PLoS ONE: microRNA-219-2-3p Funguje ako nádorový supresor v rakoviny žalúdka a je riadená metylácie DNA

abstraktné

Pozadie & Si kladie za cieľ

Karcinóm žalúdka je najčastejšia gastrointestinálne nádor u dospelých a je najviac smrteľná forma rakoviny u ľudí. Aj napriek zlepšeniu v liečbe, základný mechanizmus žalúdočnej karcinogenézy nie je dobre známa. Ak chcete definovať nové modulátory, ktoré regulujú náchylnosť k tumorgenesis, sme sa zamerali na Mir-219-2-3p.

Metódy

Kvantitatívny RT-PCR bol zamestnaný vyšetrovať hladinu Mir-219-2 -3p u karcinómu žalúdka (GC) tkaniva (n = 113) a ich uzavreté priľahlé normálneho tkaniva (n = 113). V vitro proliferáciu buniek, apoptózu testy, bunkovej migrácie a invázie testy boli vykonané za účelom určenia biologické účinky MIR-219-2-3p. Vzhľadom k tomu, tlmenie hluku z miRNA od promotora CPG ostrova metylácie môže byť dôležitým mechanizmom v tumorgenesis, GC bunky boli ošetrené s 5-aza-2'-deoxycytidínu a trichostatin A a expresie zmeny Mir-219-2-3p boli následne skúmané kvantitatívne RT-PCR. Napokon, stav metylácie CPG ostrova pred MIR-219-2-3p bola analyzovaná pomocou metylácie špecifickej PCR v GC tkanivách (n = 22).

Výsledky

MIR-219- 2-3p bol down-regulované v GC a bunkových línií. Okrem toho experimenty dokumentované nižšiu expresiu Mir-219-2-3p v GC vzoriek s vyššej triedy a neskoršej fáze nádorov. Medzitým, mier-219-2-3p vyvíjaný antiproliferatívny, proapoptotických a antimetastázové role a zníženej hladiny p-ERK1 /2 v GC buniek. Okrem toho, 5-aza-2'-deoxycytidínu a trichostatin vzrástol v expresii (~ 2 násobné) MIR-219-2-3p v GC buniek. PCR metylácie špecifické metylácie DNA v oblasti proti smeru MIR-219-2-3p bol zistený ako v priľahlej normálne tkanivá a rakovinové tkanive. Ako sa dalo očakávať, úroveň metylácie bola značne vyššia v Mir-219-2-3p down-regulované skupinu ako up-regulované skupiny.

Závery

MIR-219-2-3p je potenciálne zapojené do progresie rakoviny žalúdka a metastázy regulovaním ERK1 /2-súvisiace signálnych dráh, ktoré môžu poskytnúť novú liečebnú stratégiu pre liečbu karcinómu žalúdka. Metylácia mechanizmus môže byť zapojený do modulácie hladiny expresie Mir-219-2-3p v karcinómu žalúdka

Citácia :. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, L Dong, Wang B, et al , (2013) microRNA-219-2-3p Funguje ako nádorový supresor v rakoviny žalúdka a je riadená DNA metylácie. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, United States of America

prijatá: 14. decembra 2012; Prijaté: 26. februára 2013; Uverejnené: 23.apríla 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotácií z Národného Natural Science Foundation Číny [2012, 91129716, aby JY] a Pekingu Mestské Science & Technológia Komisia [2010B071, aby JY]. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je 4 ^{th najčastejšou rakovinou a druhý najvyšší príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete. V súčasnej dobe pacienti s neskorej fáze GC sú s celkovým 5-ročné prežitie približne 20% [1]. Rakovina sa vyvíja v dôsledku nahromadenia rôznych endogénnych a exogénnych príčin. Stravovacích návykov a zvýšenie Helicobacter pyloriinfection sú dôležité exogénne príčiny GC [2], pričom sa nachádzajú genetické, rovnako ako diétne, hladiny hormónu gastrínu [3], a inými chronickými žalúdočnými faktory, zápal spôsobujúcich, že sú spojené s predispozíciou k rozvoju rakoviny. Génové zmeny hrajú dôležitú úlohu v GC, a zmeny vo veľkom množstve onkogénov a tumor supresorových génov už boli uvedené v GC.}

Niektoré prognostické nádorových biomarkerov v GC, ako je ľudský receptor epidermálneho rastového faktora 2 (HER2 ), vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), epidermálny rastový faktor (EGFR), ktoré boli spojené s charakteristikou ochorenia a môžu byť preto použité na informovanie liečbu pacienta. Napríklad pacienti s nádormi, ktoré pozitívny test na HER2 môže byť liečená trastuzumabom s chemoterapiou [4], a u pacientov s nádormi, ktoré s pozitívnym testom na VEGF, môžu byť liečené s bevacizumabom s chemoterapiou [5]. Avšak molekulárne mechanizmy sú základom pre vývoj GC zostáva výzvou, čo je naliehavo potrebné dodatočne informatívny biomarkery.

mikroRNA (miRNA) sú triedou malých molekúl RNA podieľajúcich sa na regulácii translácie a degradácie mRNA [6 ]. Mierny viazať na komplementárne sekvencie na 3 'netranslatované oblasti (UTR) svojich cieľových mRNA a indukujú degradáciu mRNA alebo translačný represie [7]. Najznámejšie funkcie miRNA sú vztiahnuté k negatívnej regulácii génovej: miRNA ticho expresie génu, zvyčajne narúša stabilitu mRNA alebo translácie proteínu. V posledných rokoch, miRNA sa predpokladá, že pôsobí ako onkogén alebo tumor supresorového génu, a prispievajú k iniciácii a postupu rakoviny pomocou regulácie génovej expresie [8]. Objav rakoviny špecifických pre upstream oblasť hypermetylace mnohých miRNA preukázal epigenetické mechanizmus pre aberantne expresiou miRNA [9], [10].

u človeka a myši, sú tam dva genómovej loci (MIR-219- 1 a Mir-219-2), ktoré kódujú MIR-219 prekurzorov prepisy. Mier-219-1 je lokalizovaný na chromozóme 6 (MI0000296) a Mir-219-2 je umiestnený na chromozóme 9 (MI0000740) [11] (obr. 1a). Spracovanie prekurzorov prepisov podľa Dicer generuje tri zrelé miRNA: Mir-219-5p z 5 'koncoch oboch prekurzorov, a Mir-219-1-3p a Mir-219-2-3p od 3' konca pro Mir-219-1 a pre-MIR-219-2, v danom poradí. Vzhľadom k tomu, oblasť osiva týchto troch zrelých produktov je unikátny, každý miRNA sa predpokladá, že reguluje jedinečné ciele. Aj keď Mir-219-5p je známe, že je down-regulovaná u roztrúsenej rakoviny, ako je malígny astrocytóm [12] a hepatocelulárneho karcinómu [13], je expresia Mir-219-1-3p a mier-219-2-3p nemá skúmaný. Je zaujímavé, že mier-199b a mier-219-2-3p gény sú umiestnené v blízkosti segmente chromozómu 9q34.11 (obr. 1A). Predchádzajúce štúdie ukázali, že mier-199b-5p sa down-regulované v meduloblastómu metylácie CPG ostrova 3 kb proti smeru od 5'-miesto MIR-199b-5p promótor [14]. Vzhľadom k tomu, metylácie DNA môže mať vplyv na veľké oblasti chromatínu a regulujú transkripciu génov vzdialených, je potrebné zistiť, či MIR-219-2-3p je down-regulovaná a upravená metylácie ako MIR-199b-5p rakoviny. V tejto štúdii sme zistili, že mier-219-2-3p bola down-regulované v GC tkanivách a je spájaná s progresívnymi fenotypov GC. Okrem toho, znovuzavedenie MIR-219-2-3p znižuje životaschopnosť buniek a GC indukovanú apoptózu buniek, čo naznačuje, že mier-219-2-3p bol kandidát nádorový supresor v GC. Ďalšia analýza metylácie MIR-219-2-3p promótorom, je uvedené, že jeho expresia bola regulovaná metylácie CPG ostrovov korelovaných do určitej miery. Nakoniec sme zistili, že mier-219-2-3p správal ako nádorový supresor inhibíciou aktivity ERK1 /2 signálne dráhy v GC buniek.

Výsledky

MIR-219-2- 3p sa rozdielne exprimované v GC a GC bunkové línie

Pre hodnotenie expresie Mir-219-2-3p v GC, TaqMan RT-PCR analýza bola vykonaná v 113 párov GC tkanív a uzavreté susedných vzoriek normálneho tkaniva , V porovnaní s normálnymi vzorkami tkanív, viac ako polovica z primárnych nádorov vystavených nízkej hladiny MIR-219-2-3p (58%, 65 113, obr. 1B). Okrem toho, štyria pacienti, ktorých expresie MIR-219-2-3p boli značné down-regulované boli vybrané (obr. 1D). MIR-219-2-3p expresie u tých pacientov, a štyri GC bunkových líniách (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) bola analyzovaná, aby sa ukázať, že mier-219-2-3p sa tiež prestoje upravená v GC buniek (obr. 1E). Tieto výsledky naznačujú, že down-regulované MIR-219-2-3p bol častý udalosť v ľudskom GC a môžu byť zapojené do žalúdočnej karcinogenéze. S ohľadom na univerzálny down-reguláciu MIR-219-2-3p v testovaných bunkových líniách GC, MGC-803 a HGC-27 boli náhodne vybrané pre ďalšiu štúdiu.

Vzťah medzi klinicko-faktormi a mier-219- 2-3p výraz v GC

Táto štúdia zahŕňala 113 pacientov GC. Vyhodnotiť súvislosť medzi MIR-219-2-3p prejavu a klinicko-vlastnostiam Pacienti boli rozdelení do skupín s down-reguláciu a up-regulácia. Ako je uvedené v tabuľke 1 a fig.1C, štatisticky významná súvislosť bola pozorovaná medzi expresiou Mir-219-2-3p a GC klinického štádia. Pacienti s nižšou úrovňou expresie MIR-219-2-3p zdalo sa, že sú spojené s vysoko kvalitných a na poslednú chvíľu nádorov (p = 0,047, nezávislé vzorky-t test). Tieto údaje naznačujú, že zmeny Mir-219-2-3p by mohli byť zapojené do progresie GC.

Zvýšená expresia Mir-219-2-3p v GC buniek inhibuje proliferáciu buniek a prežívanie buniek

pozoruhodný zníženie MIR-219-2-3p prejavu vo vzorkách GC nás povýšená na skúmanie možného biologického významu Mir-219-2-3p v tumorgenesis. Vzhľadom na to, že mier-219-2-3p hrá úlohu v regulácii bunkovej proliferácie [15], MGC-803 a HGC-27 bunky boli prenesené s Mir-219-2-3p a vyškriabať napodobňuje a analyzované na rast buniek, buniek apoptóza a progresiu bunkového cyklu, resp. Po prvé, RT-PCR bola použitá pre meranie hladiny MIR-219-2-3p po nadmernú expresiu experimentov. Zistili sme, že mier-219-2-3p zvýšil o viac ako 100 skladov v miRNA transfekovány MGC-803 a HGC-27 bunky (obr.2a). Okrem toho, test proliferácie CCK-8 ukazuje, že rýchlosť rastu buniek bola znížená v Mir-219-2-3p napodobňuje transfekciou MGC-803 a bunky HGC-27 v porovnaní s zakódovanie-transfekované bunky alebo neošetrených buniek (obr. 2B). Po transfekciu, pomer inhibícia 26% (48 h) a 28% (96 h) v bunkách MGC-803 a 13% (72 h) a 14% (96 h) v bunkách HGC-27. Tieto výsledky naznačujú, že mier-219-2-3p skutočne podieľa na negatívnej regulácii bunkového rastu. Avšak, neexistuje žiadny významný vplyv na zastavenie bunkového cyklu v Mir-219-2-3p ošetrených GC buniek (Obr. S1). Ak chcete na otázku, či up-regulácia MIR-219-2-3p by malo viesť k GC apoptózu a bunkovú smrť, počet osôb v predčasnom apoptotické MGC-803 a bunky HGC-27 po liečbe s Mir-219-2-3p napodobňuje bola skúmaná. Ako sa dalo očakávať, niekoľko zavčas apoptotických buniek (10% v MGC-803, alebo 2,9% do HGC-27) boli zistené v bunkách ošetrených zakódovanie, zatiaľ čo ošetrenie MIR-219-2-3p simuluje zvýšilo percento skorých apoptotických buniek (17,5 % v MGC-803 alebo 8.3 v HGC-27), ako sa posúdi annexinu farbením (obr. 2C). Preto sme dospeli k záveru, že mier-219-2-3p by mohli ovplyvniť prežívanie buniek v GC buniek.

Zvýšená expresia Mir-219-2-3p v GC buniek inhibuje migráciu buniek a invázie

ďalej zistiť, či MIR-219-2-3p je spojená s progresiou GC, hojenie rán a transwell testu boli vykonané pre analýzu účinku MIR-219-2-3p expresie na migračné a invazívnym správaním MGC-803 a HGC- 27 buniek. Zistili sme, že zavedenie Mir-219-2-3p do MGC-803 a HGC-27 bunky viedlo k významnému zníženiu migrácie buniek počas záverečného umelého rany vytvorené cez splývajúce monovrstvu (obr. 3A). Tieto bunky boli udržiavané v médiu bez séra v priebehu hojenia rán, aby zabezpečili, že akékoľvek rozšírené migračné správanie nemôže byť ovplyvnená zmenenou bunkovou proliferáciou. Okrem toho, obnova MIR-219-2-3p dramaticky inhibuje normálne silnú invazívnej schopnosť MGC-803 a bunky HGC-27, ktorý niesol nízky endogénnej hladinu MIR-219-2-3p (obr. 3B). Tieto výsledky ukazujú, že mier-219-2-3p nadmerná expresia prispieva k regulácii GC bunkovej pohyblivosti a progresie in vitro.

MIR-219-2-3p výraz je epigenetické regulovaným

na základe uvedené zistenia sme došli k záveru, že mier-219-2-3p bol dôležitým regulátorom v GC. Avšak regulačné mechanizmy MIR-219-2-3p expresie boli doteraz neznáme. Vzhľadom k tomu, mnoho miRNA boli identifikované ako ciele regulácie metylácie, ako je MIR-9, MIR-34b /c a mier-148a v metastatických karcinómoch [16], a mier-137 a mier-193a v rakovine perorálna [17], spätných 193b a mier-145 pri karcinóme prostaty [18], [19], rozhodli sme sa analyzovať regulačný mechanizmus MIR-219-2-3p výrazu od jeho genómovej metylácie. Po analýze genómovej preklenutie oblasti génu MIR-219-2-3p sme identifikovali veľké CPG ostrova (obr. 4A). Pre zistenie, či je MIR-219-2-3p sa epigenetické upravená v GC, MGC-803, HGC-27 bunky boli ošetrené inhibítorom demethyltransferase, 5-aza-2'-deoxycytidínu (5-Aza-CdR) a Histon-deacetylázy inhibítor trichostatin A (TSA). Potom expresie MIR-219-2-3p pomocou RT-PCR bol analyzovaný (obr. 4B). Výsledky ukázali, že expresia MIR-219-2-3p bola up-regulovaná v dvoch prípadoch: pri liečení 5-Aza-CdR, expresie MIR-219-2-3p bola up-regulovaná v MGC-803 ( 5-Aza-CdR 1,5 pmol /l, 2,14-krát) a HGC-27 (5-Aza-CdR 0,5 umol /l, 3,07-krát) v porovnaní s DMSO ošetrené kontrolná skupina; pre kombinované liečby 5-Aza-CdR a TSA, expresie MIR-219-2-3p bola oveľa vyššia v MGC-803 (5-Aza-CdR 1,5 pmol /l; 1,98-krát) a HGC-27 (5 aza-CdR 1,5 pmol /l, 1,28-krát) v porovnaní s kontrolnou skupinou TSA. Tieto výsledky ukazujú, že epigenetické faktory by mohli mať vplyv na Mir-219-2-3p expresie v GC. Synergia demetylácia a histondeacetylasy inhibícia viedla k opätovnému expresie Mir-219-2-3p v GC. Pre ďalšie zistenie, či MIR-219-2-3p bola spojená s metyláciou GC, sme skúmali metylačného statusu v Mir-219-2-3p hornej oblasti pomocou metylácie špecifickou PCR (MSP, obr. 4C). 22 párov tkanív (primárnych nádorov a ich uzavreté priľahlých normálnych tkanivách) v 113 pároch boli vybraní, vrátane 11 pacientov, ktorí vlastnili nižší Mir-219-2-3p hladiny (down-regulácia skupina) a 11 pacientov, ktorí vlastnili vyššia MIR-219 -2-3p hladiny (up-regulácia skupina). Zistili sme, že metylácie DNA v predchádzajúcom regiónoch Mir-219-2-3p existoval v oboch susedných normálnych tkanivách a rakovinové tkanivá. Však pomer hypermetylace z oblasti proti smeru MIR-219-2-3p génu v skupine down-regulácia bola 63,6% (7 11), ktorá bola vyššia ako skupina, up-regulácia (36,3%, 4 11 ). Tieto výsledky naznačujú, že úroveň metylácie CPG upstream oblasti MIR-219-2-3p bola vyššia v Mir-219-2-3p down-regulované skupinu ako v up-regulovaný jeden.

Nadmerná expresia MIR-219-2-3p tlmí ERK1 /2 signálny dráhu

aktivácia ERK1 /2 dráhy dobre zdokumentovaná v rôznych typov nádorov, ako je GC [20], rakoviny pankreasu [21] a rakoviny prsníka [ ,,,0],22]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že je dôležité, ERK1 /2 signálne dráhy v regulácii migrácie, invázie a metastázovaniu nádorových bunkových línií [23]. Ak chcete zistiť, či je MIR-219-2-3p ovplyvňuje bunkové aktivity prostredníctvom ERK1 /2 dráhy, úroveň fosforylácie ERK1 /2 v MGC-803 a bunky HGC-27 bola skúmaná po MIR-219-2-3p nadmernej expresie. Bunkové hladiny p-ERK1 /2 v MIR-219-2-3p napodobňuje-transfekované bunky výrazne znížila v porovnaní s zakódovanie-transfekovány alebo neošetrených buniek. Avšak, žiadny zrejmý rozdiel bol zaznamenaný v celkovej ERK1 /2 úrovní (viď obr. 5A). Tieto nálezy naznačujú, že zrýchlený rast GC bunka môže byť čiastočne spôsobené použitím ERK1 /2 dráh.

Bioinformatics prístup k hľadaniu potenciálnych cieľov MIR-219-2-3p

miRNA modulovať gén expresia interakcií s cieľovými mRNA vedie k degradácii mRNA, alebo transláciu. Ďalej skúmať mechanizmus Mir-219-2-3p v GC, my bioinformatically (TargetScan Release 5.2 a miRDB) a funkčne zapletený Mir-219-2-3p v GC, a zistil, že gény cielené podľa Mir-219-2- 3p (tabuľka S2). Medzi 371 predpokladaných cieľov MIR-219-2-3p, 31 z nich je znázornené veľký potenciál, pretože bolo predpovedané obidva programy, zatiaľ čo iné sa predpokladá iba jeden z programov. Z týchto 31 génov, ERBB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 bolo zistené, že SOX4 byť onkogén alebo apoptózy súvisiace s génmi podľa predošlých publikovaných článkov. (Viď obr. 5B a 5C).

Diskusia

V posledných rokoch sa hromadia dôkazy, viedol onkológovia špekulovať, že nezostanú molekulárnych faktorov, najmä nekódujúca RNA predtým klasifikované ako "smeti," hra dôležitú úlohu v tvorbe nádorov a progresie nádoru. V závislosti na svoje ciele mRNA, miRNA môže fungovať ako nádorové supresormi alebo usporiadateľov onkogenézy. Avšak, mechanizmy, ktoré dysregulovaný miRNA neboli široko študovaný, vrátane aberantne miRNA biogeneze a transkripcie [24], [25], epigenetické zmeny [26], [27], a zosilnenie alebo stratu oblastiach genómu, ktoré kódujú miRNA [28] .

Ako je uvedené v tejto správe, sme analyzovali expresiu MIR-219-2-3p u 113 pacientov GC a zistilo sa, že hladiny sa zdajú byť nižšia v GC. Hoci MIR-219-2-3p bolo hlásené, že je úzko spätý diabetickej retinopatie [29], oligodendrocyty [15], Alzheimerova choroba [30] a glioblastómu [12], jeho funkcie v GC Zostáva určiť. Ďalej sa ukázalo, že re-expresie MIR-219-2-3p v GC buniek viedla k indukcii bunkovej apoptózy a zníženie životaschopnosti buniek. Tieto výsledky nám umožnilo špekulovať, že down-regulácia MIR-219-2-3p mohla poskytnúť výhodu pre prežitie na GC buniek. Avšak, mechanizmus zodpovedný za mier-219-2-3p down-regulácia v GC je stále neznámy. Pretože strata na 9q34.11, kde sa nachádza MIR-219-2-3p, je zriedka zistená v GC [31], je nepravdepodobné, že alelické straty je zodpovedný za jeho down-reguláciu. Na druhej strane sme zistili, že mier-219-2-3p bol výrazne up-regulovaná, keď GC buniek, MGC-803 a HGC-27, boli liečené ako 5-Aza-CdR a TSA. Okrem toho, výpočtová analýza ukazuje, že mier-219-2-3p sa nachádza v CPG ostrova na chromozóme 9q34.11. Preto sa zdá pravdepodobné, že metylácie DNA a histónov deacetyláciou môže byť spojená s Mir-219-2-3p regulácia. Od MSP, vzorky metylácie frekvencie určené v oblasti proti smeru MIR-219-2-3p bol v Mir-219-2-3p down-regulované skupiny vyššia ako v up-regulované skupiny. Táto špecifickosť zariadený hypotézu o vzťahu medzi MIR-219-2-3p expresie a metylácie DNA. Celkovo možno povedať, že výsledky naznačujú, že metylácie bol dôležitým mechanizmom pre mier-219-2-3p down-reguláciu v GC.

Vykonali sme predikciu programy TargetScan a miRDB a zistil, že 6 gény mohli byť potenciálnymi cieľmi Mir -219-2-3p. Medzi kandidátskymi cieľov MIR-219-2-3p, tyrozín kinázy receptora ERBB3 (epidermálny rastový faktor rodina receptor) obrátil našu pozornosť. Vysoké hladiny ERBB3 je pevne spojená s progresiou nádoru a zlou prognózou u pacientov s GC [32] - [34] a inhibítory EGFR kinázy gefitinib môže zabrániť EGFR a erbB2, erbB3 aktiváciu. Medzitým ERBB3 výraz takisto slúži ako účinný prediktor citlivosti na gefitinibu [35]. Je známe, že potláčaný ERBB3 transkripcie inhibuje signálnych kaskád z ERK1 /2 dráhy [36]. Avšak, predpokladané cieľové gény, je potrebné ďalej experimentálne overená. Okrem toho sa môžu miRNA funguje v súlade so kombinačné obvody modelu, v ktorých jeden miRNA môže zacieliť na viac mRNA, a niekoľko koexprimován miRNA môže zameriavať na jednu mRNA. Nedávne štúdie naznačujú, že biologická pojem "jedného cieľa hit-násobkom" by mohli byť použité pri klinických liečiv [37]. Je pravdepodobné, že konkrétne miRNA môže fungovať prostredníctvom spolupráce down-reguláciu viac cieľov a miRNA funkciu tiež potlačením transláciu ich cieľových génov. Preskúmať plného dopadu Mirna, genómu-široký proteomických štúdií by mali byť vykonané.

Na záver, naše expresie a funkčné štúdie naznačujú, že mier-219-2-3p bola rozlične vyjadrená metylácie mechanizmom a mal nádorové potlačenie funkcie reguláciou ERK1 /2-súvisiace signálnych dráh v GC. Medzitým nižšia expresie Mir-219-2-3p v GC vzoriek korelovala s vyšším stupňom a neskoršom štádiu. Opätovné zavedenie expresie Mir-219-2-3p na GC buniek potlačených bunkovej proliferácie, migrácie, invázie a indukovaná apoptóza je uvedené, že miRNA na báze theraputic vzor by mohlo slúžiť ako základ pre vývoj nových potenciálnych terapií rakoviny žalúdka.

materiály a metódy

vzorky tkaniva

nádorov žalúdka a ich morfologicky normálneho tkaniva (umiestnený > 3 cm od nádoru) bola získaná od novembra 2009 do novembra 2011 z 113 pacientov podstupujúcich GC chirurgie v nemocnici rakoviny čínskej akadémie lekárskych vied (CICAMS, n = 21), čínsky PLA General Hospital (301 nemocnice, n = 31), a prvé Affiliated nemocnice Shanxi Medical University (n = 61). Využitie tkanivových vzoriek pre všetky experimenty bola schválená etickou rady Ústavu základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied. Všetci účastníci predpokladu, že ich slovná informovaný súhlas k účasti na tejto štúdii a ich verbálny informovaný súhlas boli napísané dole. Tento súhlas proces bol tiež schválený etickou doske. Vzorky tkaniva boli narezané do dvoch častí, jedna bola stanovená 10% formalínu na histopatologické diagnostiky, a druhý bol okamžite snap-zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované pri teplote -196 ° C v tekutom dusíku až do extrakcie RNA. Táto skupina sa skladala z 95 mužov, 17 žien a jedna bez informácií o rovnosti žien a mužov s priemerným vekom 58 rokov (rozmedzie 31-82 rokov) .Formalin fixované parafínu zaliate tkanivové bloky GC bola zhromaždená z nemocnice rakoviny Čínskej akadémie Zdravotné vedy (CICAMS, n = 4) v rokoch 2009 a 2011. Vzhľadom k individuálnym rozdielom medzi pacientmi, nám chýbalo informácie o niektorých patologickým dát. Využitie tkanivových vzoriek pre všetky experimenty bola schválená všetkými pacientmi a etickou komisiou danej inštitúcie. Charakteristiky pacientov sú uvedené v tabuľke 1.

bunkové kultúry a transfekcia

celkom 4 ľudských bunkových línií GC MGC-803 (mucinózní rakovina žalúdka, zle diferencované), HGC-27 ( metastázujúce lymfatické uzliny, nediferencovaný karcinóm), MKCH-45 (Signet ring karcinóm zle diferencované), SGC-7901 (adenokarcinóm, mierne diferencované) boli skúmané v tejto štúdii. MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 bunkové línie bola získaná od Cell Resource Center of Institute of základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied a Peking Union Medical College (Peking, Čína). MGC-803 bol propagovaný v Dulbeccova modifikovanom Eagle médiu (Gibco Invitrogen; Life Technologies, Nemecko), doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS, PAA, Pasching, Rakúsko) a streptomycínom (100 ug /ml), penicilínu (100 U /ml). HGC-27, MKN-45, SGC-7901 udržiavali v médiu RPMI 1640 (PAA), doplnenom 10% FBS (PAA). V GC ľudskej bunkovej línie MGC-803, HGC-27 boli transfekovány MIR-219-2-3p napodobňuje a negatívne kontrolné miRNA napodobňuje (GenePharma, Shanghai, Čína, tabuľka S1) na konečnú koncentráciu 10 nmol /L s použitím Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA) v súlade s pokynmi výrobcu

TaqMan RT-PCR pre expresiu miRNA

Celková RNA bola extrahovaná z buniek a tkanív s TRIzolu činidla (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). Mierny boli kvantifikované pomocou real-time PCR s použitím TaqMan mikroRNA testu (Invitrogen, USA). Prvé vlákno komplementárna DNA (cDNA) Syntéza bola vykonaná z 1 ug celkovej RNA v 12 ul konečného objemu obsahujúcom 2 M primeru kmeňových slučky, 10 mM zmes dNTP (Invitrogen, USA). Táto zmes sa doska pri 65 ° C po dobu 5 minút, a potom sa zmieša s 5 x RT pufru, 0,1 M DTT, 200 U /ul MultiScribe reverznej transkriptázy a 40 U /ul inhibítora RNase (Invitrogen, USA). Táto zmes sa doska pri teplote 37 ° C počas 55 minút, 70 ° C počas 15 minút a potom sa udržiava na teplote -20 ° C. Real-time PCR bola vykonaná za použitia štandardného TaqMan PCR protokolu. K 20 ul PCR reakcie v cene 1 ul produktu RT, 1 × univerzálna TaqMan Master Mix a 1 × TaqMan sonda /primer mix (Invitrogen, USA, tabuľka S1). Všetky RT reakcie vrátane žiadnych-šablón kontroly boli vykonané v troch opakovaniach. Všetky mRNA kvantifikácia dáta bola normalizovaná na U6. Relatívne množstvo transkriptov bola vypočítaná za použitia porovnávacej metódy Ct.

5-Aza-CdR a Trichostatin Ošetrenie bunkových línií

GC bunkové línie MGC-803 boli liečení 5-aza- 2'-deoxycytidínu (5-Aza-CdR, Sigma-Aldrich, USA) v 0,7 umol /l, 1,5 umol /l, 3 umol /l a HGC-27 boli liečení 5-Aza-CdR pri 0,5 pmol /l, 1 pmol /l, 1,5 pmol /l počas 3 dní, alebo 300 nmol /L Trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) po dobu 24 hodín. Pre kombinovanej liečby, bunky boli ošetrené s 5-Aza-CdR po dobu 48 hodín za prvé. Potom bol pridaný TSA (300 nmol /l), a bunky boli ošetrené po dobu ďalších 24 hodín. Kultivačné médium obsahujúce liečivo sa nahradí každých 24 hodín. RNA z bunkových línií bola čistená pomocou TRIzolu činidla podľa pokynov od výrobcu. Syntéza cDNA bola vykonávaná ako je popísané vyššie, a 1 ml zriedeného cDNA pre každú vzorku bola amplifikovaná pomocou RT-PCR s použitím protokolu bolo popísané vyššie.

Izolácia DNA a hydrogensiričitan modifikácie

genómovej DNA bol získaný od -196 ° C v tekutom dusíku primárnych nádorov a ich uzavreté priľahlé normálneho tkaniva (n = 22, celkom 11 pacientov, čo expresie MIR-219-2-3p boli down-regulované a iní boli up-regulované) a použité Biomed DNA Kit (Biomed, Peking, Čína) podľa pokynov výrobcu. Hydrogensiričitan spracovanie a využitie vzoriek boli vykonávané s Epitect hydrogensiričitanovú kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). Genómovej DNA (2 ug) v 20 ul vody bolo použité pre každú reakciu a zmieša sa s 85 ul roztoku sodia zmesi a 35 ul DNA chránený vyrovnávacej pamäte. Hydrogensiričitanovú konverzia bola vykonaná na termocykléri nasledujúcim spôsobom: 99 ° C po dobu 5 minút, 60 ° C počas 25 minút, 99 ° C počas 5 min, 60 ° C počas 85 minút, 99 ° C počas 5 min, 60 ° C počas 175 min a 20 ° C po neobmedzenú dobu. Bisulfitová ošetrené DNA sa izoluje podľa stĺpca Epitect spin a následne sekvenované pre potvrdenie účinnosti konverzie hydrogensiričitanovú.

Metylácia analýza

MSP bol použitý pre analýzu metylácie MIR-219-2-3p v oblasti proti smeru v bunkových líniách a tkanivách. Methprimer bol použitý pre návrh MSP priméru (tabuľka S1). MSP reakcia na nové primery boli optimalizované pomocou metylovaných pozitívne kontroly (M-DNA), ktorý za použitia normálnej ľudskej DNA periférnych lymfocytoch ošetrené in vitro s SSS I metyltransferáza (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA z dvoch normálnych ľudských periférnych lymfocytov bol použitý ako normálny kontroly. Touchdown PCR sa skladala z dvoch fáz: Fáza 1 zahrnuté počiatočné denaturácia 95 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 45 cyklov denaturácie pri 95 ° C počas 30 s, žíhanie pri rôznych teplotách po dobu 30 sekúnd a predĺženie pri 72 ° C počas 40 s. V prvom cykle, žíhacie teplota bola nastavená na 58 ° C, a v každom z 10 nasledujúcich cyklov, teplota žíhanie bola znížená o 0,6 ° C. Fáza 2 sa skladala z 35 cyklov 95 ° C počas 30 s, 52 ° C počas 30 s a 72 ° C počas 40 s. Produkty MSP boli analyzované na 3% polyakrylamidových géloch

Bunková proliferácia, apoptózy a bunkového cyklu testu

Bunky boli inkubované v 10% CCK-8. (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) zriedený v normálnom kultivačné médium pri teplote 37 ° C, kým konverzia vizuálny farebný došlo. Proliferačnej rýchlosti boli stanovené pri 0 ° C, 24, 48, 72, 96 hodín po transfekciu. Absorbancia každej jamky bola meraná pomocou ELISA readeru nastaveným na 450 nm a 630 nm. Všetky experimenty boli vykonané v štyroch. Test apoptózy bol vykonaný na MGC-803 a HGC-27 bunkových línií 72 hodín po transfekciu za použitia súpravy Aj PE annexin V Apoptosis Detection (BD Pharmingen; San Diego, CA, USA) a analyzované pomocou fluorescenčne aktivovanej triedenia buniek (FACS) , Analýza bunkového cyklu bola vykonaná na MGC-803 a HGC-27 bunkových línií 48 hodín po transfekciu s Mir-219-2-3p napodobňuje a súperenie, resp. Bunky boli zozbierané, premyté dvakrát studeným PBS, fixované v ľadovo chladného 70% etanolu, a inkubujú sa s propidiumjodidom (PI) a RNázou A, a potom analyzované pomocou FACS. Každá vzorka bol spustený v trojitom prevedení.

migrácie a invázie testoch bunkovej

MGC-803 a HGC-27 bunky boli pestované do zhlukovania na 12-jamkové plastové riady a spracuje sa odrazil či MIR-219 -2-3p napodobňuje. 24 hodín po transfekciu, lineárne stieracie rany (tri kópie) boli vytvorené na základe splývajúce bunkovej monovrstvy za použitia 200 ul pipety. Pre odstránenie buniek z bunkového cyklu pred poranenia, bunky boli udržiavané v médiu bez séra. Pre vizualizáciu migrovaných buniek a hojenie rán, Snímky boli nadobudnuté pri 0, 12, 24, 36, 48, 60 a 72 hodín hodín. Celkom desiatich oblastí boli vybrané náhodne z každej jamky a bunky v troch jamkách každej skupiny boli kvantifikované. Pre inváziu testoch, po 24 hodinách transfekcia, 1 x 10 ^{5 buniek v médiu bez séra boli vrúbľovať na transwell migrácie komôr (8 um veľkosťou pórov; Millipore, Švajčiarsko), ktoré boli potiahnuté Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) na hornej komory. Médiá s obsahom 20% FBS bolo pridané do dolnej komory. Po 24 hodinách, non-invazívne bunky boli odstránené vatou, invazívnych buniek umiestnených na spodnej ploche komory boli zafarbené s May-Grunwald-farbivom Giemsa (Sigma Diagnostics; St Louis, Missouri, USA) a počítané pomocou mikroskopu (Olympus, Tokyo, Japonsko). Experimenty boli nezávisle opakuje trikrát.}

izolácie proteínov a western blotting

V uvedených časoch, MGC-803 bunky a bunky HGC-27 boli zozbierané v ľadovo studenom PBS a lyžovanie na ľade v za studena príprava modifikovaného rádioaktívne značenú pufra doplneného inhibítory proteázy. Koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou BCA proteín Kit (Bio-Rad, Miláno, Taliansko) a rovnaké množstvo proteínov, boli analyzované pomocou SDS-PAGE (10% akrylamidu). Gély boli elektroblotovány na nitrocelulózové membrány (Millipore, Bedford, MA, USA). Na imunoblotu experimenty boli membrány blokované po dobu 2 hodín s 5% netučného sušeného mlieka v Tris-pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom 0,1% Tween-20 a inkubované pri teplote 4 ° C cez noc s primárnou protilátkou. Detekcia bola vykonávaná pomocou peroxidázou konjugovanej sekundárnej protilátky za použitia rozšíreného systému chemiluminiscencie. Primárne protilátky boli použité: GAPDH od Zhong Shan-Jinqiao (Peking, Čína); ERK1 /2 (králičie anti-ERK1 /2, New England Biolabs, neb) a fosfo-ERK1 /2 (králičie anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolabs, VO)

histológia
<

• Ploche ONE: Vysoká expresia proteínu tepelného šoku 90 je spojená s nádormi agresivitou a zlou prognózou u pacientov s pokročilým žalúdočnej Cancer
• Ploche ONE: Neinvazívne Vizualizácia mikroRNA-16 v chemorezistence na žalúdočné rakovinu použitie duálneho referenčného génu Imaging System