju brez seruma smo zasejali s transwell migracijskih komor (velikost por 8 um; Millipore, Švica), ki so bile prevlečene s Matrigel (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, ZDA) na zgornji komori. Medij, ki vsebuje 20% FBS dodamo na spodnji komori. Po 24 urah smo brez vdrla celice odstranimo z vato, invazivne celice, ki se nahajajo na spodnji površini komore so bile obarvane z May-Grunwald-Giemsu (Sigma Diagnostics; St. Louis, Missouri, ZDA) in šteje pod mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska). Poskusi so bili neodvisno ponovi trikrat.}

izolacija beljakovin in western blot

V navedenih časih, MGC-803 celice in HGC-27 celice so bile pridelane v ledeno mrzlo PBS in lizirali na ledu v hladno pripravo spremenjenega radioimunskega pufra dopolnjena z zaviralci proteaz. Koncentracija proteina določimo z BCA protein Vsebnost Kit (Bio-Rad, Milano, Italija) in enake količine proteinov smo analizirali s SDS-PAGE (10% akrilamida). Geli so electroblotted na nitroceluloza membrane (Millipore, Bedford, MA, ZDA). Za imunoblot eksperimentov, smo membrane blokirali za 2 h s 5% nemastnega suhega mleka v tris-pufrom, ki vsebuje 0,1% Tween-20 in inkubirali pri 4 ° C preko noči s primarnim protitelesom. Detekcija smo izvedli s peroksidazo konjugiranih sekundarnih protiteles z uporabo okrepljenega sistema kemiluminescenco. Primarna protitelesa, ki se uporabljajo so: GAPDH od Zhong-Shan Jinqiao (Peking, Kitajska); ERK1 /2 (kunčjega anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) in fosfo-ERK1 /2 (kunčjega anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Histologija
<

• Plos ONE: Visoka Izražanje proteina 90 toplotnega šoka je povezana z tumor agresivnost in slabo prognozo pri bolnikih z napredovalim Rak želodca
• Plos ONE: neinvaziven Vizualizacija MicroRNA-16 v Chemoresistance želodčnega raka Uporaba sistema Dual Reporter Gene Imaging