PLoS ONE: PKG II hemmer EGF /EGFR-Induced Migrasjon av magekreft Cells

Abstract

Bakgrunn

Vårt tidligere forskningsresultater har vist at type II cGMP avhengig proteinkinase (PKG II) kan blokkere aktiveringen av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og følgelig hemme proliferasjonen og den tilhørende MAPK /ERK-mediert signaltransduksjon av magekreft cellelinje BGC-823, noe som tyder på at PKG II kan hemme andre EGFR-utløst signaltransduksjonsveiene og tilhørende biologiske aktiviteter av mage kreftceller. Dette papiret er designet for å undersøke potensialet hemming av PKG II på EGF /EGFR-indusert migrering aktivitet og de relaterte signaltransduksjonsveier.

Metodikk /hovedfunnene

I magekreft cellelinje AGS, ekspresjon og aktivitet av PKG II ble øket ved å infisere cellene med adenovirus-konstruksjonen som koder for PKG II cDNA (Ad-PKG II) og å behandle cellene med cGMP analoge 8-pCPT-cGMP. Fosforylering av proteiner ble påvist ved Western blotting og aktive små G-protein Ras og Rac1 ble målt ved hjelp av "Pull-down" metoden. Cellemigrering-aktivitet ble påvist med trans-brønnutstyr. Binding mellom PKG II og EGFR ble oppdaget med Co-IP. Resultatene viste EGF-stimulert migrasjon av AGS celle og effekten var relatert til PLCγ1 og ERK-mediert signaltransduksjonsveier. PKG II hemmet EGF-indusert migrering aktivitet og blokkert EGF-initiert signaltransduksjon av PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert trasé gjennom å forebygge EGF-indusert Tyr 992 og Tyr 1068 fosforylering av EGFR. PKG II bundet med EGFR og forårsaket treonin fosforylering av det.

Konklusjon /Betydning

Våre resultater systemisk bekrefter hemming av PKG II på EGF-indusert migrering og tilhørende signaloverføring av PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert veier, noe som indikerer at PKG II har en fargoing hemming på EGF /EGFR relatert signaltransduksjon og biologiske aktiviteter av magekreftceller gjennom fosforylering EGFR og blokkerer aktivering av det

Citation. Jiang L, Lan T Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II hemmer EGF /EGFR-Induced Migrasjon av Gastric kreftceller. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

mottatt: 30 september 2012; Godkjent: 12 mars 2013; Publisert: 16 april 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation of China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 og No.31100974 National; Innovasjons Grant Jiangsu University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Type II cGMP-avhengige proteinkinaser (PKG II) er en serin /treonin-kinase og akkumulerende forskningsdata indikerte at dette kinase hatt en viktig rolle i regulering av celle biologiske aktiviteter som proliferasjon og apoptose, særlig i tumorceller . I 2004 Cook et al
fant at PKG II kan indusere apoptose av menneskelige dyrkede prostata stromale celler [1]. I 2009 Swartling et al
rapportert at PKG II hemmet spredning av menneskelige neuroglioma celler og hemming var relatert til reduksjon av uttrykk for transkripsjonsfaktor Sox9 og fosforylering av Akt [2]. I 2011 Fallahian et al
fant at cGMP kan indusere apoptose av brystkreft celler og denne effekten var relatert til PKG II [3]. Under vår forskning, har vi funnet at ekspresjon og aktivitet av PKG II i humane magecancercellelinjer var betydelig lavere enn den normale gastriske mucosa-celler [4]. Videre studie i vårt laboratorium har vist at PKG II kan hemme proliferasjonen av magecancercellelinjer og blokkere EGF-indusert signaltransduksjon av MAPK /ERK-mediert reaksjonsvei ved å forhindre aktivering av EGFR av EGF [5], [6]. Siden aktivering av EGFR kan initiere flere signaltransduksjonsveier inkludert MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT og PLCγ1-medierte baner [7], [8], den blokkerende effekt av PKG II på aktivering av EGFR tyder på at dette enzymet kan ha et bredt spekter hemmende effekt på signaltransduksjon og de tilhørende biologiske aktiviteter av magekreftceller. Dette papiret er designet for å bekrefte dette bredt spekter hemmende effekt av PKG II gjennom å undersøke hemming av PKG II på EGF-indusert migrering aktivitet og tilhørende signaloverføring i magekreftceller.

Resultater

PKG II inhiberer EGF-indusert cellemigrering som er forbundet med signaloverføring av PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert Pathways

Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP er viktig i normal fysiologi og i sykdom. Oppkjøp av trekkfugl evne ved kreftceller er en egenskap som bidrar til spredning av metastatiske tumorceller til fjerne organer. Nyere data viste at EGF kunne stimulere vandring av kreftceller. Den mekanisme som EGF stimulerer cellemigrasjon er ikke klart, men noen data indikerte at EGF kan gjøre dette gjennom å initiere signaltransduksjon av PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert veier. I dette eksperimentet, vi har oppdaget migreringen-stimulerende virkningen av EGF i AGS-celler og benyttet inhibitor av nøkkelkomponenter i signalveier for å undersøke den mulige signaloverføring knyttet til virkning. Resultatene viste at EGF behandlingen økte migrering aktivitet av AGS-celler og både MEK (nøkkelkomponent i MAPK /ERK-mediert reaksjonsvei) inhibitor U0126 og PLCγ1 inhibitor U73122 inhiberte EGF-indusert migrering, noe som indikerer at EGF-stimulert cellemigrering aktivitet ved å aktivere begge MAPK /ERK og PLCγ1 medierte signaloverføringsveier (fig. 1).

PKG II Blocks EGF-indusert Tyr 992 og Tyr 1068 Fosforylering av EGFR

Når EGF binder seg med EGFR, fører det auto- fosforylering av reseptoren. Det er flere auto-fosforyleringsseter som er forbundet med forskjellig signaltransduksjonsbane. Tyrosin 992 og tyrosin 1068 er blant de auto-fosforyleringsseter av EGFR og er forbundet med PLCγ1-mediert og MAPK /ERK-mediert signalisering hhv. I dette eksperimentet, undersøkte vi den hemmende effekten av PKG II på Tyrosin Tyrosin 992 og 1068 fosforylering av EGFR i forskjellig behandlede AGS-celler ved hjelp av Western blotting. Resultatene viste at EGF behandling forårsaket en 14 folds økning av Tyrosin 992 og en 8 folder økning av Tyrosin 1068 fosforylering av EGFR. I celler infisert med Ad-PKG II og stimulert med cGMP ble fosforylering signifikant redusert (fig. 2, 3). Dette indikerte at PKG II kan forhindre EGF-indusert Tyrosin 992 og Tyrosin 1068 fosforylering av EGFR og dermed hemme PLCγ1-mediert og MAPK /ERK-mediert signalering.

PKG II Hindrer EGF-utløst Main Events av PLCγ1-mediert signaltransduksjonsbane

(1) PLCγ1 aktivering.

PLCγ er nedstrømsdelen av reseptor tyrosin kinaser (RTK). Den har to isoformer: PLCγ1 er overalt distribuert og PLCγ2 uttrykkes hovedsakelig i hematopoetiske celler. Aktivering av PLCγ1 krever sin rekruttering til membranen og foreningen gjennom sitt SH2 domene, med aktivert RTK som EGFR. Denne forening vil føre til fosforylering av tyrosinrester på PLCγ1, særlig på tyrosin 783, og en økning av dets enzymatiske aktivitet. Vi søkte IP metode for å isolere PLCγ1 og deretter brukt Western blot metode for å påvise fosforylering av PLCγ1. Resultatene viste at EGF-behandling førte til en tydelig økning av Tyr783 fosforylering av PLCγ1 og økningen av PKG II aktivitet ved å infisere cellene med Ad-PKG II og stimulere cellene med cGMP effektivt forhindret den EGF-induserte fosforylering av PLCγ1 (Fig. 4 ).

(2) DAG formasjon.

Når den er aktivert, kan PLCγ1 katalysere hydrolyse av phosphatidylinositol 4,5-bisphos-sulfat (PI-4,5P _{2) inn i inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) og diacylglycerol (DAG), to molekyler som regulerer mobilisering av intracellulær Ca henholdsvis ^{2+ og proteinkinase C-aktivitet. For å observere virkningen av EGF og PKG II på dannelsen av DAG, ble ELISA-metoden som brukes for å detektere DAG konsentrasjon i AGS-celler. Resultatene viste at i EGF-stimulerte AGS-celler, nivået av DAG økes tydeligvis og pre-infeksjon med Ad-PKG II og behandling med 8p-CPT-cGMP inhiberte dannelsen av DAG forårsaket av stimulering med EGF (fig. 5).}}

(3) Ca ^{2 + slippe.}

IP3 og DAG er andre budbringere i PLCγ1-mediert signaltransduksjonsbane. IP3 er kjent for å stimulere utgivelsen av kalsium fra interne butikker. Vi brukte kalsium indikator fluo-3 /AM for å oppdage kalsium i cytoplasma. Resultatene viste at EGF behandlingen økte frigjøring av Ca ^{2+ fra endoplasmatisk retikulum (ER) til cytoplasma og høy ekspresjon og aktivitet av PKG II inhiberte signifikant frigjøring, å reversere virkningen av EGF-behandling (fig. 6).}

(4) Aktivering av PKCα.

PKCα, en isoform av protein kinase C, er en viktig del av PLCγ1-mediert signalveien og kan aktiveres ved Ca ^{2 + og DAG . Aktiveres, PKCα translocates fra cytosol til membranen av cellene. Så er mengden av PKCα på membranen representerer aktivering av PKCα. I dette eksperimentet, undersøkte vi den hemmende effekten av PKG II på aktivering av PKCα i forskjellig behandlede AGS-celler ved hjelp av Western blotting. Resultatene viste at innen fem minutter etter at EGF til kultur medium, trans av PKCα fra cytosol til membranen økt dramatisk og trans ble hemmet av pre-infiserer cellene med Ad-PKG II og behandling med 8-pCPT-cGMP ( fig. 7).}

(5) Aktivering av CaMKIIα.

studier om regulering av Ca ^{2 + /calmodulin (CAM) -avhengig kinase II alfa (CaMKIIα), som er en primær isoform av CaMKII, har antydet at når Ca 2 + /CaM binder seg med CaMKIIα, oppstår intra-molekylær autofosforylering og fosforylering opprettholder den vedvarende aktivering av enzymet. Antistoffet mot fosfo-CaMKIIα (Thr286) ble anvendt i Western blotting for å detektere fosforylering av CaMKIIα. Resultatene viste at i AGS celle behandlet med EGF, Thr286 fosforylering av CaMKIIα økt med nesten 2,5 folder og infeksjon med Ad-PKG II og behandling med 8-pCPT-cGMP hemmet veksten av fosforyleringen indusert av EGF (Fig. 8).}

PKG II hemmer EGF-indusert aktivering av de viktigste komponentene i MAPK /ERK-formidlet signaltransduksjonsbane

(1) Aktivering av MAPK /ERK.

MAPK /ERK er den viktigste komponenten i MAPK /ERK-mediert veien. Fosforylering på begge treonin 202 og tyrosin 204 rester av ERK1 og treonin 185 og tyrosin 187 rester av ERK2 er nødvendig for full enzymatisk aktivering. Det antistoff mot p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) ble anvendt i Western blotting for å detektere en dobbelt fosforylering av ERK. Resultatene viste at i løpet av fem minutter etter tilsetning av EGF til cellekulturmediet, fosforylering av ERK1 /2 i AGS-celler økt dramatisk (10 folder) og fosforyleringen ble inhibert av pre-infisere cellene med Ad-PKG II og aktivering av enzymet med 8-pCPT-cGMP (fig. 9).

(2) Aktivering av ras.

Små G protein Ras er en annen viktig komponent i MAPK /ERK-mediert signalveien. Den har to former i celler: GTP-bundet aktiv form og BNP-bundet inaktiv form. Når Ras er i GTP-bundet form, kan den binde og aktivere Raf-1 og starte den påfølgende aktiveringer av serin /treonin kinaser i signalveien. Vi anvendt "pull-down" metode for å påvise aktivert Ras. Resultatet viste at etter tilsetning av EGF til kulturmediet, øket aktiv Ras i AGS celler åpenbart i løpet av fem minutter. Infiserer cellene med Ad-PKG II og stimulere dem med 8-pCPT-cGMP før du legger EGF betydelig hindret EGF-indusert Ras aktivering (fig. 10).

PKG II hemmer EGF-indusert aktivering av Rac1

Små G-protein Rac1 er hoveddelen av Rho familie som spiller viktig rolle i å regulere migrasjon av kreftceller. Både PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert signaltransduksjon kan aktivere Rac1 og deretter stimulere celle migrasjon. For ytterligere å bekrefte den hemmende effekten av PKG II på EGF /EGFR-indusert signalering som er relatert til migrasjon, "Pull-down" metoden ble anvendt for å påvise inhibering av PKG II på aktivering av Rac1. Resultatet viste at EGF-behandling førte til en tydelig økning av aktiv Rac1 og høy aktivitet av PKG II effektivt inhiberte aktiveringen av Rac1 (fig. 11). Dette ga ytterligere bevis på hemming av PKG II på EGF-indusert migrering av magekreftceller.

PKGII samhandler med EGFR og årsaker Thr-phoshporylation av Receptor

mekanisme som PKGII blokker EGF-indusert aktivering av EGFR ble preliminært undersøkt i dette forsøk. Co-Immunoutfelling ble brukt for å påvise interaksjon mellom PKGII og EGFR. Western blotting med anti pan fosforylering av treonin antistoff ble anvendt til å detektere Treonin fosforyleringen av EGFR forårsaket av PKGII. Resultatene av Co-Immunpresipitasjon viste at i AGS celler infisert med Ad-PKG II og stimulert med 8-CPT-cGMP, direkte binding mellom PKG II og EGFR ble påvist (Fig. 12, panel A). Resultater av Western blotting viste at aktivering av PKG II forårsaket treonin fosforylering av EGFR (Fig. 12, panel B). Dette indikerte at PKG II blokkert aktiverings EGFR gjennom binding med reseptoren og forårsaker fosforylering av det.

Diskusjoner

Foreløpig to cGMP-avhengige protein kinaser (pkgs), PKG jeg og PKG II , er blitt identifisert i pattedyrceller [10], [11]. PKG I er vidt fordelt i kroppen, og på grunn av sin hemmende virkning på tumorvekst og invasivitet og induserende effekt på apoptose av tumorceller, er det blitt identifisert som en tumor suppressor [12]. Ekspresjon av PKG II er mer vev-begrenset [13]. For en lang tid, i motsetning til den godt påviste antitumoreffekten til PKG I, finnes det ikke noen forsøksdata tydelig indikert antitumor rollen til PKG II, og dette kinase ble bare implisert i en rekke fysiologiske funksjoner, inkludert intestinal sekresjon, beinvekst, og læring og hukommelse [14]. Imidlertid er forskning interesse om PKG II øker og noen nye funksjoner i PKG II har blitt funnet nylig, blant annet rollen som PKG II i reguleringen av epitelial natriumkanalen og mekanisk-signaltransduksjon [15] - [17]. Enda viktigere, samler forskningsdata indikerte at PKG II ble knyttet til proliferasjon og apoptose i noen celler, spesielt tumorceller, sterkt antyder den potensielle rolle av dette enzymet ved regulering av biologiske aktiviteter av tumorceller [1] - [6].

EGFR eksisterer på overflaten av alle celler. Med en molekylvekt på 170KD, har EGFR et ekstracellulært domene, et kryss-membrandomene og et intracellulært domene. Det intracellulære domene av EGFR har 542 aminosyre-rester, og kan deles opp i omtrentlig membran sub-domene, tyrosinkinase sub-domene, og C-terminale underdomene [18]. Den aktiverende prosess av EGFR inkluderer tyrosinfosforylering av sitt intracellulære domene, og forskjellige fosforyleringsseter på domenet er relatert til forskjellige signalveier. Når EGFR er aktivert, kan det rekruttere effektor proteiner til sin fosforylert C-terminale underdomene og initierer effektorcellene protein-medierte baner [19], [20]. Blant de fosforyleringsseter, er tyrosin 1068 og 1086 i forbindelse med MAPK /ERK-mediert reaksjonsvei og tyrosin 992 og 1173 er ​​knyttet til PLCγ-mediert signalveien [7], [8]. Våre tidligere resultater viste at PKG II kan hemme EGF-indusert tyrosin 1068 fosforylering av EGFR i magekreft cellelinje BGC-823 [6], heve spørsmålet om PKG II kan hemme fosforyleringen av andre tyrosin sider på EGF /EGFR og deretter ha et bredt spekter hemming på EGF /EGFR-indusert signal transductions og tilhørende biologiske aktiviteter av mage kreftceller.

i denne artikkelen har vi undersøkt virkningen av PKG II på EGF-indusert migrering aktivitet av magekreft cellelinje AGS. Resultatet viste at PKG II hadde signifikant hemming av cellemigrasjon forårsaket av EGF. Dette gir ytterligere bevis for å avsløre den tumor-inhiberende effekt av PKG II. Forsknings data har vist at blant de EGF /EGFR-initiert signaltransduksjonsveier, blir PLCγ1 og MAPK /ERK-mediert signaltransduksjonsveiene i forbindelse med migrasjonsaktivitet [21], [22]. For å bekrefte dette i magekreftceller, anvendte vi inhibitor av signaltransduksjon komponent for å identifisere deltakelse av MAPK /ERK og PLCγ1-medierte baner i prosessen. Resultatene viste at MEK-inhibitor U0126 og PLCγ1 inhibitor U73122 delvis blokkert EGF /EGFR-indusert migrering aktivitet av AGS-celler, noe som indikerer at begge signaltransduksjonsveiene deltok i reguleringsprosessen. For å belyse den potensielle inhiberende virkning av PKG II på følgende signaltransduksjonsveier, vi undersøkte først den hemmende effekten av PKG II på EGF initiert PLCγ1-mediert signaltransduksjon svei. Resultatene viste at PKG II hindret alle de viktigste begivenhetene i dette signaltransduksjonsbane, herunder Tyr 992 fosforylering /aktivering av EGFR, fosforyleringen /aktivering av PLCγ1, dannelsen av andre messenger DAG, frigjøring av kalsium inn i cytoplasma, og aktivering av PKC og CAMK IIα. For inhibering av PKG II på EGF /EGFR indusert MAPK /ERK-mediert signaltransduksjon vei, har vårt tidligere arbeid vist at PKG II hemmer aktivering av alle viktige komponenter i reaksjonsveien indusert av EGF i magekreft cellelinje BGC-823 [ ,,,0],6]. I denne artikkelen, undersøkte vi den hemmende effekten av PKG II på EGF /EGFR-indusert aktivering av sentrale komponenter i denne veien. Resultatene bekreftet at PKG II hemmet EGF-indusert aktivering av Ras protein og MAPK /ERK i AGS celler, noe som tyder på at PKG II også hemmet EGF /EGFR-indusert signaltransduksjon av MAPK /ERK-mediert veien i denne kreftcellelinje. Disse resultatene systematisk avdekket at PKG II hemmet EGF-indusert migrering av magekreftceller gjennom å blokkere EGF /EGFR initiert signaltransduksjon av PLCγ1 og MAP /ERK-mediert veier.

signaltransduksjon av både PLCγ1 og MAP /ERK medierte baner kan aktivere liten G-protein Rac1, noe som er en viktig komponent i regulering av cellemigrasjon [23], [24]. For å bekrefte inhibering av PKG II på dette viktig begivenhet i EGF-indusert migrering av gassceller, søkte vi "pull-down" metode for å kontrollere aktiviteten av Rac1 i forskjellig behandlede AGS-celler. Resultatene viste at i løpet av EGF-indusert migrasjon, ble Rac1 aktivert, og aktiveringen ble relatert til både PLCγ1 og MAP /ERK-mediert signalisering. Videre PKG II hemmet EGF-indusert aktivering av Rac 1. Dette bekreftet ytterligere hemmende effekt PKG II på EGF /EGFR initiert celle migrasjon.

EGFR er nært forbundet med tumorigenensis. Over uttrykk og mutasjon av EGFR ofte skjer i de fleste kreftformer. Forsøksdata viste at over 50% -70% av lungekreft, tykktarmskreft og brystkreft har høy ekspresjon av EGFR [25]. Videre kreftpasienter med over-uttrykk for EGFR vanligvis har dårlig prognose. For eksempel EGFR over-uttrykk ble påvist i 60% av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter og prognosen av pasientene var dårlig, med en overlevelse på 4-5 måneder bare [26]. In vitro
eksperimenter bekreftet at overuttrykk av EGFR forårsaket transformasjon av NIH-3T3, Rat-1 og NRK celler og blokkerer EGFR aktivering hemmet spredning av enkelte kreftceller [27]. Følgelig er EGFR den første vekstfaktor-reseptor tatt som mål kreftterapi. Flere metoder for inhibering av EGFR-aktivitet og tilhørende signaltransduksjon, inkludert spesifikke antistoffer mot EGFR og inhibitorer av EGFR, fikk intensiv forskning [28] - [30]. Nye og mer effektive metoder for blokkering av EGFR-mediert signaltransduksjon kan være nyttig i cancerterapi. Derfor er det funn at PKG II kan hemme aktiveringen av EGFR og påfølgende signaltransduksjon har viktig betydning. Det tyder på det sterkeste at PKG II er et potensielt endogene EGFR-hemmer og vil gi nye hint om strategien for kreftbehandling.

Forskningsdata viste at noen proteinkinaser kan føre til fosforylering av EGFR og påvirke dens aktivisering og /eller destinasjon. For eksempel kan protein kinase C (PKC) føre til fosforylering av Treonin 654 av EGFR og regulerer reseptorbinding og internalisering [31]. Serine 1046/1047 (Ser1046 /1047) fosforylering nettsted er nødvendig for EGFR desensitivisering i EGF-behandlede celler [32] .I våre eksperimenter, vi har oppdaget fosforylering av Thr654 og Ser1046 /1047 av EGFR og fant at PKG II ikke føre til at fosforylering av disse fosforyleringsseter. Men resultatene viste at det var en direkte interaksjon mellom PKG II og EGFR og PKG II forårsaket Treonin fosforylering av EGFR. Dette indikerte at PKG II blokkert aktivering av EGFR gjennom binding med og fosforylering av reseptoren. Den nøyaktige fosforylering området vil bli vår neste forskning mål.

Materialer og metoder

Cell Line og reagenser

Menneskelig magekreft cellelinje AGS ble gitt av Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina). Adenovirus vektorer som koder β-galaktosidase (PAD-LacZ) og PKG II (PAD-PKG II) var snill gaver fra Dr. Gerry Boss og Dr. Renate Pilz i University of California, San Diego, USA Dulbeccos modifiserte Eagles Media (DMEM) og føtalt bovint serum (FBS) var fra GIBCO (Grand Island, NY). Antistoff mot PKG II var fra ABGENT Bioteknologi (San Diego, California). Goat anti-β-actin, mus anti-pan-Ras og mus anti-PLCγ1 antistoffer var fra Santa Cruz (Santa Cruz, California). Kanin-anti-p-EGFR (Tyr1068), kanin-anti-p-EGFR (Tyr992), kanin-anti-EGFR, muse-anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), kanin-anti-ERK og kanin-anti-p-PLCγ1 (Tyr783) antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kanin anti-PKCα og kanin anti-p-CaMK IIα (Thr286) var fra BioWorld Technology (St. Louis Park, MN). Kanin-anti-p-Thr-antistoff var fra Abcam (MA, USA) .Horseradish (HRP) -konjugert sekundære antistoffer var fra Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Den cellulære gjennomtrengelig cGMP analog 8-pCPT-cGMP var fra Calbiochem (San Diego, California). EGF, U73122 og U0126 var fra Sigma (St. Louis, MO). Elektrokjemiluminescens (ECL) reagenser var fra Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + indikator Fluo-3 /AM og Membran og cytosol Protein Extraction Kit var fra Beyotime (Jiangsu, Kina). Menneskelig diacyl glyserol (DAG /DG) ELISA Kit var fra Cusabio Biotech Co., Ltd (Newark, DE). Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet.}

Utarbeidelse av adenovirus vektorer

293a fremstilte celler ble transfektert med henholdsvis og kultivert adenovirusvektor koding LacZ og PKG II i inntil ti dager før CPE ble sett. Cellene og kulturmedium ble høstet og gjennomgikk tre fryse-tine-sykluser. Supernatanten som inneholder adenovirus (Ad-lacZ og Ad-PKG II) ble brukt til å infisere nye 293a fremstilte celler til å forsterke adenovirus. De amplifiserte adenovirus preparater ble titrert og den pfu /ml ble bestemt, og holdt på -80 ° C inntil bruk.

Cellekultur og Infeksjon med adenovirusvektorer

AGS-celler ble dyrket i DMEM som følger med 10% FBS og holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 95% luft og 5% CO _{2. Mediet ble skiftet annenhver dag, og cellene ble sub-dyrket ved konfluens. På dagen før infeksjonen ble cellene nyplantet på 70-80% samløpet, og infeksjon med Ad-LacZ og Ad-PKG II ble utført.}

Western Blotting

Proteinprøver ble utsatt SDS-PAGE (8-12%) gel i henhold til molekylstørrelsen av målproteinet, og elektroforese og membran overføringen ble utført ved å følge produsentens protokoll (Bio-Rad, Hercules, CA). De primære antistoffene ble inkubert over natten ved 4 ° C i TBS-T (2% Tween-20), og de tilsvarende sekundære antistoffer ble inkubert i 1 time ved RT i TBS-T (2% Tween-20), med tre vaskinger etter hvert inkubasjon. ECL-reagenser ble brukt til å vise den positive bånd på membranen. For å utføre densitometry analyse, ble digitale bilder av de positive band oppnådd med Chemidoc XRS og analysert ved hjelp av bildeanalyseprogram Antall One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Resultatene var viste som forholdet mellom mål protein /lasting kontroll.

"Pull-down" Analyse av Active Small G protein Ras og Rac1

Aktiviteten av Ras ble påvist med Pull-down fremgangsmåte som tidligere beskrevet [9]. I korte trekk ble celler som vokser på 100-mm kulturplate ble vasket tre ganger med kald PBS og lysert ved tilsetning av 400 ul lyseringsbuffer (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 25 mM NaF , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natrium-deoksycholat, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ug /ml aprotinin og 10 ug /ml leupeptin). Prøven ble samlet og sentrifugert (14000 g, 4 ° C, 10 min) for å kvitte seg med avfall. Supernatanten ble inkubert med glutation-Sepharose-perler og glutation S
-transferase-Ras-RBD (GST-RBD) ved 4 ° C i 1 time. Perlene ble vasket 3 ganger med lyseringsbuffer og oppvarmet i kokende vann for å frigjøre proteiner. Proteinprøver (inneholdende aktiv Ras) ble analysert ved Western blotting med antistoff mot pannen-Ras. Den aktive Rac1 ble oppdaget med lignende metode, men med GST-Pak1 proteinbinding domene (GST-PBD) og antistoff mot Rac1.}

Immunpresipitasjon

Cellene vokser på 100 mm kulturplate ble vasket to ganger med kald PBS og lysert ved tilsetning av 1 ml RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) per plate. Antistoffer mot PLCγ1 og p-PLCγ1 ble anvendt for immunopresipitering. Bunnfallet ble undersøkt med antistoffer mot target proteiner.}

Analyse av kalsium i cytoplasma

For å overvåke effekten av EGF og PKG II på EGF-indusert kalsium utgivelse, AGS celler ble lastet med 5 mikrometer av membran gjennomtrengelig kalsiumindikator fluo-3-acetoksymetyl (AM) ester i 30 minutter ved 37 ° C i DMEM. Etter lasting, ble cellene vasket med PBS og suspendert i DMEM. Fluorescensmålingene ble utført ved anvendelse av et Olympus Fluoview-500 konfokalt system. Fluo-3 ble opphisset av argon laser lys ved 488 nm og fluorescens ble målt ved bølgelengder på 515 nm.

ELISA-analysen av DAG

DAG konsentrasjoner ble målt med ELISA, i henhold til produsentens anvisninger . Denne analysen benytter kvantitative sandwich-enzym immunoassay teknikk. Antistoff som er spesifikt for DAG har blitt forhåndsbelagt på en mikroplate. Standarder og prøver blir pipettert inn i brønnene og eventuelle DAG fore er bundet ved det immobiliserte antistoffet. Etter fjerning av eventuelle ikke-bundne substanser, er en biotin-konjugert antistoff som er spesifikt for DAG tilsatt til brønnene. Etter vasking, blir avidin konjugert pepperrotperoksidase (HRP) tilsatt til brønnene. Etter en vask for å fjerne eventuelt ubundet avidin-enzym-reagens, er en substratoppløsning tilsatt til brønnene og farge utvikler seg i forhold til mengden av DAG bundet i det første trinn. Fargen utviklingen er stoppet og intensiteten av farge blir målt.

subcellulære fraksjonering

subcellulære fraksjonering i cytosol og membran fraksjoner ble utført ved hjelp av membran og cytosol Protein Extraction Kit, i henhold til produsentens instruksjon. Monolagskulturer ble vasket tre ganger med iskald PBS-oppløsning og skrapet inn kald homogeniseringsbuffer (HB) inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glyserol, 10 g /ml leupeptin, og 1 mM PMSF. Cellene ble lysert via sonikering med 4-15 s intervaller og fullstendig lysis ble overvåket mikroskopisk. Homogenatet ble ultrasentrifugert ved 86 000 g i 45 min ved 4 ° C, og supernatanten ble betegnet som den cytosoliske fraksjon. Pelleten ble resuspendert i HB inneholdende 1% Triton X-100 og inkubert på is i 30 min. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 14000 g i 20 min ved 4 ° C, og supernatanten ble betegnet som membranfraksjonen. Alle prøvene ble kokt og klarert av sentrifugering.

Cell Migration analysen

Migrasjon aktivitet av AGS celler ble oppdaget av transwellsystem (BD BioCoatTM kontroll 8,0 mm PET Membran 24-brønns Cell kultur inserts, BD biovitenskap). Etter trypsinering ble 5 * 10 ^{4cells sådd i det øvre kammeret inneholder kulturmedium uten FBS. Cellevandring til den nedre side av membranen ble indusert av medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer i 12 timer ved 37 ° C i en vevskulturinkubator. Migrerte celler på den nedre side av membranen ble fiksert i 40% paraformaldehydløsning i 30 minutter, beiset i Giemsa-løsning i 10 minutter, og deretter skyllet i vann. De fargede cellene ble underkastet mikroskopisk undersøkelse under et lysmikroskop. Migrerte celler ble talt i 5 tilfeldig utvalgte felt per innsats, og verdiene ble i gjennomsnitt. Alle forsøkene ble utført med tre replikater under hver migrering tilstand.}

Statistical Analysis

Dataene ble uttrykt som middelverdier ± standardavvik (SD). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en to-tailed ANOVA med SPSS statistisk programvare. En P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.

Takk

Vi takker Dr. Gerry Boss og Dr. Renate Pilz, University of California, San Diego, USA for den type gaver av adenovirus konstruksjoner.

• PLoS ONE: sosiodemografiske og geografiske forhold i Esophageal og magekreft dødelighet i Sverige
• PLoS ONE: Overuttrykte CD151 Spår Prognose hos pasienter med resected Gastric Cancer