PLoS ONE: mikroRNA-219-2-3p Fungerer som en tumor suppressor i magekreft og er regulert av DNA Metylering

Abstract

Bakgrunn & Mål

Magekreft er den vanligste gastrointestinal svulst hos voksne, og er den mest dødelige formen for kreft hos mennesker. På tross av forbedringene i behandlingene, er den underliggende mekanisme av mage karsinogenese ikke godt kjent. For å definere nye modulatorer som regulerer mottakelighet for tumorgenesis, vi fokusert på MIR-219-2-3p.

Metoder

Kvantitativ RT-PCR ble benyttet for å undersøke nivået av MIR-219-2 -3p i magekreft (GC) vev (n = 113) og deres matchede tilstøtende normale vev (n = 113). In vitro celle-proliferasjon, apoptose-analyser, cellemigrering, og invasjons analyser ble utført for å belyse biologiske effekter av MIR-219-2-3p. Siden kneble av miRNA av arrangøren CpG island metylering kan være en viktig mekanisme i tumorgenesis ble GC-celler behandlet med 5-aza-2'-deoxycytidine og trichostatin A, og uttrykk endringer av MIR-219-2-3p ble deretter undersøkt av kvantitative RT-PCR. Til slutt ble metylering status av CpG øy oppstrøms for MIR-219-2-3p analysert ved metylering-spesifikk PCR i GC vev (n = 22).

Resultatene

MIR-219- 2-3p ble nedregulert i GC og cellelinjer. I tillegg forsøkene dokumentert lavere uttrykk for MIR-219-2-3p i GC prøver med høyere kvalitet og senere stadium svulster. I mellomtiden, MIR-219-2-3p utøves antiproliferativ, proapoptotiske, og antimetastatic roller og reduserte nivåer av p-ERK1 /2 i GC-celler. Videre fem-aza-2'-deoxycytidine og trichostatin En økt uttrykket (~ 2 ganger) av MIR-219-2-3p i GC-celler. Ved metylering-spesifikk PCR, ble DNA-metylering i oppstrømsområdet av MIR-219-2-3p påvist i begge tilstøtende normalt vev og kreftvev. Som forventet, metylering nivået var betydelig høyere i MIR-219-2-3p nedregulert gruppen enn oppregulert gruppe.

Konklusjoner

MIR-219-2-3p er potensielt involvert i magekreft progresjon og metastase ved å regulere ERK1 /2-relaterte signalveier, noe som kan gi en ny terapeutisk strategi for behandling av magekreft. Metylering mekanisme kan være involvert i moduler uttrykket nivået av MIR-219-2-3p i magekreft

Citation. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et al . (2013) mikroRNA-219-2-3p Fungerer som en tumor suppressor i magekreft og er regulert av DNA Metylering. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369

Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA

mottatt: 14 desember 2012; Godkjent: 26 februar 2013; Publisert: 23 april 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China National [2012, 91129716, til JY] og Beijing Municipal Science & Technology Commission [2010B071, til JY]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er 4 ^{th vanligste kreftformen og den nest høyeste årsaken til kreft død på verdensbasis. Nå til dags, pasienter med sent stadium GC er med en generell 5 års overlevelse på ca. 20% [1]. Kreft utvikler seg som et resultat av en opphopning av forskjellige endogene og eksogene årsaker. Matvaner og en økning i Helicobacter pyloriinfection er viktige eksogene årsaker til GC [2], mens genetiske, samt kosttilskudd, nivåer av hormonet gastrin [3], og andre kroniske magebetennelsesfremkallende faktorer er funnet å være assosiert med predisposisjon til kreftutvikling. Gene endringer spiller en viktig rolle i GC, og forandringer i et stort antall av onkogener og tumorsuppressorgener har allerede blitt rapportert i GC.}

Noen prognostisk tumor biomarkører i GC slik som human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2 ), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), har vært assosiert med sykdoms egenskaper og kan derfor brukes til å informere behandling av pasienten. For eksempel kan pasienter med svulster som tester positivt for HER2 bli behandlet med trastuzumab pluss kjemoterapi [4], og pasienter med svulster som tester positivt for VEGF kan bli behandlet med bevacizumab pluss kjemoterapi [5]. Imidlertid, de molekylære mekanismer som ligger bak utvikling av GC er fortsatt en utfordring, og dermed i tillegg informative biomarkører er sterkt behov.

microRNAs (miRNA) er en klasse av små RNA molekyler som er involvert i regulering av translasjon og degradering av mRNA [6 ]. Mirnas binde til komplementære sekvenser i 3-utranslaterte regioner (UTR) av sine mål mRNA og indusere mRNA degradering eller translasjonsforskning undertrykkelse [7]. Mest kjente funksjoner av mirnas er relatert til negativ genregule: mirnas stillhet genekspresjon, vanligvis ved å interferere med mRNA-stabilitet eller proteintranslasjon. I de senere år ble mirnas antatt å virke som onkogen eller tumorsuppressorgen, og bidra til kreft initiering og progresjon ved å regulere genekspresjon [8]. Oppdagelsen av cancer-spesifikk region oppstrøms hypermethylation av en rekke mirnas har vist et epigenetisk mekanisme for avvikende miRNA uttrykk [9], [10].

I human og mus, er det to genomiske loci (MIR-219- 1 og MIR-219-2) som koder MIR-219 forløper transkripsjoner. MIR-219-1 ligger på kromosom 6 (MI0000296) og mir-219-2 ligger på kromosom 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1a). Behandling av forløperen transkripsjoner av dicer genererer tre modne mirnas: Mir-219-5p fra 5 'endene av både forløpere, og MIR-219-1-3p og MIR-219-2-3p fra 3' enden av pre- MIR-219-1 og pre-MIR-219-2, henholdsvis. Siden frø regionen av disse tre modne produkter er unik, er hver miRNA spådd å regulere unike mål. Selv MIR-219-5p er kjent for å være nedregulert i flere kreft som ondartet astrocytom [12] og leverkreft [13], har ikke uttrykk for MIR-219-1-3p og MIR-219-2-3p blitt undersøkt. Interessant, MIR-199B og MIR-219-2-3p gener som ligger på nærhet til et segment av kromosom 9q34.11 (Fig. 1a). En tidligere studie vist at Mir-199B-5p ble nedregulert i medulloblastoma ved metylering av en CpG island 3 kb oppstrøms for 5'-området av MIR-199B-5p promoter [14]. Siden DNA-metylering kan påvirke store regioner av kromatin og regulerer transkripsjon av fjerne gener, er det nødvendig å undersøke hvorvidt MIR-219-2-3p blir nedregulert og regulert ved metylering som MIR-199B-5p kreft. I denne studien fant vi at Mir-219-2-3p ble nedregulert i GC vev og forbundet med progressive fenotyper av GC. Videre, re-introduksjon av MIR-219-2-3p redusert levedyktighet GC celler og indusert celle apoptose, noe som tyder på at MIR-219-2-3p var en kandidat tumor suppressor i GC. Videre metylering analyse av MIR-219-2-3p promoter indikerte at dens uttrykk ble regulert ved metylering av korrelerte CpG øyene til en viss grad. Til slutt fant vi at Mir-219-2-3p fungerte som en tumor suppressor gjennom å hemme aktiviteten til ERK1 /2 signalveien i GC-celler.

Resultater

MIR-219-2- 3p ble uttrykt forskjellig i GC og GC-cellelinjer

for å vurdere uttrykket av MIR-219-2-3p i GC, ble TaqMan RT-PCR analyse utført i 113 par av GC vev og matchet tilstøtende normale vevsprøver . Sammenlignet med normale vevsprøver, mer enn halvparten av de primære tumorer oppviste lave nivåer av MIR-219-2-3p (58%, 65 av 113 Fig. 1B). Videre fire pasienter som uttrykk for MIR-219-2-3p var signifikant nedregulert ble valgt (Fig. 1 D). Mir-219-2-3p uttrykk hos pasienter og fire GC cellelinjer (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) ble analysert for å avsløre at MIR-219-2-3p ble også ned- reguleres i GC-celler (fig. 1E). Disse resultatene antydet at nedregulert MIR-219-2-3p var en hyppig hendelse i menneskelig GC og kan være involvert i magekreftutvikling. På grunn av den universelle nedregulering av MIR-219-2-3p i testede GC cellelinjer, ble MGC-803 og HGC-27 tilfeldig valgt for videre studier.

Forholdet mellom clinicopathological faktorer og MIR-219- 2-3p uttrykk i GC

Denne studien inkluderte 113 GC pasienter. Å vurdere sammenhengen mellom MIR-219-2-3p uttrykk og clinicopathological egenskaper, ble pasientene delt inn i grupper med nedregulering og opp-regulering. Som vist i tabell 1 og fig.1C, ble det observert en statistisk signifikant sammenheng mellom ekspresjonen av MIR-219-2-3p og GC klinisk stadium. Pasientene med lavere nivåer av MIR-219-2-3p uttrykk syntes å være assosiert med svulster høyverdig og sene stadier (p = 0,047, uavhengige prøver t test). Disse data antydet at endringer av MIR-219-2-3p kan være involvert i GC progresjon.

Overuttrykte MIR-219-2-3p i GC-celler hemmer celledeling og celleoverlevelse

den bemerkelsesverdige reduksjon av MIR-219-2-3p uttrykk i GC prøver forfremmet oss å utforske mulige biologiske betydningen av MIR-219-2-3p i tumorgenesis. Gitt at MIR-219-2-3p spilt en rolle i regulering av celleproliferasjon [15], MGC-803 og HGC-27 celler ble transfektert med MIR-219-2-3p og krafse ligner og analysert for cellevekst, celle henholdsvis apoptose og cellesyklusprogresjon. Først av alt, ble RT-PCR benyttes for å måle nivået av MIR-219-2-3p etter overekspresjon eksperimenter. Vi fant ut at Mir-219-2-3p økt med mer enn 100 folder i miRNA transfektert MGC-803 og HGC-27 celler (Fig.2A). Videre CCK-8 spredning analysen vist at cellevekst ble redusert i MIR-219-2-3p ligner-transfekterte MGC-803 og HGC-27 celler sammenlignet med krafse-transfekterte celler eller ubehandlede celler (Fig. 2B). Etter transfeksjon, inhibering forholdet var 26% (48 h) og 28% (96 h) i de MGC-803-celler og 13% (72 timer) og 14% (96 h) i HGC-27-celler. Disse resultatene antydet at MIR-219-2-3p var faktisk involvert i den negative regulering av cellevekst. Det var imidlertid ingen signifikant effekt på cellesyklus arrest i MIR-219-2-3p behandlet GC-celler (fig. S1). For å møte om oppregulering av MIR-219-2-3p ville indusere GC celle apoptose og celledød, antall tidlig apoptotisk MGC-803 og HGC-27 celler etter behandling med MIR-219-2-3p ligner ble undersøkt. Som forventet, få tidlig apoptotiske celler (10% i MGC-803 eller 2,9% i HGC-27) ble påvist i krafse-behandlede celler, mens MIR-219-2-3p ligner behandlingen økte andelen av tidlig apoptotiske celler (17,5 % i MGC-803 eller 8,3 i HGC-27) som bedømmes av Annexin V farging (fig. 2C). Derfor konkluderte vi med at Mir-219-2-3p kan påvirke celle overlevelse i GC-celler.

Overuttrykte MIR-219-2-3p i GC-celler hemmer cellemigrasjon og invasjon

Å ytterligere oppdage om MIR-219-2-3p er assosiert med progresjon av GC, sårheling og transwell analysen ble utført for å analysere effekten av MIR-219-2-3p uttrykk på trekkfugl og invasive atferd MGC-803 og HGC- 27 celler. Vi har funnet at innføring av MIR-219-2-3p inn i MGC-803 og HGC-27-celler resulterte i en signifikant reduksjon i cellemigrering under lukking av et sår kunstig skapt over et sammenflytende monolag (fig. 3A). Disse cellene ble holdt i serumfritt medium i løpet av sårtilheling for å sikre at enhver forsterket vandringsadferd ikke kan bli påvirket av endret celleproliferasjon. I tillegg restaurering av MIR-219-2-3p dramatisk hemmet normalt sterk invasiv kapasitet på MGC-803 og HGC-27 celler, som bæres lavt endogent nivå av MIR-219-2-3p (Fig. 3B). Resultatene indikerte at Mir-219-2-3p overekspresjon bidrar til regulering av GC cellemotilitet og progresjon in vitro.

MiR-219-2-3p uttrykk er epigenetiske regulerte

Basert på ovennevnte funn, vi konkludere med at Mir-219-2-3p var en viktig regulator i GC. Men de regulatoriske mekanismer for Mir-219-2-3p uttrykk var fortsatt ukjent. Siden mange mirnas ble identifisert som mål for metylering regulering, slik som MIR-9, MIR-34b /c og MIR-148a med metastatisk karsinom [16], og MIR-137 og MIR-193a i munnhulekreft [17], speil 193b og MIR-145 i prostata kreft [18], [19], bestemte vi oss for å analysere reguleringsmekanisme av MIR-219-2-3p uttrykk fra sin genomiske metylering. Etter å ha analysert genomiske regionen spenner over MIR-219-2-3p genet, identifiserte vi et stort CpG island (fig. 4A). For å undersøke om MIR-219-2-3p ble epigenetiske regulert i GC, MGC-803, HGC-27 celler ble behandlet med demethyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoksycytidin (5-Aza-CDR) og histon-deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA). Deretter ekspresjonen av MIR-219-2-3p ved RT-PCR ble analysert (fig. 4B). Resultatene viser at uttrykket av MIR-219-2-3p var oppregulert i to situasjoner: for 5-Aza-CDR behandling, uttrykk for MIR-219-2-3p var oppregulert i MGC-803 ( 5-Aza-CDR 1,5 umol /l, 2,14-ganger) og HGC-27 (5-Aza-CDR 0,5 umol /l, 3,07-ganger) sammenlignet med DMSO behandlet kontrollgruppe; for 5-Aza-CDR og TSA kombinasjonsbehandling, uttrykket av MIR-219-2-3p var mye høyere i MGC-803 (5-Aza-CDR 1,5 mikromol /L, 1.98 ganger) og HGC-27 (5 -Aza-CDR 1,5 umol /l, 1,28-ganger) sammenlignet med TSA kontrollgruppen. Resultatene indikerte at epigenetiske faktorer kan påvirke MIR-219-2-3p uttrykk i GC. Synergy av demetylering og histondeacetylase hemming førte til re-uttrykk for MIR-219-2-3p i GC. For ytterligere å oppdage om MIR-219-2-3p var assosiert med metylering av GC, vi undersøkte metylering status for MIR-219-2-3p oppstrømsregion hjelp metylering spesifikk PCR (MSP, Fig. 4C). 22 par av vev (primærsvulster og deres matchet tilstøtende normalt vev) i de 113 parene ble valgt, inkludert 11 pasienter som var i besittelse lavere Mir-219-2-3p nivåer (nedregule gruppen) og 11 pasienter som besatt høyere MIR-219 -2-3p nivåer (opp-regulering gruppe). Vi fant ut at DNA metylering i oppstrøms områder av MIR-219-2-3p eksisterte i både tilstøtende normale vev og kreftvev. Imidlertid hypermethylation forholdet mellom oppstrømsregion av MIR-219-2-3p genet i den nedregule gruppen var 63,6% (7 av 11), som er høyere enn den oppregulering gruppe (36,3%, 4 av de 11 ). Disse resultatene antydet at metylering nivået av oppstrøms CpG regionen MIR-219-2-3p var høyere i MIR-219-2-3p nedregulert gruppen enn i oppregulert en.

Overuttrykte av MIR-219-2-3p demper ERK1 /2 signalveien

Aktivering av ERK1 /2 pathway ble godt dokumentert i ulike krefttyper, for eksempel GC [20], bukspyttkjertelkreft [21] og brystkreft [ ,,,0],22]. Tidligere studier har vist viktigheten av ERK1 /2-signalveien i reguleringen av migrasjon, invasjon og metastase av cancer-cellelinjer [23]. For å undersøke om MIR-219-2-3p påvirker celleaktiviteter gjennom ERK1 /2 vei, ble fosforyleringen nivået ERK1 /2 i MGC-803 og HGC-27 celler undersøkt etter MIR-219-2-3p overekspresjon. Cellulære nivåer av p-ERK1 /2 signifikant redusert i MIR-219-2-3p etterligner-transfekterte celler sammenlignet med krypterings-transfekterte eller ubehandlede celler. Men ingen åpenbar forskjell ble observert i total ERK1 /2 nivå (Fig. 5A). Disse funnene antydet at akselerert GC cellevekst kan være delvis på grunn av aktivert ERK1 /2 veier.

Bioinformatikk tilnærming for å søke etter potensielle mål av MIR-219-2-3p

mirnas modulere genet uttrykk ved å kommunisere med sine mål mRNA som resulterer i mRNA degradering eller translasjonsforskning undertrykkelse. For ytterligere å undersøke mekanismen av MIR-219-2-3p i GC, vi bioinformatically (TargetScan versjonen 5.2 og miRDB) og funksjonelt innblandet MIR-219-2-3p i GC, og fant genene målrettet av MIR-219-2- 3p (tabell S2). Blant de 371 spådd målene for MIR-219-2-3p, 31 av dem vist stort potensial siden de ble spådd av begge programmene, mens andre ble bare spådd av ett av programmene. Av disse 31 gener, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 ble SOX4 funnet å være onkogen eller apoptose relaterte gener ved tidligere publiserte artikler. (Fig. 5B og 5C).

Diskusjoner

I de senere årene, akkumulert bevis har ført onkologer å spekulere i at unrevealed molekylære faktorer, spesielt ikke-kodende RNA har vært klassifisert som "junk" play viktige roller i tumorigenesis og tumorprogresjon. Avhengig av deres mRNA-mål, kan mirnas fungere som tumor suppressors eller arrangører av onkogenese. Imidlertid er mekanismene som feilregulert mirnas har ikke blitt omfattende undersøkt, inkludert avvikende miRNA biogenese og transkripsjon [24], [25], epigenetisk endringer [26], [27], og amplifikasjon eller tap av genomiske regioner som koder mirnas [28] .

som vist i denne rapporten, analyserte vi uttrykket av MIR-219-2-3p i 113 GC pasienter og funnet at nivåene synes å være lavere i GC. Selv om MIR-219-2-3p er blitt rapportert å være nært knyttet til diabetisk retinopati [29], oligodendrocytter [15], Alzheimers sykdom [30] og glioblastom [12], forblir dens funksjon i GC som skal bestemmes. Videre har vi vist at re-ekspresjon av MIR-219-2-3p i GC-celler resulterte i induksjon av celle apoptose og redusert cellelevedyktighet. Resultatene tillatt oss å spekulere i at nedregulering av MIR-219-2-3p kan gi en overlevelsesfordel til GC celler. Men nedregulering i GC er mekanismen ansvarlig for MIR-219-2-3p fortsatt ukjent. Fordi tapet på 9q34.11, der MIR-219-2-3p ligger, er sjelden påvises i GC [31], er det usannsynlig at allel tap er ansvarlig for nedregulering. På den annen side, har vi funnet at Mir-219-2-3p var markert oppregulert ved GC-celler, MGC-803 og HGC-27, ble behandlet med både 5-Aza-CDR og TSA. I tillegg avslører beregnings analysen at Mir-219-2-3p ligger i et CpG island på kromosom 9q34.11. Derfor synes det mulig at DNA metylering og histon deacetylering kan være assosiert med Mir-219-2-3p regulering. Ved MSP, prøver metylering frekvenser oppdaget i oppstrøms regionen MIR-219-2-3p var høyere i MIR-219-2-3p nedregulert gruppen enn i oppregulert gruppe. Dette spesifisitet innredet hypotesen om en sammenheng mellom MIR-219-2-3p uttrykk og DNA metylering. Totalt sett resultatene antydet at metylering var en viktig mekanisme for MIR-219-2-3p nedregulering i GC.

Vi utførte prediksjon av TargetScan og miRDB programmer og funnet at 6 gener kan være potensielle mål fra Mir -219-2-3p. Blant søker målene for MIR-219-2-3p, kinaser reseptoren tyrosin ErbB3 (epidermal vekstfaktor reseptor familien) trakk vår oppmerksomhet. Høye nivåer av ErbB3 er sterkt assosiert med tumorprogresjon og dårlig prognose for pasienter med GC [32] - [34] og EGFR kinase hemmere gefitinib kan hindre EGFR og ErbB2 aktivering av ErbB3. I mellomtiden, ErbB3 uttrykk fungerer også som en effektiv prediktor for følsomhet for gefitinib [35]. Det er kjent at undertrykte ErbB3 transkripsjon hemmer signalisering kaskader fra ERK1 /2 veier [36]. Men de forutsagte målgener trenger å bli ytterligere eksperimentelt bekreftet. Videre kan mirnas fungere etter et kombinatorisk kretser modell, hvor en enkelt miRNA kan være rettet mot flere mRNA, og flere kouttrykte mirnas kan være rettet mot en enkelt mRNA. Nylige studier har antydet at den biologiske begrepet "ett treff-multiple mål 'kunne brukes i kliniske terapeutika [37]. Det er sannsynlig at en bestemt miRNA kan fungere gjennom samarbeidnedregulering av flere mål og mirnas funksjon også ved å undertrykke oversettelsen av sine mål gener. For å utforske den fulle effekten av en miRNA, genom-wide proteomikk studier bør gjøres.

I konklusjonen, våre uttrykk og funksjonelle studier antydet at Mir-219-2-3p ble uttrykt forskjellig ved metylering mekanisme og hadde en tumoral undertrykkelse funksjon ved å regulere ERK1 /2-relaterte signalveier i GC. I mellomtiden ble den nedre ekspresjonen av MIR-219-2-3p i GC prøver korrelert med høyere kvalitet og senere stadium. Gjeninnføre uttrykk for MIR-219-2-3p på GC celler undertrykte celleproliferasjon, migrasjon, invasjon og indusert apoptose indikerte at miRNA-baserte theraputic mønster kan tjene som grunnlag for utvikling av nye potensielle behandlinger i magekreft.

Materialer og Metoder

vevsprøver

Gastric svulster og deres morfologisk normale vev (plassert > 3 cm fra tumor) ble oppnådd mellom november 2009 og november 2011 fra 113 GC pasienter som gjennomgår kirurgi ved Cancer Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 21), kinesisk PLA General Hospital (301 sykehus, n = 31), og The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University (n = 61). Bruken av vevsprøver for alle forsøkene ble godkjent av den etiske styret ved Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences. Alle deltakerne gitt sine verbale informert samtykke til å delta i denne studien, og deres verbale informert samtykke ble skrevet ned. Dette samtykket prosessen ble også godkjent av Etisk Råd. Vevsprøver ble skåret i to deler, ble en fiksert med 10% formalin for histopatologisk diagnose, og den andre ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret ved -196 ° C i flytende nitrogen inntil RNA-ekstraksjon. Denne gruppen besto av 95 menn, 17 kvinner og en uten kjønn informasjon med en median alder på 58 år (fra 31-82 år) .Formalin fiksert parafin-embedded tissue blokker av GC ble samlet fra Kreft Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 4) mellom 2009 og 2011. på grunn av individuelle forskjeller mellom pasienter, vi manglet informasjon om noen clinicopathologic data. Bruken av vevsprøver for alle forsøkene ble godkjent av alle pasientene og av etisk komité ved institusjonen. Karakteristikken av pasienter er beskrevet i Tabell 1.

cellekulturer og Transfeksjon

Totalt 4 menneskelige GC cellelinjer MGC-803 (mucinous magekreft, dårlig differensiert), HGC-27 ( metastatisk lymfeknute, udifferensiert karsinom), MKN-45 (Signet ring karsinom dårlig differensiert), ble SGC-7901 (adenokarsinom, moderat differensiert) undersøkt i denne studien. MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 cellelinjen ble kjøpt fra Celle Resource Center of Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College (Beijing, Kina). MGC-803 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Gibco; Invitrogen, Life Technologies, Tyskland), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; PAA, Pasching, Østerrike) og streptomycin (100 ug /ml), penicillin (100 U /ml). Den HGC-27 MKN-45, SGC-7901 ble holdt i RPMI 1640 medium (PAA) supplert med 10% FBS (PAA). De menneskelige GC cellelinjer MGC-803, HGC-27 ble transfektert med MIR-219-2-3p ligner og negative kontroll miRNA etterligner (GenePharma, Shanghai, Kina, Tabell S1) ved en endelig konsentrasjon på 10 nmol /L ved hjelp Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner

TaqMan RT-PCR for miRNA Expression

Total RNA ble ekstrahert fra celler og vev med Trizol reagens (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). Mirnas ble kvantifisert ved real-time PCR bruker TaqMan mikroRNA analysen (Invitrogen, USA). Første-tråd som er komplementær DNA (cDNA) syntese ble utført fra 1 pg av total RNA i 12 ul sluttvolum inneholdende 2 M stilk-sløyfe-primer, 10 mM dNTP mix (Invitrogen, USA). Blandingen ble plate ved 65 ° C i 5 minutter, og deretter blandet med 5 x RT-buffer, 0,1 M DTT, 200 U /mL MultiScribe revers transkriptase og 40 U /pl RNase-inhibitor (Invitrogen, USA). Blandingen var plate ved 37 ° C i 55 min, 70 ° C i 15 min og deretter holdt ved -20 ° C. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en standard TaqMan PCR-protokoll. De 20 mL PCR reaksjoner inkludert 1 mL av RT produkt, 1 x Universal TaqMan Master Mix og 1 x TaqMan probe /primer mix (Invitrogen, USA, Tabell S1). Alle RT reaksjoner inkludert no-mal kontroller ble kjørt i tre eksemplarer. All mRNA kvantifisering data ble normalisert til U6. Den relative mengde av transkript ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct-metoden.

5-Aza-CDR og Trichostatin En behandling av cellelinjer

GC cellelinjer MGC-803 ble behandlet med 5-aza- 2'-deoksycytidin (5-Aza-CDR; Sigma-Aldrich, USA) på 0,7 umol /l, 1,5 umol /l, 3 umol /L og HGC-27 ble behandlet med 5-Aza-CDR på 0,5 umol /L, 1 umol /l, 1,5 umol /L i 3 dager, eller 300 nmol /L trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) i 24 timer. For kombinasjonsbehandling, ble cellene behandlet med 5-Aza-CDR i 48 timer for det første. Deretter TSA (300 nmol /L) ble tilsatt, og cellene ble behandlet i ytterligere 24 timer. Kulturmedium inneholdende medikamentet ble byttet hver 24. time. RNA av cellelinjer ble renset med TRIzol reagent følge instruksjonene fra produsenten. cDNA-syntese ble utført som beskrevet tidligere, og 1 ml av den fortynnede cDNA for hver prøve ble amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor.

DNA isolering og bisulfitt modifikasjon

Genomisk DNA ble oppnådd fra -196 ° C i flytende nitrogen primære svulster, og deres matchet tilstøtende normale vev (n = 22, omfatter 11 pasienter som ekspresjon av MIR-219-2-3p ble nedregulert og de andre ble oppregulert) og brukte Biomed DNA Kit (Biomed, Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Bisulfitt behandling og gjenvinning av prøver ble utført med Epitect bisulfitt kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA (2 pg) i 20 pl vann ble anvendt for hver reaksjon og blandet med 85 ul bisulfitt blanding og 35 ul DNA beskytte buffer. Bisulfitt omdannelse ble utført på en termocykler som følger: 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 25 min, 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 85 min, 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 175 min og 20 ° C på ubestemt tid. Den sulfitt-behandlede DNA ble utvunnet av Epitect spin kolonne og deretter sekvensert for å bekrefte effektiviteten av bisulfit konvertering.

Metylering analyse

MSP ble brukt til å analysere metylering av MIR-219-2-3p oppstrømsområdet i cellelinjer og vev. Methprimer ble anvendt for å konstruere MSP primer (tabell S1). MSP reaksjoner på nye primere ble optimalisert ved bruk av denaturert positiv kontroll (M-DNA), som ved hjelp av normale humane perifere lymfocytter DNA ble behandlet in vitro med Sss I metyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA fra to normale humane perifere lymfocytter ble anvendt som normal kontroll. Touchdown PCR bestod av to faser: Fase 1 inkludert en innledende denaturering av 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved variable temperaturer i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 40 s. I den første syklus ble glødetemperaturen innstilt på 58 ° C og er ved hver av de 10 etterfølgende sykluser, ble glødetemperaturen sank med 0,6 ° C. Fase 2 bestod av 35 sykluser med 95 ° C i 30 s, 52 ° C i 30 s, og 72 ° C i 40 sek. MSP produkter ble analysert på 3% polyakrylamidgeler

celleproliferasjon, apoptose, og cellesyklus analyse

Celler ble inkubert i 10% CCK-8. (Dojindo, Kumamoto, Japan) fortynnet i normal kulturmedium ved 37 ° C inntil visuell fargekonvertering inntraff. Sprednings priser ble bestemt på 0, 24, 48, 72, 96 timer etter transfeksjon. Absorbansen for hver brønn ble målt med en mikroplateavleser innstilt på 450 nM og 630 nM. Alle forsøkene ble utført i fire paralleller. Apoptose Analysen ble utført på MGC-803 og HGC-27 cellelinjer som 72 timer etter transfeksjon ved bruk av PE Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) og analysert ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) . Cellesyklus analyse ble utført på MGC-803 og HGC-27 cellelinjer 48 timer etter transfeksjon med henholdsvis MIR-219-2-3p ligner og krafse. Cellene ble høstet, vasket to ganger med kald PBS, fiksert i iskald 70% etanol, og inkubert med propidiumjodid (PI) og RNase A, deretter analysert ved hjelp av FACS. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer.

Cell migrasjon og invasjon analyser

MGC-803 og HGC-27 celler ble dyrket til konfluens på 12-brønners plastskåler og behandlet med krafse eller MIR-219 -2-3p etterligner. 24 timer etter transfeksjon, ble lineær skrape sår (i tre eksemplarer) opprettet på konfluent cellemonolagene ved hjelp av en 200 mL pipette tips. For å fjerne celler fra cellesyklusen før såret, ble cellene holdt i serumfritt medium. For å visualisere migrerte celler og sårheling, ble bilder som er tatt ved 0, 12, 24, 36, 48, 60 og 72 h timer. Totalt ti områdene ble valgt tilfeldig fra hver brønn og cellene i tre brønner i hver gruppe ble kvantifisert. For invasjonen analyser etter 24 timers transfeksjon, 1 x 10 ^{5-celler i serumfritt medium ble sådd ut på de transwell migrerings kamre (8 um porestørrelse, Millipore, Sveits) som ble belagt med Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) i øverste kammer. Media inneholdende 20% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timer ble de ikke-invaderende celler som fjernes med en bomullsdott, invaderende celler lokalisert på den nedre overflate av kammeret ble farget med May-Grunwald-Giemsa beis (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA) og telt ved bruk av et mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Forsøkene ble uavhengig gjentatt tre ganger.}

Protein isolasjon og western blotting

På de angitte tidspunkter, MGC-803 celler og HGC-27 celler ble høstet i iskald PBS og lysert på is i kald fremstilling av modifisert radioimmunopresipitasjon buffer supplementert med proteasehemmere. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milano, Italia) og like mengder av proteiner ble analysert ved SDS-PAGE (10% akrylamid). Geler ble elektroblottet på nitrocellulosemembraner (Millipore, Bedford, MA, USA). For Immunoblotanalyse eksperimenter ble membranene blokkert i 2 timer med 5% ikke-fett tørrmelk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20, og inkubert ved 4 ° C over natten med primært antistoff. Deteksjon ble utført ved peroksydase-konjugerte sekundære antistoffer ved hjelp av den forbedrede kjemiluminescens-systemet. Primære antistoffer som ble brukt var: GAPDH fra Zhong Shan JinQiao (Beijing, Kina); ERK1 /2 (kanin anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) og fosfor-ERK1 /2 (kanin anti-fosfor-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Histologi
<

• PLoS ONE: Høy Expression of Heat Shock Protein 90 er forbundet med Tumor Aggressivitet og dårlig prognose hos pasienter med avansert Gastric Cancer
• PLoS ONE: Ikke-invasiv visualisering av mikroRNA-16 i Chemoresistance av magekreft Ved hjelp av en Dual Reporter Gene Imaging System