PLoS ONE: mikrornk-219-2-3p djeluje kao supresor tumora na rak želuca, a reguliran je DNK Methylation

Sažetak pregled

Pozadina & Ciljevi pregled

Rak želuca je najčešći gastrointestinalnog tumora u odraslih i to je najsmrtonosniji oblik raka kod ljudi. Usprkos poboljšanja u liječenju, temeljni mehanizam želučanog karcinogeneze nije dobro poznat. Za određivanje nove regulatore koji reguliraju osjetljivost na tumorgenesis, usredotočili smo se na Mir-219-2-3p. Pregled

Metode

Kvantitativna RT-PCR je zaposlen istražiti razinu Mir-219-2 -3p kod raka želuca (GC) tkiva (n = 113), a njihove podudaraju susjedna normalna tkiva (n = 113). Proliferacije stanica, in vitro pokusima apoptoze, migraciju stanica, i pokusima invazije provedene su u objašnjenu biološke učinke Mir-219-2-3p. Budući da utišavanje Mirne od promotora CpG otoku metilacije može biti važan mehanizam u tumorgenesis, GC stanice su tretirane s 5-aza-2'-deoksicitidina i Trihostatin A i ekspresije promjene Mir-219-2-3p naknadno pregledao kvantitativno RT-PCR. Konačno, metilacije status otoka CpG uzvodno od Mir-219-2-3p analiziran je metilacije specifičan PCR u GC tkiva (n = 22). Pregled

Rezultati

Mir-219- 2-3p je dolje regulirana u GC i staničnim linijama. Osim toga, eksperimenti dokumentirano donji izraz Mir-219-2-3p u GC uzoraka s viših razreda i kasnije tumora pozornici. U međuvremenu, Mir-219-2-3p vrši antiproliferativne, proapoptotskih i antimetastazna uloge i smanjene razine p-ERK1 /2 u GC stanicama. Nadalje, 5-aza 2'-deoksicitidin-i trihostatin A povisuje ekspresiju (~2 puta) Mir-219-2-3p u GC stanicama. Metiliranjem specifične PCR DNA metilacije u uzvodnom području Mir-219-2-3p otkriven je u oba susjedna normalna tkiva i raka tkiva. Kao što se očekivalo, razina metilacije bio znatno veći u Mir-219-2-3p dolje regulira skupinu od gore održavanoj grupi. Pregled

Zaključci pregled

Mir-219-2-3p je potencijalno uključeni u želučanom progresiju raka i metastaza reguliranjem vezane 2 ERK1 /signala, koji mogu pružiti novi terapijski postupak za liječenje karcinoma želuca. Metilacija mehanizam može biti uključen u modulaciji razinu ekspresije Mir-219-2-3p u karcinomu želuca pregled

Izvor. Lei H Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B i sur , (2013) mikrornk-219-2-3p djeluje kao supresor tumora na rak želuca, a reguliran je DNA metilacije. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369 pregled

Urednik: Arun Rishi, Wayne State University, United States of America pregled

Primljeno: 14. prosinca 2012. godine; Prihvaćeno: 26. veljača 2013; Objavljeno: 23. travanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Lei i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od potpora iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine [2012, 91129716, na JY] i Peking Općinski Science &aMP; Povjerenstvo za tehnologiju [2010B071, da JY]. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je 4 ^{th najčešćih karcinoma i drugi najviši uzrok smrti od raka u svijetu. Danas, bolesnici s kasnim stadijem GC su s ukupnim 5-godišnje preživljavanje oko 20% [1]. Rak razvija kao posljedica nakupljanja različitih endogenih i egzogenih uzroka. Prehrambene navike i povećanje Helicobacter pyloriinfection važni su egzogeni uzroci GC [2], dok su genetski, kao i dijetalna, razine gastrina hormona [3], i drugih kroničnih želučanih upala koje uzrokuju čimbenici utvrđeno da je povezan s predispozicijom do razvoja raka. Genske izmjene igraju važnu ulogu u GC, te promjene u velikom broju onkogena i tumorskih supresorskih gena već su iskazane u GC. Pregled}

Neki prognostički tumorskih biljega u GC takvih kao receptor faktora rasta epiderma humani 2 (HER2 ), faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), epidermalni faktor rasta (EGFR), povezani su s karakteristika bolesti i stoga se mogu upotrijebiti za obavijesti s pacijentom. Na primjer, pacijenti s tumorima koji su ocijenjeni pozitivnim na HER2 se mogu tretirati sa trastuzumab plus kemoterapijom [4], a pacijenti s tumorima koji pozitivni za VEGF se mogu tretirati sa bevacizumab plus kemoterapijom [5]. Međutim, molekularni mehanizmi na kojima se temelji razvoj GC ostaje izazov, čime se dodatno informativne biomarkeri su hitno potrebni. Pregled

mikroRNA (Mirna) su klasa malih RNA molekula uključenih u regulaciju prijevod i razgradnje mRNA [6 ]. MiRNAs vezanje na komplementarne sljedove u 3 'netranslatiranim regijama (UTR) od ciljnih mRNA i induciraju degradacija mRNA ili translacijsku represiju [7]. Većina poznatih funkcije miRNAs se odnose na negativne regulaciji gena: izraz miRNAs tišina gena, najčešće ometaju stabilnost mRNA ili proteina prijevod. U posljednjih nekoliko godina, miRNAs se vjerovalo da djeluju kao onkogena ili tumor supresorski gen, te doprinijeti početak i progresiju raka regulira ekspresiju gena [8]. Otkriće raka specifične Gornja regija Hipermetilacija brojnih miRNAs pokazala epigenetičku mehanizam za Mirne izražavanja abcrantnog [9], [10]. Pregled

U čovjeka i miša, postoje dva genomska loci (Mir-219- 1 i mir-219-2), koji kodira mir-219 prekursora transkripata. Mir-219-1 nalazi se na kromosomu 6 (MI0000296) i Mir-219-2 nalazi se na kromosomu 9 (MI0000740) [11] (sl. 1). Obrada prekursora transkripata od strane kockar generira tri zrele miRNAs: Mir-219-5p iz 5 'krajevima obiju prekursora i Mir-219-1-3p i Mir-219-2-3p od 3' kraja pre mir-219-1 i pre-mir-219-2, respektivno. Budući da je sjeme područje ove tri zrelih proizvoda je jedinstven, svaki Mirna predviđa se da će regulirati jedinstvene ciljeve. Iako je Mir-219-5p je poznato da se dolje regulirana multiple raka, kao što su maligni astrocytoma [12] i hepatocelularnog karcinoma [13], izraz Mir-219-1-3p i Mir-219-2-3p nema studirao. Zanimljivo, Mir-199b i Mir-219-2-3p geni se nalaze na blizinu segment kromosoma 9q34.11 (sl. 1). Prethodna studija pokazala je da Mir-199b-5p je dolje regulirana u meduloblastom metiliranjem na otoku CpG 3 kb uzvodno od 5'-stranici Mir-199b-5p promotor [14]. Od metilacije DNA može utjecati na velike regije kromatina i reguliraju transkripciju gena dalekih, potrebno je istražiti da li Mir-219-2-3p se regulirati na dolje i regulira metilacije kao Mir-199b-5p u rak. U ovom istraživanju, otkrili smo da Mir-219-2-3p je dolje regulirano GC tkiva i povezano s progresivnim fenotipova GC. Osim toga, ponovno uvođenje Mir-219-2-3p smanjio održivost GC stanica i inducirane stanične apoptoze, što upućuje da je Mir-219-2-3p je tumor supresor kandidat u GC. Daljnja analiza metilacije Mir-219-2-3p promotora pokazuju da njegov izraz bio je reguliran metilacije korelirajućih CpG otoka do neke mjere. Na kraju, otkrili smo da Mir-219-2-3p djelovao kao supresor tumora kroz inhibiciju aktivnosti ERK1 /2 signalnog puta u GC stanicama. Pregled

Rezultati

Mir-219-2- 3p različito je izražen u GC i GC stanične linije

Da bi se procijenio izraz Mir-219-2-3p u GC, TaqMan RT-PCR analiza je provedena u 113 parova GC tkiva i uskladiti susjednih uzoraka normalnog tkiva , U usporedbi s uzorcima zdravog tkiva je više od polovice primarnih tumora izloženi niskim razinama Mir-219-2-3p (58%, 65 113, Sl. 1B). Osim toga, četiri pacijenta čija ekspresija Mir-219-2-3p bile značajne dolje regulirana su izabrani (sl. 1d). Mir-219-2-3p izraz u onih pacijenata i četiri GC staničnih linija (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) je analizirao da bi se otkrilo da je Mir-219-2-3p je također preuzet regulirana u GC stanicama (Sl. 1 E). Ovi rezultati sugeriraju da se regulira-Mir-219-2-3p bio čest događaj u ljudskoj GC i mogu biti uključeni u želučanoj karcinogeneze. Zbog sveopće down-regulacije Mir-219-2-3p u ispitivanim staničnim linijama GC, MGC-803 i HGC-27 nasumično odabrani su za daljnja proučavanja. Pregled

Odnos kliničkopatološkim čimbenika i Mir-219- 2-3p izraz u GC Netlogu

Ovo istraživanje je uključeno 113 GC pacijenata. Da bi se procijenila korelaciju između Mir-219-2-3p izražavanja i kliničkopatološkim karakteristikama, bolesnici su podijeljeni u skupine s down-regulacije i up-regulacije. Kao što je prikazano u tablici 1 i Slika 1C, statistički značajna povezanost između skupina izražavanja Mir-219-2-3p i GC kliničkoj fazi. Pacijenti s nižim razinama Mir-219-2-3p izražavanja, čini se, povezano s visoko kvalitetni i kasni stupanj tumora (p = 0,047, neovisan uzorci t test). Ovi podaci sugerirali su kako promjene Mir-219-2-3p mogli biti uključeni u GC napredovanje. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-219-2-3p u GC stanicama inhibira proliferaciju stanica i preživljavanje stanica pregled

na osobit smanjenje Mir-219-2-3p izražavanja u uzorcima GC nas promovira istražiti mogući biološki značaj Mir-219-2-3p u tumorgenesis. S obzirom da je Mir-219-2-3p igrao ulogu u regulaciji stanične proliferacije [15], MGC-803 and HGC-27 stanice su transfektirane sa Mir-219-2-3p i otimati oponaša i analizirani za rast stanica, stanica apoptoze i progresiju staničnog ciklusa respektivno. Prije svega, RT-PCR je korištena za mjerenje razine Mir-219-2-3p nakon prekomjerne ekspresije eksperimenata. Otkrili smo da je Mir-219-2-3p povećan za više od 100 nabora u Mirne transfektirane MGC-803 i HGC-27 stanice (2A). Nadalje, CCK-8 Test proliferacije pokazala da stopa rasta stanica je smanjen u Mir-219-2-3p oponaša transfektirane MGC-803 i HGC-27 stanica u usporedbi s otimati transfektirane stanice ili netretirane stanice (Sl. 2b). Nakon transfekcije je razmjer inhibicije bio 26% (48 h) i 28% (96 h) u MGC-803 stanica, 13% (72 h) i 14% (96 h) u HGC-27 stanica. Ovi rezultati sugeriraju da je Mir-219-2-3p doista bio uključen u negativnom regulaciji staničnog rasta. Međutim, nije bilo značajnog učinka na staničnog ciklusa u Mir-219-2-3p tretiranih GC stanicama (Sl. S1). Da bi se riješila li up-regulaciji Mir-219-2-3p će izazivati ​​GC staničnoj apoptozi i smrt stanica, broj rane apoptoze MGC-803 i HGC-27 stanica nakon tretmana s Mir-219-2-3p oponaša bio ispitivan. Kao što se očekivalo, malo rano apoptoze stanice (10% u MGC-803 ili 2,9% u HGC-27) otkrivene su u stanicama otimati obrađena, dok je Mir-219-2-3p imitira liječenja povećao postotak ranih apoptotičnih stanica (17,5 % u MGC-803 ili 8,3 u HGC-27), kao suđeni po Aneksin V bojenja (Sl. 2C). Dakle, došli smo do zaključka da je Mir-219-2-3p može utjecati na preživljavanje stanica u GC stanicama. Pregled

Prekomjerna ekspresija Mir-219-2-3p u GC stanicama inhibira migraciju stanica i invazija pregled

Da dodatno otkriti da li Mir-219-2-3p je povezana s progresijom GC, zacjeljivanje rana i bunara testa provedena su za analizu učinka Mir-219-2-3p izražavanja na migracije i invazivnog ponašanja MGC-803 i HGC- 27 stanice. Našli smo da uvođenje Mir-219-2-3p u MGC-803 i HGC-27 stanica rezultirala značajnim smanjenjem stanične migracije tijekom zatvaranja umjetnom rane stvorio preko konfluentnom sloja (Sl. 3A). Stanice su održavane u mediju bez seruma tijekom zacjeljivanja rana osigurati da prošireni migracijski ponašanje se ne može utjecati proliferacijom promijenjenom stanica. Osim toga, obnova Mir-219-2-3p dramatično inhibira normalno jak invazivni kapacitet MGC-803 i HGC-27 stanica, koje nose niske endogene razine Mir-219-2-3p (sl. 3b). Ovi rezultati pokazuju da Mir-219-2-3p prekomjerna ekspresija doprinosi regulaciji GC stanične pokretljivosti i napredovanja in vitro. Pregled

Mir-219-2-3p izraz epigenetically regulirano pregled

Na temelju Navedeni rezultati, možemo zaključiti da je mir-219-2-3p je važan regulator u GC. Međutim, regulatorni mehanizmi Mir-219-2-3p izraza su još uvijek nepoznati. Budući da su mnogi miRNAs identificirani kao ciljevi regulacije metilacije, kao što su Mir-9, Mir-34B /C i Mir-148a u metastatskih karcinoma [16], a Mir-137 i Mir-193.a u oralni karcinom [17], miR- 193.b i Mir-145 kod raka prostate [18], [19], odlučili smo analizirati regulatorni mehanizam Mir-219-2-3p izraza iz svoje genomske metilacije. Nakon analize genomske području koje obuhvaća gen Mir-219-2-3p, identificirali smo veliki CpG otok (Sl. 4a). Istražiti da li miR-219-2-3p epigenetically je regulirana u GC, MGC-803, HGC-27 stanice su tretirane s inhibitorom demethyltransferase, 5-aza 2'-deoksicitidin-(5-aza-CDR) i histon-deacetilaze inhibitor trihostatin A (TSA). Tada je ekspresija Mir-219-2-3p pomoću RT-PCR se analizira (Sl. 4B). Rezultati pokazuju da je ekspresija Mir-219-2-3p bila viša u dvije situacije: za liječenje 5-aza-CDR, izraz Mir-219-2-3p bila viša u MGC-803 ( 5-aza-CDR 1.5 umol /L; 2,14 puta) i HGC-27 (5-aza-CDR 0,5 umol /L; 3,07 puta), u usporedbi s DMSO kontrolne tretirane skupine; za kombinirano liječenje s 5-aza-CDR i TSA, izraz Mir-219-2-3p bio mnogo veći u MGC-803 (5-aza-CDR 1,5 umol /l; 1,98 puta) i HGC-27 (5 aza-CDR 1.5 umol /L; 1,28) u usporedbi s kontrolnom skupinom TSA. Ovi rezultati pokazuju da Epigenetske faktori mogu utjecati Mir-219-2-3p izraz u GC. Sinergija demetilitanog i HDAC inhibicija dovela je do ponovnog izražavanja Mir-219-2-3p u GC. Kako bi se dalje otkriva da li miR-219-2-3p povezana je sa metiliranjem GC, ispitali smo stanje metiliranjem miR-219-2-3p uzvodnog područja korištenjem metilacija specifična PCR (MSP, Sl. 4C). odabrana su 22 para tkiva (primarnih tumora i njihovih podudarnih susjedna normalna tkiva) u 113 parova, uključujući i 11 pacijenata koji posjeduju nižu Mir-219-2-3p razine (down-regulacije grupa), te 11 bolesnika koji posjeduju višu Mir-219 -2-3p razine (up-regulaciji skupina). Otkrili smo da je DNA metilacije na uzvodnim područjima Mir-219-2-3p postojala u oba susjedna normalna tkiva i raka tkiva. Međutim, Hipermetilacija omjer uzvodnog područja Mir-219-2-3p gena u down-regulacije skupini bila je 63,6% (7 od 11), koji je bio veći od skupine up-regulacije (36,3% 4. 11 ). Ovi rezultati sugeriraju da je razina metilacije uzvodne CpG regiji Mir-219-2-3p bila je viša u Mir-219-2-3p dolje regulira skupinu nego u up-regulirana jedan. Pregled

Prekomjerna Mir-219-2-3p prigušuje ERK1 /2 signalnog puta pregled

Aktivacija ERK1 /2 puta je bio dobro dokumentiran u različitim vrstama tumora, kao što su GC [20], rak gušterače [21] i raka dojke [ ,,,0],22]. Prethodne studije su pokazale važnost ERK1 /2 signalnog puta u regulaciji migracije, invazije i metastaziranja raka stanične linije [23]. Da bi istražili da li Mir-219-2-3p utječe na stanične aktivnosti kroz ERK1 /2 staze, razina fosforilacija ERK1 /2 u MGC-803 i HGC-27 stanica ispitana je nakon Mir-219-2-3p prekomjernom ekspresijom. Stanične razine p-ERK1 /2 značajno smanjio u Mir-219-2-3p oponaša transficiranih stanica u usporedbi s otimati transfektirane ili netretirane stanice. Međutim, bez očita razlika uočena je u ukupnom ERK1 /2 razine (Sl. 5a). Ovi nalazi sugeriraju da je ubrzani rast GC stanica može biti djelomično zbog aktiviranih ERK1 /2 putevi. Pregled

Bioinformatika pristup za traženje potencijalnih meta Mir-219-2-3p Netlogu

MiRNAs modulirati gen izraz interakcijom sa svojim ciljnim mRNA za posljedicu degradaciju mRNA ili translacijske represije. Kako bi se dodatno istražiti mehanizam Mir-219-2-3p u GC, mi bioinformatically (TargetScan Izdanje 5.2 i miRDB) i funkcionalno medjusobno Mir-219-2-3p u GC i našao gena ciljani Mir-219-2- 3p (Tablica S2). Među 371 predviđenih ciljeva Mir-219-2-3p, njih 31 je prikazano visok potencijal jer su predvidjeli oba programa, dok su drugi bili predviđeni samo jedan od programa. Od tih 31 gena, erbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 Utvrđeno je da su onkogena ili apoptoza vezanih gena prethodnih objavljenih radova. (Sl. 5B i 5C). Pregled

Rasprava pregled

U posljednjih nekoliko godina, nagomilanih dokaza dovela onkologa nagađati da skrivene molekularne čimbenike, posebice nekodirajuće RNA prethodno klasificirani kao "junk", predstava važne uloge u nastanku tumora i kod napredovanja tumora. Ovisno o svojim ciljevima mRNA, miRNAs mogu funkcionirati kao tumora smetnji ili promotora onkogcnczom. Međutim, mehanizmi koji nereguliranom miRNAs nisu široko studirao, uključujući abcrantnog Mirna biogenezu i transkripciju [24], [25], epigenetičke promjene [26], [27], i pojačanje gubitka genomskih regija koje kodiraju miRNAs [28] . pregled

Kao što je prikazano u ovom izvješću, analizirali smo ekspresiju Mir-219-2-3p u 113 GC pacijenata i otkrili da su razine čini se da su niži u GC. Iako je Mir-219-2-3p je izvijestila da su blisko povezane sa dijabetičke retinopatije [29], oligodendrociti [15], Alzheimerova bolest [30] i glioblastom [12], njegova funkcija u GC i dalje treba utvrditi. Nadalje, prikazan smo da ponovno ekspresija Mir-219-2-3p u GC stanica rezultirala induciranje stanične apoptoze i smanjene vitalnosti stanica. Ovi rezultati nam je omogućilo da nagađaju da-naniže Mir-219-2-3p mogli osigurati opstanak prednost na GC stanicama. Međutim, mehanizam odgovoran za Mir-219-2-3p Smanjivanje se u GC je još uvijek nepoznat. Budući da je gubitak na 9q34.11, gdje se nalazi Mir-219-2-3p, rijetko otkrije u GC [31], malo je vjerojatno da alela gubitak je odgovoran za down-regulacije. S druge strane, otkrili smo da miR-219-2-3p bila značajno doregulirani kada GC stanice MGC-803 i HGC-27, su tretirane i 5-aza-CDR i TSA. Osim toga, računalna analiza otkriva da je Mir-219-2-3p se nalazi u otoku CpG na kromosomu 9q34.11. Stoga, čini se mogućim da DNA metiliranje i deacetiliranje histona može biti povezana s miR-219-2-3p regulacije. Do MSP, uzorci metilacije frekvencije otkriveni u uzvodnom području Mir-219-2-3p bila je viša u Mir-219-2-3p dolje održavanoj skupini nego u up-regulirana grupi. Ova specifičnost namješten hipotezu o povezanosti Mir-219-2-3p izražavanja i metilacije DNA. Sve u svemu, rezultati sugeriraju da metilacije bio važan mehanizam za Mir-219-2-3p dolje-regulacije u GC. Pregled

Izvršili smo predviđanja od strane TargetScan i miRDB programa i utvrdili da 6 geni mogu biti potencijalne mete Mir -219-2-3p. Među ciljevima kandidata Mir-219-2-3p, receptor tirozin kinaze erbB3 (epidermalni faktor rasta receptor obitelji) privukao našu pozornost. Visoke razine erbB3 jako povezana sa progresijom tumora i lošom prognozom bolesnika s GC [32] - [34] i inhibitori EGFR kinaze gefitinib mogao spriječiti EGFR i erbB2 aktivaciju erbB3. U međuvremenu, erbB3 izraz također služi kao učinkovit prediktor osjetljivosti na gefitinib [35]. Poznato je da se potisnuti erbB3 transkripcija inhibira signalnih kaskada sa ERK1 /2 putova [36]. Međutim, predviđeno ciljne gene treba dodatno eksperimentalno potvrditi. Štoviše, miRNAs može funkcionirati u skladu s kombinatorne modelu krugova, u kojima jedan Mirna može ciljati više mRNA, a nekoliko coexpressed miRNAs smiju ciljati jednu mRNA. Nedavna istraživanja pokazuju da je biološki koncept 'one hit-više meta' bi se mogla koristiti u kliničkim lijekova [37]. Vrlo je vjerojatno da određena Mirna može funkcionirati kroz kooperativni down-regulacije više ciljeva i miRNAs funkcijom suzbijanju prijevod svojih ciljnih gena. Kako bi istražili puni učinak od Mirne, Genome-wide proteomskom studija treba biti učinjeno. Pregled

Na kraju, naš izraz i funkcionalne studije tvrde da Mir-219-2-3p različito je izrazio metilacije mehanizma i imao tumornog potiskivanje funkcija reguliranjem vezane uz 2 ERK1 /signalnih putova u GC. U međuvremenu, to je niža ekspresija Mir-219-2-3p u GC uzoraka bila povezana s većom ocjenom i kasnijoj fazi. Ponovnog uvođenja izražavanje Mir-219-2-3p na GC stanicama potisnutih stanične proliferacije, migracije, invazije i inducira apoptozu naznačeno da Mirna bazi theraputic uzorak može poslužiti kao osnova za razvoj novih potencijalnih terapija kod raka želuca. Pregled

Materijali i metode

Tissue Uzorci pregled

želučanih tumora i njihovih morfološki normalnih tkiva (nalazi se > udaljen 3 cm od tumora) dobiveni su od studenog 2009. do studenog 2011. godine od 113 GC pacijenata koji se podvrgavaju operacija u bolnici za rak kineske akademije medicinskih znanosti (CICAMS, n = 21), Kineski PLA Opće bolnice (301 bolnica, n = 31), a prvi u poslovnoj vezi bolnici Shanxi Medical University (n = 61). Uporaba uzoraka tkiva za sve eksperimente odobrilo je Etičko povjerenstvo Instituta osnovnih medicinskih znanosti, Kineske akademije medicinskih znanosti. Svi sudionici izrazili usmeno informirani pristanak za sudjelovanje u ovom istraživanju, a njihovi verbalni informirani pristanak su zapisane. Ovaj proces pristanak je također odobren od strane etičkog odbora. Uzorci tkiva izrezana su u dva dijela, jedan je fiksiran s 10% formalinu za patohistološku dijagnozu, a drugi je odmah momentalno smrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -196 ° C u tekućem dušiku do ekstrakciju RNK. Ova skupina se sastojala od 95 muškaraca, 17 žena i jedan bez rodnog informacije s medijanom dobi od 58 godina (raspon 31-82 godina) .Formalin-fiksna parafin-ugrađen tkiva blokova GC su prikupljeni iz bolnice za rak kineske akademije medicinskih znanosti (CICAMS, n = 4) između 2009. i 2011. s obzirom na individualne razlike između pacijenata, nedostajalo mi informacije o nekim kliničko podataka. Uporaba uzoraka tkiva za sve eksperimente je odobren od strane svih pacijenata i Etičkog povjerenstva ustanove. Karakteristike pacijenata prikazane su u tablici 1.

Stanične kulture i transfekcije pregled

Ukupno 4 GC humanih stanica MGC-803 (mucinozni raka želuca, slabo diferencirani) HGC-27 ( metastatski limfni čvor, nediferencirani karcinom), MKN-45 (pečatni prsten karcinom slabo diferencirani), SGC-7901 (adenokarcinom, umjereno diferencirani) su ispitani u ovoj studiji. MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 stanična linija je kupljen od Cell Resource Center of Institute of temeljnih medicinskih znanosti, Kineske akademije medicinskih znanosti i Peking Union Medical College (Peking, Kina). MGC-803 je raširen u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (Gibco; Invitrogen, Life Technologies, Njemačka) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; PAA, Pasching, Austrija) i streptomicina (100 ug /ml), penicilin (100 U /ml). HGC-27 MKN-45, SGC-7901 su održavane u RPMI 1640 mediju (PAA) obogaćenom sa 10% FBS (PAA). GC ljudskih staničnih linija MGC-803, HGC-27 su transficirane Mir-219-2-3p oponaša i negativnih kontrola Mirna oponaša (GenePharma, Shanghai, China, tablica S1) u konačnoj koncentraciji od 10 nmol /L pomoću Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA), u skladu s uputama proizvođača pregled

TaqMan RT-PCR za Mirne iskazivanje pregled

Ukupna RNA se ekstrahira iz stanica i tkiva s Trizol reagensa (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNAs kvantificirane su u realnom vremenu PCR uporabom TaqMan mikrornk testa (Invitrogen, USA). Prvi lanca komplementarne DNA (cDNA), sinteza se izvodi od 1 ug ukupne RNA u 12 ul konačnog volumena koji je sadržavao 2 M stem petlje primera, 10 mM dNTP mix (Invitrogen, USA). Mješavina je bila ploča na 65 ° C 5 min, a zatim se pomiješa s 5 × RT pufera, 0,1 M DTT, 200 U /ul MultiScribe reverzne transkriptaze i 40 U /ul inhibitora RNaze (Invitrogen, USA). Mješavina je bila ploča na 37 ° C kroz 55 minuta, 70 ° C tijekom 15 minuta i tada se drži na -20 ° C. Realnom vremenu PCR je izveden upotrebom standardnog TaqMan PCR protokol. 20 ul PCR reakcije uključene 1 ul RT proizvoda, 1 x Univerzalna TaqMan Master Mix i 1 × TaqMan sonda /primer mix (Invitrogen, USA, tablica S1). Sve RT reakcije, uključujući bez-predloška kontrole su pokrenuti u tri primjerka. Svi podaci mRNA kvantifikacija je normalizirana na U6. Relativna količina transkripata je izračunata korištenjem usporedne Ct metode. Pregled

5-aza-CDR i Trihostatin A liječenje staničnih linija pregled

GC stanične linije MGC-803 su bili tretirani s 5-aza 2'-deoksicitidin (5-aza-CDR, Sigma-Aldrich, USA) u koncentraciji 0,7 umol /L, 1,5 umol /L, 3 umol /L i HGC-27 su tretirani s 5-aza-CDR na 0,5 umol /L, 1 umol /L, 1.5 umol /L tijekom 3 dana i 300 nmol /L trihostatin A (TSA, Sigma-Aldrich, USA) na 24 sata. Za kombiniranog tretmana, stanice su tretirane s 5-aza-CDR za 48 sati prvo. Zatim TSA (300 nmol /l) je dodan i stanice su tretirane tijekom dodatnih 24 sata. Medij kulture koji sadrži lijek je zamijenjeno svakih 24 sata. RNA stanične linije se pročišćava Trizol reagensa prema uputama proizvođača. Sinteza cDNA bila je provedena kao što je ranije opisano, i 1 ml razrijeđene cDNA za svaki uzorak je pojačan pomoću RT-PCR pomoću protokola je prethodno opisano. pregled

izolaciju DNA i bisulfit modifikacija pregled

genomska DNA koji je dobiven od -196 ° C u tekućem tumora dušika primarnih i njihova podudaraju susjedna normalna tkiva (n = 22, uključuje 11 pacijenata koji izraz Mir-219-2-3p podregulirani a ostali su up-regulirana) i Rabljeni Biomed DNA Kit (Biomed, Peking, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Bisulfit liječenje i oporavak uzoraka provedena je s Epitect bisulfitom kit (Qiagen, Hilden, Njemačka). Genomska DNA (2 ug) u 20 ul vode korištene u svakoj reakciji i miješa s 85 ul mješavine bisulfita i 35 ul DNA zaštite pufera. Bisulfit konverzija se izvodi na termocikleru na sljedeći način: 99 ° C tijekom 5 minuta, na 60 ° C tijekom 25 min, 99 ° C kroz 5 minuta, 60 ° C tijekom 85 min, 99 ° C tijekom 5 minuta, na 60 ° C za 175 min i 20 ° C na neodređeno vrijeme. Bisulfitnog tretiranih DNA je izoliran Epitect centrifugiranja kolone i zatim sekvencirani da se potvrdi efikasnost bisulfita pretvorbe. Pregled

Metilacija analiza pregled

MSP korišten je za analizu metiliranje Mir-219-2-3p Gornja regija u staničnim linijama i tkivima. Methprimer se koristi za dizajniranje MSP primera (Tablica S1). MSP reakcije na nove primera optimizirati korištenjem Methylated pozitivna kontrola (M-DNA), koja koristi normalna ljudska perifernih limfocita DNK tretirane in vitro sa SSS I metiltransferaze (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA dvaju normalnih humanih limfocita u perifernoj se koristi kao normalnom kontrolom. Gol PCR se sastojao od dvije faze: faze 1 uključuje početni denaturacije pri 95 ° C tijekom 5 minuta, nakon čega slijedi 45 ciklusa denaturacije na 95 ° C za 30 s, zagrijavanje na promjenjive temperature kroz 30 sekundi i ekstenzijom na 72 ° C za 40 s. U prvom ciklusu, temperatura zagrijavanja je postavljen na 58 ° C, a na svakom od 10 uzastopnih ciklusa, temperatura zagrijavanja je manja od 0,6 ° C. 2. faza sastojala se od 35 krugova od 95 ° C za 30 s, 52 ° C kroz 30 s, te 72 ° C tijekom 40 sekundi. MSP proizvodi su analizirani na 3% poliakrilamidnim gelovima

stanične proliferacije, apoptoze i staničnog ciklusa test pregled

Stanice su inkubirane u 10% CCK-8. (Dojindo, Kumamoto, Japan) koji je razrijeđen u normalnim medij kulture na 37 ° C do završetka pretvorbe vizualni boje dogodilo. Proliferacije stope određene su pri 0, 24, 48, 72, 96 sati nakon transfekcije. Mjerena je apsorbancija svake jažice je izmjeren s čitačem mikroploče postavljen na 450 nm i 630 nm. Svi pokusi su provedeni u kvadriplikatu. Test apoptoza je provedeno na MGC-803 i HGC-27 stanične linije 72 sata nakon transfekcije pomoću PE Aneksin V Apoptoza Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) i analizirani pomoću fluorescencijom aktiviranog staničnog sortiranja (FACS) , Analiza staničnog ciklusa izvedena je na MGC-803 i HGC-27 stanične linije 48 sati nakon transfekcije s miR-219-2-3p imitatima i jagma respektivno. Stanice su sakupljene, isprane dva puta s hladnim PBS, fiksirane u ledeno-hladnim 70% etanolom, te inkubirane s propidij jodida (PI) i RNA-ze A, zatim analizirane pomoću FACS. Svaki uzorak je tri puta.

migracija stanica i pokusima invazije pregled

MGC-803 i HGC-27 stanice su rasle do sjedinjenja na 12-te plastične posude i tretira sa otimati ili Mir-219 -2-3p oponaša. 24 sata nakon transfekcije, ravni struganja rane (u triplikatu) da bi se na Konfluentni pojedinačni slojevi stanica pomoću pipete 200 jal. Za uzimanje stanica iz staničnog ciklusa prije stvaranja rane, stanice su održavane u mediju bez seruma. Kako vizualizirati migrirale stanica i zarastanje rana, slike su snimljene na 0, 12, 24, 36, 48, 60 i 72 sata sata. Ukupno je deset područja nasumično su odabrane iz svake jažice, a stanice u tri komore iz svake grupe su kvantificirani. Za pokusima invazije, nakon 24 sata transfekcije, 1 × 10 ^{5 stanice u mediju bez seruma su posađene na Transwell migracijske komore (8 um veličinom pora, Millipore, Švicarska), koji su obloženi sa Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) na gornjoj komori. Medij koji sadrži 20% FBS-a bio je dodan u donju komoru. Nakon 24 sata, bez invaziju stanice su uklonjene vatom, invazivnim stanicama koje se nalaze na donjoj površini komore su označene s May-Grunwald-Giemsa bojom (Sigma Diagnostics; St. Louis, Missouri, USA), a radioaktivnost pomoću mikroskopa (Olympus, Tokyo, Japan). Eksperimenti su neovisno ponovljen tri puta. Pregled}

izolacije proteina i western bloting pregled

indicirano vrijeme, MGC-803 stanicama i HGC-27 stanice su sakupljene u ledeno hladnom PBS-u, te lizira u ledu hladno priprema modificiranih radioimmunoprecipitation puferu obogaćenom s inhibitorima proteaze. Koncentracija proteina je određena pomoću BCA protein assay kit (Bio-Rad, Milano, Italija) i jednake količine proteina analizirani su pomoću SDS-PAGE (10% akrilamid). Gelovi su elektroblotiran na nitrocelulozne membrane (Millipore, Bedford, MA, USA). Za imunoblot eksperimente, membrane su blokirana 2 sata sa 5% bezmasnim sušenim mlijekom u Tris-puferiranoj slanoj otopini koja sadrži 0.1% Tween-20, te se inkubira na 4 ° C preko noći sa primarnim antitijelima. Detekcija je provedena peroksidaze-konjugirani sekundarnih antitijela pomoću poboljšane sustav hemiluminiscenciju. Primarni protutijela su: GAPDH od Zhong Shan-Jinqiao (Peking, Kina); ERK1 /2 (kunić anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) i fosfo-ERK1 /2 (kunić anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) pregled

Histologija pregled

Tkiva su fiksirani preko noći u puferiranom formalinu, uklopljeno u parafin, smanjiti na debljine 3 um, i obojene hematoksilin-eozinom (H &E). bojenje pregled

Bioinformatics i statističke analize podataka pregled <

• PLoS ONE: Visoka Ekspresija proteina toplinskog šoka 90 je povezana s tumora agresivnosti i lošom prognozom u bolesnika s uznapredovalim rakom želuca
• PLoS ONE: neinvazivna Vizualizacija mikrornk-16 u kemijska otpornost rak želuca Koristeći sustav Dual Reporter Gene Imaging