PLoS Genetics: kiembaanmutaties in MAP3K6 worden geassocieerd met Familiaire Gastric Cancer

Abstract

Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Hoewel erfelijke vormen van maagkanker relatief zeldzaam, identificeren van de genen voor dergelijke gevallen diagnose en behandeling informeren zowel erfelijke als sporadische gevallen van maagkanker. Mutaties in het E-cadherine gen, CDH1
, goed voor 40% van de meest voorkomende vorm van erfelijke maagkanker (FGC), erfelijke diffuse maagkanker (HDGC). Gen voor de overige vormen van FGC zijn nog niet bekend. Hier onderzoeken we een grote familie van Maritime Canada met FGC zonder CDH1
mutaties, en identificeerde een kiemlijn coderende variant (p.P946L) in mitogeen-activated protein kinase kinase kinase 6 ( MAP3K6
) . Gebaseerd op behoud voorspelde pathogeniteit en een bekende rol van het gen in kanker predispositie, werd MAP3K6
als een sterke kandidaat en werd verder onderzocht. Screening van een extra 115 niet-verwante personen met niet- CDH1
FGC identificeerde de p.P946L MAP3K6
variant, evenals vier extra codering varianten in MAP3K6
(p. F849Sfs * 142, p.P958T, p.D200Y en p.V207G). Een tweede somatische getroffen variant (p.H506Y) was aanwezig in DNA verkregen uit een van de tumormonsters en bewijs van DNA hypermethylatie in de MAP3K6
gen werd waargenomen in het DNA van de tumor van een getroffen individu. Deze bevindingen, samen met eerdere bewijs uit muismodellen dat MAP3K6
fungeert als een tumor suppressor, en studies tonen de aanwezigheid van somatische mutaties in de MAP3K6
in niet-erfelijke maagkanker en maagkanker cel lijnen, wijzen op MAP3K6
varianten als een predisponerende factor voor de FGC.

Auteur Samenvatting

De onderliggende genetische mutaties die betrokken zijn bij 60% van erfelijke maagkanker gevallen onbekend blijven. Hier presenteren we een grote, uitgebreide stamboom met familiaire maagkanker en een vereniging in een deel van de familie met een mutatie in MAP3K6
. De conservering, voorspelde pathogeniciteit van de variant, distributie weefsel en bekende functie van de MAP3K6
maakten dit een sterke kandidaat die nader onderzoek gerechtvaardigd. Onderzoek van een extra 115 ongerelateerde proefpersonen aangegeven aanvullende mutaties in MAP3K6
, met inbegrip van een afkappen mutatie

Visum:. Gaston D, Hansford S, Oliveira C, Nightingale M, Pinheiro H, Macgillivray C, et al. (2014) kiembaanmutaties in MAP3K6
worden geassocieerd met Familiaire maagkanker. PLoS Genet 10 (10): e1004669. doi: 10.1371 /journal.pgen.1004669

Editor: Marshall S. Horwitz, Universiteit van Washington, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 3 maart 2014; Aanvaard: 14 augustus 2014; Gepubliceerd: 23 oktober 2014

Copyright: © 2014 Gaston et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De volgende agentschappen verstrekte financiering voor dit project: Genome Canada, Genome Atlantic, Nova Scotia Health Research Foundation, Nova Scotia onderzoek en innovatie Trust, Dalhousie Faculteit der Geneeskunde, Dalhousie Afdeling Oogheelkunde, Health Canada, The Centre for Drug Research and Development Capital District Health autoriteit, IWK Health Centre Foundation Capital Health Research Fund en The COMPETE /EFRO Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), Projecten Ref. FCT PTDC /SAU-GMG /110785/2009 en post-doc subsidie ​​SFRH /BPD /79499/2011 HP "financiados geen ambito weet Programa Operacional Temático Factores de Competitividade (COMPETE) e comparticipado pelo fundo Comunitário Europeu EFRO." MES wordt ondersteund door de CHU Sainte-Justine Centre de Recherche. De auteurs willen graag de bijdrage van te erkennen: de Genome Quebec High Throughput Sequencing Platform; en Sónia Sousa en José Carlos Machado uit de IPATIMUP Diagnostics Unit, Porto, Portugal. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd met 738.000 doden per jaar [1]. Primaire behandeling bestaat uit chirurgische verwijdering van de tumor en kan worden gevolgd door chemotherapie en /of radiotherapie. De 5-jaarsoverleving na chirurgische resectie hoog zijn als de ziekte vroeg wordt ontdekt (71% voor fase 1A), maar ze vallen snel af wanneer de diagnose wordt gesteld in een later stadium (46% stadium IIA, 20% stadium IIIA, 4% stadium IV) (National Cancer Institute SEER-database, oktober 2013). Helaas, vanwege vroege symptomen van maagkanker nauw lijken op andere ziekten, detectie vaak pas optreedt vergevorderd stadium is bereikt [2]

Klassiek is maagkanker verdeeld in twee types:. Darm- en diffuus [ ,,,0],3]. De intestinale vorm spontaan optreedt en wordt meestal gevonden bij oudere personen, terwijl de verdunde vorm komt vaak voor bij jongere personen en kan worden geassocieerd met een familiegeschiedenis van maagkanker. Populaties met een hogere prevalentie van chronische Helicobacter pylori
infectie meestal hoger maagkanker lasten hebben [4]. De meerderheid van maagkanker (90%) zijn sporadisch, maar ongeveer 10% vertonen familiaire clustering [5]. Slechts 1% tot 3% wordt veroorzaakt door een erfelijke syndroom, tegenover omgevingsfactoren zoals gedeelde dieetpraktijken [5]. De gevestigde familiale vorm van maagkanker is erfelijke diffuse maagkanker (HDGC [MIM ​​137215]), waarbij ongeveer 40% van de gevallen wordt toegeschreven aan kiemlijn mutaties in het E-cadherine coderende gen, CDH1
[6 ] - [9].

We hebben vastgesteld een grote familie van Maritime Canada met een geschiedenis van Familial maagkanker (FGC) weergeven van een schijnbare autosomaal dominant patroon van overerving, maar dragen geen varianten in het coderende gebied van de CDH1
gen. Terwijl de familie vertoont vele typische kenmerken van HDGC, was er diversiteit in de klinische presentatie binnen de familie, evenals een gevorderde leeftijd bij het begin, dus hebben we gekozen om gewoon te verwijzen naar de toestand als FGC boven de meer nauwkeurig omschreven HDGC. Genomische kaart brengen van erfelijke gemeenschappelijke gebieden tussen aangedane familieleden, gevolgd door geheel-exome sequentiebepaling leidde tot de identificatie van een kiemlijn enkele nucleotide variant (SNV) in mitogeen geactiveerde proteïne kinase kinase kinase 6 ( MAP3K6
, ASK2
, MAPKKK6
, MEKK6
, ENSG00000142733), een gen dat codeert voor een lid van de serine /threonine proteïne kinase familie. Verschillende in silico voorspelde
werkwijzen SNV in MAP3K6 schadelijk zijn voor het eiwit en andere studies met MAP3K6
deficiënte muizen [10], evenals de frequentie van mutaties in dit gen in zowel primaire tumoren en maagkanker maagkanker cellijnen [11], waren consistent met mutaties in de MAP3K6
gen zijn de veroorzakende mutatie. Sequentiebepaling van DNA die rechtstreeks vanaf een vaste tumor specimen van een individu toonde de aanwezigheid van een novo Tweede hit-variant MAP3K6
. Screening van een extra 115 verbonden FGC monsters, ook negatief voor CDH1
mutaties openbaarde vijf personen met vier extra SNVs in MAP3K6
die ook voorspeld pathogeen, en een niet verwante individu met de SNV die in de familie van de Maritime Canada. De beginleeftijd gevarieerd tussen MAP3K6
SNV carriers in de vijf families, en één had niet ontwikkeld kanker, zelfs in de late fase van het leven, wat suggereert incomplete penetratie. Dit is het eerste verslag van een erfelijke kanker als gevolg van SNVs in MAP3K6
.

Resultaten

clinicopathologische Assessment

We hebben geconstateerd een groot maritiem Canadees familie van Europese afkomst in de loop van routine klinische beoordeling in de Erfelijke Cancer Clinic als onderdeel van Maritiem Medische Genetica service bij de IWK Health Centre in Halifax, Nova Scotia, Canada (figuur 1). Speeksel, bloed of met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) werden verkregen van 6 familieleden met maagkanker, evenals 27 onaangetast familieleden, en één trouwde in individu. Geen bloedverwantschap werd ervan verdacht in deze stamboom.

De proefpersoon, getroffen individuele 1884, werd gediagnosticeerd met gemetastaseerd maagcarcinoom en onderging een totale gastrectomie op de leeftijd van 51. Pathologisch onderzoek bleek een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom ontstaan ​​in de antrum van de maag in een achtergrond van intestinale metaplasie en chronische gastritis. De tumor was samengesteld uit een vel zegelring cellen (figuur 2C en D). De carcinoom dringt door de gehele dikte van de muscularis propria waarbij de serosale lagen. Geen bewijs van H. pylori
werd gezien.

moederlijke tante van de proband's, individuele 1826, werd op de leeftijd van 80 gediagnostiseerd met maagcarcinoom en onderging een gedeeltelijke gastrectomie. Pathologisch onderzoek bleek een matig tot slecht gedifferentieerd adenocarcinoom invasie in muscularis propria (Figuur 2A). De tumor werd voornamelijk samengesteld uit samenhangende nesten van neoplastische cellen met af en toe een klier formatie. Tumorcellen met zegelring celvormen waargenomen in effen vlakken (figuur 2B). Het maagslijmvlies naast de tumor vertoonde focale intestinale metaplasie zonder aanwijzingen H. pylori
.

Op de leeftijd van 76 een maag biopsie van een andere moeder tante de proband, individuele 1841, werd gemeld dat een matig gedifferentieerd adenocarcinoom met klieren formatie hebben. H. pylori
werd geïdentificeerd op de achtergrond maagslijmvlies. Een kleine biopsie gedeelte was beschikbaar voor een nieuw onderzoek. Hoewel dit monster te klein voor een volledige indeling was, bleek cohesieve nesten van neoplastische cellen met kleine foci van glandulaire formatie in overeenstemming met een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom. Er waren enkele tumorcellen in het monster dat duidelijk cytoplasma, maar deze kon niet definitief worden aangemerkt als zegelring cellen.

Een maag biopsie op de leeftijd van 82 van de patiënt 1844, de moeder van de proefpersoon is, liet een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom met zegelring functies. De achtergrond slijmvlies vertoonden tekenen van H. pylori Kopen en fragmentarisch intestinale metaplasie.

Patiënt 1845, een eerste-neef eenmaal verwijderd om de proband, werd gediagnosticeerd op leeftijd 59 een ongedifferentieerd carcinoom zonder zegelring functies. De tumor werd geassocieerd met dichte lymfoïde infiltratie en werd het best geklasseerd als lymfo carcinoom. H. pylori
niet getoond in de bijgaande normale mucosa. De tumor was positief voor twee intronic varianten in CDH1
die beide naar verwachting goedaardig zijn (NM_004360.3: c.688-83G > A en c.2439 + 52G > A)
<. p> Patient 2447, een derde neef, werd gediagnosticeerd op de leeftijd van 44 met een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom zonder zegelring cel functies. De aangrenzende maagslijmvlies vertoonde uitgebreide intestinale metaplasie. Er was geen bewijs van H. pylori
.

Na screening van een panel van 115 proefpersonen met niet CDH1
familiale maagkanker, werd een niet-verwante familie van Portugal naar onze studie (figuur 3A) toegevoegd. Individuele II-6 werd gediagnosticeerd met maagkanker op leeftijd 62, met slecht gedifferentieerde adenocarcinoom van de maag en de aanwezigheid van zegelring cellen. Immunohistochemische analyse toonde positieve membraneuze kleuring van E-cadherine in neoplastische cellen (Figuur 3C), waaronder zegelring cellen (Figuur 3B). De verwante individuen I-4, II-1 en II-7 werden gediagnosticeerd met maagkanker (histologie gegevens onbekend) op leeftijd 53, 62 en 52 respectievelijk. Alle vier de personen in de Portugese pedigree gestorven aan de ziekte binnen 5 jaar na de diagnose in deze familie. In het Maritiem Canadese familie, 1884, 1844 en 1841 stierven aan de ziekte binnen een jaar na de diagnose.

De maagkanker beschreven voor patiënten 1845 en 2447 had geen zegelringen geobserveerd en werd gediagnosticeerd in een eerder gemiddelde leeftijd ( 52 versus 72, hoewel de proband op leeftijd 51 werd gediagnostiseerd). Op basis van verschillen in histologie, met name het ontbreken van zegelring cellen in 1845 en 2447 in vergelijking met de andere getroffen individuen, is het mogelijk dat de ziekte in deze twee personen heeft een specifieke aandoening. Als alternatief is het mogelijk dat de familie is de weergave van een meer complexe fenotypische patroon wordt aangedreven door twee (of meer) genen.

Molecular Mapping en Uitsluiting van bekende en kandidaat-genen

Hoewel 30-40% van HDGC gevallen zijn te wijten aan mutaties in CDH1
, geen mutaties in eiwit-coderende exons van CDH1
in de getroffen personen werden gevonden van de Maritieme Canadese familie. Om de ziekteverwekkende loci te identificeren in deze familie, een hoge dichtheid SNP-genotypering met behulp van Illumina arrays werd uitgevoerd op vijf betrokken personen: de proband de moeder (1844), twee getroffen moeders tantes (1826 en 1841), en twee verre neven (1845 en 2447) evenals een aantal verwante individuen zonder gerapporteerde incidentie van kanker waarvan genegenheid status werd behandeld als onbekende (1907, 1924, 1821 en 1822). Voor alle personen met uitzondering van 1845 genotypering gegevens beschikbaar was bij 2,5 miljoen markers. Individuele 1845 was eerder gegenotypeerd bij een dichtheid van 660k en kon niet opnieuw worden gegenotypeerd bij de hogere dichtheid. Geen DNA geschikt voor SNP genotypering werd verkregen uit de FFPE monster van de proband (1884). Met behulp van deze gegevens, voerden we zowel niet-parametrische en parametrische linkage analyse met behulp van Merlin [12]. Gezien het late leeftijd bij het begin in veel getroffen familieleden, de penetrantie in het Maritiem pedigree is onbekend. Met het oog op de conservatieve bij het identificeren van genomische regio's van belang, twee dominante penetrantie modellen (50% en 99% penetratie) met behulp van de getroffen personen 1826, 1841, 1844 en 2447 (en individuen 1907, 1924, 1821 en 1822 met onbekende genegenheid status ) waren gebruikt. Genomische regio's die in het kader parametrische linkage analyse waren over het algemeen consistent met elkaar, ongeacht de penetrantie parameter gekozen (tabel 1). De analyse werd herhaald met 2447 individuele behandeld bekend om alleen de gereduceerde stamboom analyseren waarbij 2447 en 1845 als potentiële phenocopies (Tabel 2) werden behandeld. Dit resulteerde in lagere totale LOD scores voor alle regio geïdentificeerd, evenals meer en grotere gebieden gemiddeld en omvat een groter gedeelte van het genoom.

We ook uitgevoerd non-parametrische koppeling (NPL), een werkwijze minder onderliggende veronderstellingen over de onderliggende erfenis model, met behulp van de betrokken personen 1826, 1841, 1844 en 2447 (pedigree-breed) of met de verwijdering van 2447 als een potentiële phenocopy door deze te specificeren te zijn van een onbekende status (sub-stamboom). Ras gehele genomische intervallen waren grotendeels overeen met die welke met de twee parametrische modellen (tabel 3). Uitsluiting van 2447 resulteerde in een lagere totale maximale score (1,204) en bleek op verschillende tijdstippen gedurende het genoom (tabel 3).

Genomische intervallen die op deze wijze werden toegepast voor het filteren van de exome sequentiebepalingsgegevens identificeren potentiële causatieve mutaties. Brede naar mogelijke oorzakelijke mutaties in zowel de stamboom gelden en sub-stamboom geval de intervallen van de respectievelijke parametrische en niet-parametrische analyse werden tezamen. Voor de stamboom-brede analyseert dit was de vereniging van intervallen beschreven in Tabel 1, samen met de juiste intervallen in tabel 3 (met inbegrip van 2447) en voor de sub-pedigree de analyse van de vereniging van intervallen in tabel 2 met passende tussenpozen in tabel 3 ( exclusief 2447).

exoom sequence

We next uitgevoerd hele exome sequencing op twee van de getroffen moeder tantes aan de proband (1826 en 1841) en de getroffen derde neef (2447). We prioriteit en gefiltreerd varianten op basis van de frequentie tussen Europese afkomst populaties (< 2% en een strengere filter < 1%) van de 1000 genomen en exome Sequencing Project datasets en andere exoom sequentie op hetzelfde sequencing provider, locatie binnen een genomisch gebied van belang, en de functionele gevolg van de mutatie (wijziging van de eiwit coderende sequentie of splitsingsplaats van ten minste één eiwit coderend transcript). Varianten van belang werden vervolgens gesequenced door Sanger sequencing in andere getroffen personen. Variant filtratie gebaseerd op genomische intervallen werd afzonderlijk uitgevoerd voor elke hypothese (whole-ras en tegen verlaagde ras) (Tabellen S1 en S2). Naast de identificatie en filtratie van genetische varianten, hebben we de sequentie diepte van de dekking van exons (gedefinieerd door het Consensus CDS set) binnen genoomgebieden plaats en over individuele exome sequencing resultaten. Verder hebben we gezocht naar mogelijke gedeelde varianten die werden "gemaskeerd" door de dekking kwesties. Voor alle varianten waargenomen in één of meer exoom, indien geen variant in de resterende exome (s) waargenomen, evalueerden we of dat als gevolg van lage en dekking openingen in het exon. Voor varianten waarbij dit waar was gefiltreerd we gebruik van standaard criteria (zie hierboven). Met deze filtercriteria verscheidene varianten met lage MAF en een effect kan hebben op het eiwit-coderende niveau waargenomen in de stamboom gehele genomische gebieden van belang die waren vastgesteld door parametrische koppelingsanalyse; waren echter niemand aanwezig in alle getroffen personen. Verdere geen "gemaskeerd" kandidaat varianten werden geïdentificeerd door dezelfde criteria.

We overwogen de mogelijkheid dat personen 1845 en 2447 hebben een duidelijke klinische toestand, en onderzocht varianten gedeeld de proband en directe familie. Met dezelfde filtercriteria als hierboven, maar met alleen de exoom van individuen 1826 en 1841, in totaal 127 varianten werden geïdentificeerd. Strengere filtering voor zeldzame varianten (MAF < 1%) teruggebracht dit aantal tot 85 (tabel S2). Een subset van deze varianten, gebaseerd op een combinatie van factoren (mutaties in COSMIC [13] voorspelde effect van de mutatie, behoud van het gecodeerde aminozuur, literatuur bekend expressiepatronen in normale weefsels en tumoren, ziekte fenotypes geassocieerd met de -gen) werd de sequentie voor de follow-up in de proband en hun moeder. Een variant in de MAP3K6
(Chr1, NM_004672) was van bijzonder belang. Een geïdentificeerd mutatie MAP3K6
(. C [2837C > T]; [=] p.P946L) werd beschouwd als een sterke kandidaat gebaseerd op de bekende verenigingen van andere MAP kinasen met kanker en verschillende publicaties opheldering van een MAP3K6 rol bij het ontstaan ​​van tumoren [10], [11], [14], [15]. Deze variant is eerder (rs141787524) die met een kleinere allel frequentie van 0,7% in 1000 Genomes project (European afstammingsgroep) en een frequentie van 0,4% in het Europees-Amerikaanse bevolking (exome Variant Server (NHLBI GO exome Sequencing Project ( ESP):. http://evs.gs.washington.edu/EVS [Betreden oktober, 2013]) het werd gezien als een heterozygote variant in 11 (van 1532) andere exoom gesequenced aan de Genome Quebec Innovation Centre, wat overeenkomt met een MAF van 0,36%.

Dit SNV was aanwezig in vier getroffen personen in de Maritieme familie (1884, 1826, 1844, 1841), waarvan drie duidelijk toonde de aanwezigheid van zegelring cellen. Slechts een klein punch biopsie beschikbaar voor de moederlijke tante, 1841 was, dus waren we niet in staat om de aanwezigheid of afwezigheid van zegelring cellen definitief te bevestigen. de MAP3K6
SNV was ook aanwezig op de vijf van de 27 nog onaangetast familieleden bemonsterd, en het was niet aanwezig in de trouwde in relatieve. Een van de dragers werd homozygoot voor de SNV en het was meer dan 80 jaar oud met geen meldingen van kanker. Hoewel er geen consanguiniteit werd gemeld in de familie, en geen bewijs van kopieaantal variatie werd waargenomen in de SNP genotype gegevens, deze persoon ook homozygoot voor een 10 Mb gebied omvat de locus. De overige vervoerders varieerden in leeftijd 33-51, en de leeftijd van het begin van de kanker werd over het algemeen later, hun status werd beschouwd als "onbekend". Zowel particulieren, 1845 en 2447, met de fenotypisch verschillende maagkanker waren negatief voor de MAP3K6
SNV.

Somatische varianten binnen de Tumor

We naast het DNA geïsoleerd uit gebruikte een tumor deel van de FFPE monster van de getroffen MAP3K6
SNV carrier 1884 (de proband) om het scherm voor extra somatische SNVs of verlies van heterozygositeit (LOH) in de tumor zelf. Naast de p.P946L variant, identificeerden we een nieuwe SNV in de MAP3K6
gen op positie c [1516C > T]. Leidt tot een aminozuurverandering p.H506Y (Tabel 4), en konden te concluderen dat de SNV somatisch werd verworven op basis van sequentie gegevens van de echtgenoot en de kinderen.

Verificatie in Unrelated FGC zaken

We gescreend DNA-monsters van een extra 115 niet-verwante FGC individuen met behulp van een multiplex-gerichte next generation sequencing-test. De monsters waren afkomstig van niet-verwante families die internationale maagkanker koppeling consortium (IGCLC) voldeden aan de criteria voor erfelijke diffuse maagkanker (106), maar had eerder negatief getest op mutatie van de CDH1
locus, of familiaire intestinale maagkanker. Binnen dit cohort, identificeerden we vijf extra heterozygote SNVs in de MAP3K6
gen (Tabel 4): a. Afkappen SNV (c. [2544delC], p.F849Sfs * 142), drie missense SNVs (c [2872C > A], p.P958T; c. [598G > T], p.D200Y, en c [620T >. G], p.V207G), en een ander individu met de p.P946L (c [2837C >. T] ) variant, eerder gevonden in het Maritiem gezin (figuur 4). Mutaties in MAP3K6
alleen de personen aan de criteria voor diffuse maagkanker (106) werden ontdekt. Het individu in deze roman patiënt cohort die de p.P946L variant wordt gedacht die niets met het Maritiem familie te zijn.

Het afkappen SNV werd waargenomen in een Portugese individu met een familiegeschiedenis van maagkanker (figuur 3A). Hoewel dit SNV heeft een dbSNP identifier (rs34008139), heeft geen enkele bevolking frequentie in verband gebracht met deze van zowel de 1000 Genomen of exome Variant Server projecten. Deze SNV is ook gemeld in de COSMIC-database [13] (somatische /kiembaan-status niet nader gespecificeerd) in een carcinoom steekproef van de dikke darm. Histologisch onderzoek van de tumor de proband bleek een slecht gedifferentieerde maagkanker met zegelring cellen, met behoud van E-cadherine eiwitexpressie aan het celmembraan (Figuur 3B en 3C).

De p.D200Y variant werd gevonden in proefpersonen uit twee niet-verwante families, en is waargenomen in de 1000 genomen cohort (rs41291098), maar is ook zeldzaam met een kleinere allel frequentie (MAF) van 0,4% in zowel de 1000 genomen en exome Sequencing Project Europese afkomst groepen. De p.P958T variant (rs75893867) heeft geen MAF gerapporteerd bij zowel de 1000 Genomes of exome Sequencing Project Europese afkomst datasets, en is alleen geïdentificeerd in de 1000 Genomen bij de Japanse cohort met een frequentie van 2,2%. Er is echter geïdentificeerd in COSMIC (COSM99077) als somatische mutatie van maagcarcinoom patiënt. De p.V207G variant is geïdentificeerd in de exome Sequencing Project Europees-Amerikaanse dataset met een MAF van 0,01%. Het was niet geïdentificeerd onder Europese of Europese afkomst groepen binnen de 1000 genomen, maar werd waargenomen bij andere bevolkingsgroepen bij een bereik van kleinere allel frequenties.

Samen met MAP3K6
, 50 extra genen die eerder voorgesteld betrokken te zijn bij risico op de ziekte van het bovenste maagdarmkanaal werd de sequentie van dit cohort met een aangepaste panel gebaseerde bepaling (manuscript ingediend). Genen voor het aangepaste MiSeq-gebaseerde scherm werden geselecteerd op basis van literatuuronderzoek, evenals genen van belang in samenwerkingsprojecten. In de gevallen waarin de MAP3K6
missense varianten werden geïdentificeerd, geen enkele andere kandidaat-varianten werden gevonden.

Tweede-Hit Analysis in de tumor uit de Portuguese Family

FFPE tumorweefsel was beschikbaar zijn voor de proefpersoon van de Portugese familie die de p.F849Sfs * 142 kiembaan beknotten mutatie. Somatische mutaties werden uitgesloten in de volledige coderende sequentie en intron-exon grenzen van de MAP3K6
in de tumor de proband's. Gebrek aan LOH op de MAP3K6
gen kan ook worden afgeleid in deze tumor, omdat zowel wild-type en mutante allelen konden worden geïdentificeerd aan de kiembaanmutatie website (aanvullende figuur S2). We hebben daarom gezocht naar mogelijke alternatieve mechanismen inactiveren. Hypermethylering van CpG eilanden in gen promoters en regelende gebieden is een algemeen verschijnsel leidt tot een verminderde genexpressie bij kanker [16]. MAP3K6
regulatie door hypermethylering promoter is beschreven voor menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen [17], alhoewel een correlatie van hypermethylering en genexpressie is niet vastgesteld. Wij zochten naar MAP3K6
CpG eilanden [18] en vonden twee CpG eilanden, een aan het promotorgebied en andere omvattende exon 10 en een deel van het stroomafwaartse intron (Figuur 5 en Figuur aanvullend S1). De downstream CpG eiland (CpG eiland 2) ligt in de buurt van een DNase overgevoelig website voorspeld promotor bijbehorende functies (Ensembl regulerende functie ID ENSR00000533270, figuur 5) haven. We bisulfiet behandeld DNA uit: de proband van perifere bloedlymfocyten (PBL's); tumor de proband's; vier verschillende normale maag controlemonsters, en; zeven maagkanker cellijnen. Voor de promotor CpG eiland (CpG island 1) werd geen Hypermethylering gedetecteerd met twee verschillende primersets (Figuur 5 en Suppl. Figuur S1). Ten aanzien van CpG eiland 2 zagen we volledige methylatie van de tumor DNA en geen methylering voor de PBL's DNA. Interessant is dat de methylatie analyse op CpG eiland 2 in normale maagslijmvlies van controles vertoonden een gedeeltelijke methylatie patroon. In lijn met de verkregen voor tumor DNA resultaat, toonde alle zeven maagkanker cellijnen volledige methylatie (Figuur 5 en Suppl. Figuur S1).

pathogeniciteit van SNVs in MAP3K6

We pasten een verscheidenheid aan in silico
methoden om de pathogeniciteit van de waargenomen missense SNVs voorspellen. Hoewel er geen volledige overeenstemming in programma (tabel 5), alle werden SNVs schadelijke geacht door ten minste één programma, en met uitzondering p.V207G p.P958T en zijn de andere vier varianten in dit rapport beschreven voorspeld door schadelijk zijn tenminste 3 van de 7 methoden. Bovendien, de EvoD [19] consensus voorspelling (gebaseerd op een evenwichtige combinatie van de EvoD, PolyPhen2 [20], en zeef [21] scores) dat drie van de varianten (p.D200Y, p.V207G, p.H506Y ) waren schadelijke of waarschijnlijk ongunstig beïnvloedt. De twee overige varianten, p.P946L en p.P958T werden voorspeld waarschijnlijk neutraal veranderingen hoewel ze evolutionair ultra-geconserveerde en goed geconserveerd respectievelijk (volgens EvoD evolutionaire tarief classificatie); terwijl slechts één van de drie andere varianten (p.D200Y) werd beschouwd goed geconserveerd en de overige twee zijn minder geconserveerd. (I) een MAP3K6
afkappen variant werd gevonden, (ii) er een tweede getroffen variant die in het individu voor wie FFPE weefsel werd onderzocht, en (iii) alle geteste ontworpen programma pathogeniteit voorspellen gebaseerd op functieverlies, is het waarschijnlijk dat de varianten beschreven leiden tot ofwel een afname van functie of dominante negatieve fenotype.

Discussie

Hier presenteren we het eerste bewijs dat kiemlijn mutaties in MAP3K6
zijn gekoppeld aan erfelijke kanker. Vier personen met maagkanker van een maritieme Canadese familie bleken een heterozygote variant in de MAP3K6
gen bevatten, leidt tot een p.P946L aminozuurverandering. Dit kiemlijn variant op chromosoom 1, geïdentificeerd in twee van de drie exome monsters en is gelegen binnen een gebied aangeduid met parametrische en niet-parametrische koppelingsanalyse in de sub-ras (1845 en 2447 behandeld als "onbekend" ziektestatus) . De betekenis van de MAP3K6
variant werd gesteund door de identificatie van een somatische tweede getroffen mutatie in de MAP3K6
gen op p.H506Y aanwezig in DNA direct geïsoleerd uit een tumor sectie van een patiënt FFPE monster. Twee personen uit de pedigree met maagkanker, maar met een aantal fenotypische verschillen heeft de mutatie niet dragen; Er werden echter geen kandidaat-varianten geïdentificeerd gedeeld tussen alle betrokken individuen binnen elke regio geïdentificeerd door parametrische linkage uitgevoerd pedigree-breed.

Het screenen van extra FGC families bleek vijf andere MAP3K6
mutaties, met inbegrip van een p.F849Sfs * 142 kiembaanmutatie waargenomen in de Portugese proefpersoon, die naar verwachting zal leiden tot een eiwit afkappen. Na uitsluiting van somatische mutaties en LOH, werd een potentiële tweede-hit mechanisme gevonden via
hypermethylering op een intragene CpG eiland in de buurt van een voorspeld-promotor geassocieerd regulerend element (DNAse I overgevoelig site). De relevantie van methylatie in deze MAP3K6
gen regio kan niet worden vastgesteld wat de impact in genexpressie, toch de mogelijkheid om op te treden als een mogelijke tweede-hit inactivatie (gedeeltelijk of volledig) mechanisme wordt verhoogd, als gevolg van de resultaten verkregen in normale maag en kankercellijnen. Als dat zo is, kan dit goed vertegenwoordigen een ander voorbeeld van de toenemende mate erkend concept dat DNA-methylatie in het gen lichaam is niet alleen een passieve getuige van gentranscriptie, maar is actief betrokken bij verschillende genregulatie processen [22], rechtvaardigt verder onderzoek. Histopathologie analyse van het individu van de Portugese familieleden die deze afkappen mutatie gekenmerkt zegelring cellen als deel van de tumor fenotype, zoals de meeste individuen uit de Maritime sub-ras (behalve 1841, wanneer de zegelring toestand niet overtuigend vanwege gebrek aan voldoende materiaal).

Hoewel de MAP3K6
mutaties zijn niet eerder geïdentificeerd bij erfelijke kanker, is er een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal dat de MAP3K6
heeft een belangrijke rol in kanker pathogenese . Bij muizen, waarbij MAP3K6
wordt normaliter uitgedrukt in de maag weefsel en huid, het verlies van de MAP3K6
in homozygote knockout muizen bleek de gevoeligheid te verhogen tot geïnduceerde huidkanker [10]. De muizen niet spontaan ontwikkelen van kanker; echter chemische inductie in aanwezigheid van een inflammatoire stimulus tot een groter aantal huidtumoren in de MAP3K6
deficiënte muizen dan bij controledieren. Het aantal tumoren bij heterozygote ( MAP3K6
^{+/-) muizen, evenals hun grootte, was intermediair tussen wild-type en knock-out muizen, suggereert een rol voor MAP3K6
dosering in de gevolgen ervan [10].}

• PLoS ONE: Vergelijkende Proteomics Analyse van maagkanker Stem Cells
• PLoS ONE: Toenemend Core-fucosylatie Draagt ​​bij aan Maligniteit bij maagkanker