PLOS ONE: O Efeito Inibidor de Pseudolaric Ácido B sobre Câncer Gástrico e multirresistência via Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway

Sumário

Objectivo

Para investigar a inibitória efeito do ácido B pseudolaric em xenoenxertos subcutâneos de adenocarcinoma gástrico humano e os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos na sua resistência a múltiplas drogas.

Métodos

células adenocarcinoma gástrico SGC7901 humanos e células resistentes à droga SGC7901 /ADR foram injectado em ratinhos nus para estabelecer um modelo de xenoenxerto subcutâneo. Os efeitos do ácido B pseudolaric com ou sem tratamento com a adriamicina foram comparadas através da determinação do tamanho e peso do tumor. A ciclo-oxigenase-2, proteína níveis de expressão de P-glicoproteína kinaseC-α e foram determinados por imunohistoquímica e western blot.

Resultados

Pseudolaric ácido B suprimiu significativamente o crescimento do tumor induzida por SGC7901 células e células SGC7901 /ADR. A combinação de ácido B pseudolaric e adriamicina a quimioterapia tradicional droga exibiu efeitos inibidores mais potentes sobre o crescimento de cancro gástrico in vivo do que o tratamento quer com ácido B pseudolaric ou adriamicina sozinha. níveis de ciclo-oxigenase-2 a expressão da proteína, a proteína kinaseC-α e glicoproteína-P foram inibidos pelo ácido pseudolaric sozinho ou em combinação com adriamicina em xenoenxertos de células SGC7901 /ADR B.

Conclusão

ácido Pseudolaric B tem um efeito inibidor significativo e um efeito inibitório aditivo em combinação com adriamicina sobre o crescimento do cancro gástrico, in vivo, o que inverte a resistência a múltiplos fármacos de neoplasia gástrica à quimioterapia por regulação negativa da Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 via de sinalização

Citation:. Sun Q, Li Y (2014) O Efeito Inibidor de Pseudolaric ácido B sobre Câncer gástrico e multirresistência via Cox-2 /PKC-α /P-gp caminho. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10.1371 /journal.pone.0107830

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston & Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2014; Aceito: 20 de agosto de 2014; Publicação: 24 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sun, Li. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Science Foundation Programa de Ciência Municipal Shenyang e Bureau Tecnologia (1091136-9-02). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns do mundo [1], e quimioterapia é uma importante estratégia contra câncer gástrico [2]. Uma vez que vários fármacos quimioterapêuticos de classes diferentes são usados ​​para tratar o cancro gástrico, a sensibilidade de drogas anticancro para o cancro gástrico diminui gradualmente, e resistência a muitos fármacos diferentes com diferentes estruturas químicas e diferentes mecanismos de acção pode ocorrer. Este tipo de resistência é chamado resistência a múltiplas drogas (MDR) e diminui significativamente a eficiência da terapia de cancro gástrico. MDR está se tornando um grande problema para o tratamento do câncer de sucesso [3]. Foi descoberto que a razão principal para MDR no cancro é a sobre-expressão de P-glicoproteína (P-gp), um produto do gene MDR1 humano. P-gp é uma bomba de efluxo dependentes de ATP, que pode diminuir a acumulação de drogas em células de cancro. Propõe-se que a P-gp, um biomarcador bem aceite de MDR, também deve ser considerado como um alvo molecular no cancro resistente a múltiplas drogas [4]. Estudos recentes têm demonstrado que em células de cancro com MDR, os níveis de expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e uma isoforma de proteína kinaseC (PKC-α) são ambos regulados positivamente, e a sua inibição pode inverter neoplásica MDR [5] - [10].

ácido Pseudolaric B (PAB, Figura 1), um ácido diterpeno isolado da raiz e tronco casca da árvore pseudolarix kaempferi
Gordon (Pinaceae), é usado em medicina tradicional chinesa para o seu amplo espectro de características biológicas, tais como efeitos anti-fúngicos e efeitos anti-fertilidade. Além disso, os seus efeitos anti-angiogénicos também têm sido gradualmente reconhecido nos últimos anos [11], [12]. Estudos recentes têm demonstrado que PAB induz a inibição do crescimento, a paragem do ciclo celular e apoptose. Além disso, PAB inverte a multirresistência de células de câncer [13], [14]. PAB suprime o crescimento da linha celular neoplásica AGS gástrica e induz a sua apoptose [15]. Nossas pesquisas anteriores demonstraram que PAB também tem um efeito inibitório sobre as células dramática SGC7901 cancro gástrico humano in vitro [16]. No entanto, estudos in vitro do efeito anti-cancerígeno de PAB são raros, e nem a eficácia in vivo deste novo composto à base de plantas contra tumores nem o seu mecanismo molecular preciso contra MDR foi completamente investigada.

O objectivo da presente estudo é avaliar o efeito anti-neoplásico de PAB in vivo, incluindo a reversão da MDR, utilizando um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus e explorar se mecanismo molecular subjacente de PAB é relacionada com a inibição da MDR através da /PKC-α Cox-2 /P-gp via.

Materiais e Métodos

Materiais

RPMI-1640 e meio de cultura de soro fetal bovino (FBS) para cultura de células foram adquiridos a partir de Gibco BRL, Gaithersburg , MD, EUA. anti-COX-2 monoclonal de anticorpo de coelho, rato anti-PKC-alfa e de murganho de anticorpos monoclonais anti-P-gp foram adquiridos a partir de Santa Cruz Corporation, CA, EUA. anticorpos secundários contra a anticorpos de coelho e de ratinho, estreptavidina-peroxidase (SP) kits, e 3,3'-diaminobenzidina (DAB) foram obtidos a partir de Pequim Zhongshan Biotecnologia, China. kits de ensaio da proteína BCA e SDS-PAGE kits de preparação de gel foram obtidas do Instituto de Biotecnologia Beyotime, Xangai, China. PAB foi comprado pelo Instituto Liaoning de Controle de Drogas, China No. 201003 (pureza: > 98%). A adriamicina (ADR) foi obtido a partir de Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China No. 120906. Tween80 e polietileno-glicol foram adquiridos da Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA.

cultura celular

células adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano foram cultivadas no laboratório central do Shengjing Hospital Filiado à Universidade médica da China [16], e as células SGC7901 /ADR resistentes à adriamicina foram dotados de Instituto de Doenças digestivas em Xijing Hospital Filiado à Quarta Universidade médica Militar [17]. células de adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano e células SGC7901 /ADR resistentes à adriamicina foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% FBS e antibióticos (penicilina 100 U /ml e estreptomicina) com 5% de CO _{2 numa incubadora humidificada a 37 ° C. ADR (1 ug /ml) foi adicionado ao meio de cultura de células SGC7901 /ADR para ajudar a manter a sua MDR. As células na fase de crescimento logarítmico foram centrifugadas e diluída com meio RPMI-1640 para preparar suspensões de célula única com uma concentração de 2,5 × 10 ^{6 /ml para a semeadura.}}

O estabelecimento de um modelo de xenoenxerto de murganhos glabros

O in vivo do efeito antitumoral de PAB foi examinada num modelo de xenoenxerto de murinos. Para o modelo, macho 4-6 semanas de idade e imunodeficientes fêmea BALB /c (nu /nu) ratos, pesando 18-22 g, foram adquiridos a partir de Pequim HFK Bioscience Co., Ltd. (China) e mantidos em instalações acreditados sob condições padrão para roedores (grau SPF) no Departamento de Ciência animal Laboratory. Cinquenta ratos foram seleccionados e aleatoriamente divididos em dois grupos (25 por grupo). Um total de 25 ratinhos foram injectados subcutaneamente com 2,5 × 10 ^{6 /ml SGC7901 células em 0,2 ml de meio RPMI-1640 para a axila esquerda, e os outros 25 ratinhos foram injectados com células SGC7901 /ADR na região axilar direita sob condições livres de germes.}

grupos experimentais e medicação

Sete dias após o implante celular, os tumores se tornaram palpáveis ​​(aproximadamente 3 mm x 3 mm de diâmetro) e, em seguida, os dois grupos injectados com dois tipos diferentes de células foram aleatoriamente divididos em cinco subgrupos (5 ratos por grupo): solução salina normal (NS) do grupo controle, grupo controle TWEEN, grupo ADR, grupo PAB, e PAB + grupo ADR. Para os grupos de PAB, Pab (25 mg /kg /d em 0,1 mL) dissolvido numa solução aquosa de polietileno glicol 6%, 3% de etanol, e 1% de Tween 80 foi administrada por via intraperitoneal (i.p.) diariamente durante 20 dias [13]. Um volume idêntico de solução aquosa ou NS foi injetado no grupo grupo controle TWEEN ou controlo NS, respectivamente. Para o grupo de ADR, ADR (1,25 mg /kg em 0,1 ml i.p.) diluído em solução fisiológica foi administrada por dia durante 20 dias [18]. ratinhos portadores de tumor foram administrados quer por via i.p. Pab (25 mg /kg /d) e ADR (1,25 mg /kg /dia) para o mesmo período no grupo PAB + ADR. Após o tratamento, os ratinhos de cada grupo foram sacrificados, e amostras de tumor de regiões axilares bilaterais foram pesados ​​e ressecado para imuno-histoquímica e análise de Western blot. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Shengjing Hospital Filiado à China Medical University (número de autorização: 2013PS144K). Os ratos foram sacrificados sob anestesia 10% de hidrato de cloral, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Medição e cálculo do volume do tumor e peso

O peso corporal foi monitorado a cada dia, e dois diâmetros perpendiculares (comprimento e largura em milímetros) de tumores foram medidos a cada dois dias com compassos de calibre ao longo do período de tratamento. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando medições bidimensionais e calculada como se segue: volume do tumor (mm ^{3) = comprimento (mm) x largura 2 (mm) /2. O volume relativo do tumor (RTV) foi calculada como se segue: RTV = (volume médio de tumor durante o tratamento) /(volume médio de tumor no início da terapia). Os efeitos antitumorais de PAB e /ou ADR foram estimados com a taxa média de inibição (IR) do crescimento do tumor utilizando a seguinte equação: IV (%) = [(1-significativo RTV do grupo tratado com fármaco /média de RTV do grupo de controlo NS ) x 100] [19]. O peso corporal relativa de ratinhos foi calculada usando o W _{t /W 0 índice, em que W T era o peso do corpo no dia da medição, e W 0 é o peso corporal em o primeiro dia de tratamento. A alteração no peso corporal nos dias 1 e 20, que representam o início e final do experimento, respectivamente, foi utilizado para avaliar e analisar os efeitos das drogas sobre o peso do corpo [20].}}

coloração imuno-histoquímica para a expressão de Cox-2, PKC-alfa e P-gp

espécimes de tumor foram fixadas com paraformaldeído, processado rotineiramente pela inclusão em parafina, e, em seguida, cortada em secções de 4 | im. Após coloração com hematoxilina e eosina (HE), células de os xenoenxertos de cancro gástrico foram observados sob um microscópio de luz. Os níveis de expressão de Cox-2, PKC-α e P-gp em células tumorais recolhidas foram determinados usando o método SP. Em resumo, depois de ser desparafinados e re-hidratadas, as lâminas foram incubadas em 0,3% H _{2 solução 2O e secou-se num forno de microondas em tampão de ácido cítrico, durante 15 min para recuperar antigénios. As fatias foram bloqueadas com soro de cabra normal durante 30 minutos a 37 ° C e sondadas com um anticorpo monoclonal de coelho para Cox-2 e anticorpos monoclonais de ratinho para a PKC-α e P-gp a 4 ° C durante a noite (todos os anticorpos foram diluídos a 1 :300). Biotinilado anti-IgG de coelho e anti-IgG de rato e incubou-se a 37 ° C durante 30 min antes de enzima conjugada com HRP-estreptavidina foi adicionado. Além disso, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) foi utilizado como o cromogénio. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas em álcool, e montado em bálsamo neutro. Controles foram preparados utilizando anticorpos secundários apenas. Foram selecionados cinco campos de cada secção de cada rato em cada grupo para a recolha de imagem. Os resultados foram analisados ​​e comparados estatisticamente usando o software NIS-Elements Br 3.0, e a densidade óptica média foi obtida para quantificar os níveis de Cox-2, PKC-α e P-gp.}

Western blot de Cox expressão -2, PKC-α e P-gp em xenoenxertos de ratinhos nus

Um total de 100 mg de tecidos tumorais fresco congelado de pelo menos três ratos de cada grupo foram pesados ​​e suplementado com ensaio de rádio imunoprecipitação (RIPA) tampão de lise [contendo 100 ug /ml de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF)]. Após pulverizado usando uma tesoura, extractos foram homogeneizados utilizando ultra-sons. Após centrifugação a 14000 rpm a 4 ° C durante 30 min, uma amostra de sobrenadante foi congelado a -80 ° C durante western blotting. A concentração de proteínas dos extractos foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA). Um total de 100 ug de proteína por ratinho sob condições desnaturantes (100 ° C, 5 min) foi submetido a electroforese através de dodecilo de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre gel de separação 8% e electrotransferidas para membranas de PVDF utilizando um sistema de transferência de molhado em 100 V (Cox-2, PKC-α, β-actina durante 100 min, e P-gp durante 3 h). Após bloqueio com 5% de leite em pó magro em TBST durante 1 × 90 min (solução salina contendo 0,1% de Tween 20 com Tris), as membranas foram então incubadas com o anticorpo primário [anticorpo de coelho monoclonal para Cox-2 (1:400) ou mouse Os anticorpos monoclonais para a PKC-α (1:200) e P-gp (1:200), com β-actina como um controlo interno para a carga de proteína] durante a noite a 4 ° C. A ligação do anticorpo foi visualizada utilizando um anticorpo acoplado a peroxidase de cabra anti-coelho secundário (1:2000) e anticorpo anti-ratinho de cabra (1:2000) durante 1,5 h à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram visualizados por quimioluminescência aumentada reagente (ECL). Os resultados foram analisados ​​usando o software Image J..

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como os valores médios ± desvio padrão e múltiplas comparações entre quaisquer dois dos grupos tratados foram avaliados por um- way ANOVA, utilizando SNK e métodos de LSD com SPSS 17.0 software. A relação entre as alterações de peso corporal e o volume tumoral foram analisados ​​por análise de correlação de Pearson. valores de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Efeito inibitório do PAB sobre o crescimento do câncer humano
gástrica

Os tumores em todos os grupos tratados formado prontamente após a implantação de uma única célula suspensões, e a taxa de formação foi de 100%. Quando os xenoenxertos tornou-se evidente, não houve diferenças significativas no volume médio dos xenoenxertos entre os diferentes grupos (Tabela 1), e os volumes dos tumores foram monitorizadas a vários pontos de tempo em todos os grupos. As curvas do crescimento do tumor das duas linhas de células foram representados graficamente (Figura 2A, 2B). Como mostrado na Tabela 1, para os grupos tratados com células SGC7901, não se observou qualquer diferença significativa entre o grupo PAB e grupo ADR nos volumes relativos médios dos xenoenxertos (p > 0,05), e o IR foi de 56,4% e 59,0%, respectivamente. A adição de ADR a PAB resultou em maior actividade anti-tumoral do que a de PAB sozinho ou ADR sozinho (p < 0,05) com um IV de 88,1%. O efeito inibidor do grupo PAB foi mais forte em comparação com o do grupo de ADR sobre os xenoenxertos de células SGC7901 /ADR, e os valores de IR foram 64,1% e 21,9%, respectivamente (p < 0,05). a inibição do crescimento do tumor foi mais evidente nos ratos tratados com PAB combinado com ADR, com um IV de 85,8%. As conclusões do peso do tumor em diferentes grupos apoiados ainda mais nossos resultados referentes ao volume de xenotransplantes ratos. Figura 2C e 2D mostra as alterações do peso corporal relativo dos murganhos em dez grupos. O peso corporal foi semelhante entre os grupos de controlo e grupos tratados com PAB. No entanto, o peso corporal diminuiu nos grupos tratados com combinação de ADR e grupos, e a diminuição dos grupos ADR foi mais evidente (P < 0,05). Além disso, a Figura 3 apresenta uma comparação directa dos tamanhos dos tumores de células e células SGC7901 SGC7901 /ADR nos diferentes grupos. A relação entre as alterações de peso corporal e o volume tumoral não foram significativas (p > 0,05). As dosagens testadas foram bem tolerados pelos ratinhos, e sem letalidade animal foi observado durante a experiência.

coloração imuno-histoquímica para a expressão de Cox-2, PKC-α e P-gp

Todos os tumores em cada grupo, através de coloração imuno-histoquímica, exibido expressão positiva das proteínas de Cox-2, PKC-alfa e P-gp. Cox-2 e de expressão de PKC-α foi definido como positivo se a região corada das células de tumor foi no citoplasma, e a coloração da P-gp foi considerada positiva se a fluorescência foi observada na membrana e no citoplasma. As proteínas foram coradas amarelo ou castanho sob observação ao microscópio óptico (Figura 4). Para a linha de células SGC7901 /ADR, a coloração destas proteínas nos grupos de controlo era mais forte do que nos outros grupos (p < 0,05). PAB tratamento reduziu a coloração intracelular de Cox-2, PKC-α e P-gp em comparação com o grupo tratado com ADR (p < 0,05). Após tratamento e PAB ADR, a coloração intracelular destas proteínas foi esparsa e mais fraco em comparação com o dos outros grupos. Para os xenoenxertos de os dois grupos de controlo NS, a coloração da P-gp em células SGC7901 foi significativamente menor do que a do SGC7901 /ADR células (p < 0,05). A análise da intensidade de coloração da COX-2, PKC-α e expressão da P-gp revelaram os mesmos resultados (Tabela 2).

Efeito do PAB sobre a COX-2, PKC-α, e P-gp expressão em ratinhos xenoenxertos

Para elucidar o mecanismo molecular envolvido nos efeitos de reversão de PAB no SGC7901 /ADR xenoenxertos in vivo, a expressão de Cox-2, PKC-α, e P-gp em tumores provenientes de diferentes os grupos tratados com reagentes foram determinados por análise de western blot. Como mostrado na Figura 5, para o grupo de controlo NS, os níveis de expressão de Cox-2, PKC-α, e P-gp em xenoenxertos de células SGC7901 foram mais baixos em comparação do que nos tumores de células SGC7901 /ADR (p < 0,05) . Para os tumores do SGC7901 /células de ADR, os níveis das três proteínas de interesse no grupo de grupo de controlo e o controlo de TWEEN NS de expressão foram significativamente mais elevados em comparação com os outros grupos (p < 0,05), e não houve diferença significativa entre o dois grupos (P > 0,05). Os níveis de Cox-2, PKC-α, e P-gp no grupo tratado com PAB expressão foram significativamente mais baixos comparados com os do grupo tratado com ADR (p < 0,05). A expressão de β-actina foi utilizado como um controlo interno, e os níveis de Cox-2, PKC-α, e P-gp expressão foram diminuiu sequencialmente entre os grupos de controlo, grupo ADR, grupo PAB e grupo PAB + ADR (p < 0,05)

Discussão

PAB é um dos principais componentes biologicamente activos da casca da raiz da planta medicinal pseudolarix kaempferi
e exibe considerável citotoxicidade em direção a várias células cancerígenas. linhas. Os estudos in vitro também demonstraram que inverte a MDR de carcinoma por inibir a sobre-expressão de P-gp, sem efeitos colaterais óbvios [13], [15], [20], [21]. Também tem sido demonstrado que PAB tem um efeito anti-tumoral em ratinhos modelos de xenoenxerto de cancro humano do cólon e o carcinoma hepatocelular [13], [20], e não há efeitos secundários conhecidos de PAB em animais têm sido relatados. O nosso estudo anterior demonstrou que PAB tem um efeito inibidor potente na linha celular SGC7901 in vitro e induz a apoptose de células cancerosas gástricas através da via da caspase [16]. Nosso presente estudo in vivo fornece mais provas de que PAB é protetor contra tumores gástricos em modelos de xenotransplante de murino usando SGC7901 e células SGC7901 /ADR. As nossas experiências preliminares demonstraram que PAB a 25 mg /kg, não só inibe o crescimento do cancro gástrico, mas também é bem tolerada pelos ratinhos. Além disso, incluiu-se o grupo de controlo de interpolação para excluir a influência da solução aquosa que foi utilizado para dissolver PAB em tumores [13]. Para as células sensíveis, os efeitos anticancerígenos da PAB não produziu diferenças significativas em comparação com o ADR, um medicamento de quimioterapia tradicional. Além disso, PAB é um composto biologicamente activo que exerce o seu efeito contra tumores invertendo linha celular SGC7901 /ADR, visando a via de sinalização activada pela sobre-expressão da P-gp in vivo.

P-gp é uma membrana de 170 kDa proteína que actua como uma bomba de efluxo de droga, o que resulta em um defeito contínua na acumulação intracelular de drogas [22]. O fenótipo de resistência a múltiplas drogas é a principal causa de falha da quimioterapia do tumor e é, principalmente, o produto da sobre-expressão da P-gp na maioria dos tipos de cancro, incluindo tumores gástricos [23]. Além disso, a inibição desta via pode ser um modo de reverter a MDR de células gástricas cancerosas [3], [24].

de Cox-2, uma enzima induzível que catalisa a conversão do ácido araquidónico em prostanóides ( PG) e participa de eventos fisiológicos e patológicos vários, é induzida por vários estímulos inflamatórios e mitogênicos [25]. A forte associação entre MDR e a sobre-expressão da COX-2 tem sido relatada em muitos tipos diferentes de tumores. Estes resultados anteriores sugerem que Cox-2 modula a expressão e a actividade de P-gp e está envolvido no desenvolvimento do fenótipo MDR [26] - [28]. Além disso, a evidência acumulada demonstrou que inibidores COX-2 são capazes de sensibilizar células de cancro aos efeitos anti-proliferativos das drogas quimioterapêuticas através da alteração da actividade da proteína de cassete de ligação de ATP. Inibidores de Cox-2 pode mesmo reverter MDR, bloqueando o aumento de Cox-2-mediada na expressão e actividade no cancro da MDR1, tanto in vitro como in vivo [6], [7], [29]. Por conseguinte, os autores sugerem que Cox-2 pode regular a expressão de P-gp em tecidos de tumor e que a inibição desta via é de grande importância para inverter a resistência de cancro a drogas quimioterapêuticas.

Verificou-se que para o SGC7901 /tumores de células de ADR, os níveis de expressão de Cox-2 e P-gp no grupo de controlo NS eram evidentemente maior do que aqueles para os xenotransplantes de SGC7901 células. Após a injecção de PAB, foi observada uma diminuição óbvia nestes níveis de expressão. No entanto, ADR foi menos eficaz para a supressão dos níveis do SGC7901 /xenoenxertos de células de ADR, e quando combinado com PAB, foi observado um nível mais baixo de proteínas de Cox-2 e de expressão de P-gp. Assim, foi proposto que a modulação da COX-2 por PAB poderia diminuir a expressão e a actividade de P-gp, inibem o crescimento e induzem a apoptose, para além de actuar cooperativamente com ADR na supressão de tumores resistentes aos medicamentos e até mesmo a reversão de o fenótipo MDR do cancro gástrico.

PKC é uma cinase de serina /treonina envolvida na transdução de sinal necessários para a proliferação e diferenciação celular [30]. Das isoformas de PKC, a sobre-expressão e aumento da atividade da PKC-α estão mais estreitamente associados com a regulação do fenótipo MDR no cancro gástrico humano [31]. Os resultados aqui apresentados suportam a noção de que a PKC-α fosforila P-gp, modula a função de efluxo de P-gp, e, finalmente, leva à resistência à droga [32]. A inibição de PKC-α com um inibidor específico ou derrubar PKC-α com ARNsi conduz a expressão MDR1 reduzida, aumento da toxicidade de fármacos anticancerígenos, e inverteu MDR [8] - [10]. Portanto, especula-se que um sistema de transdução de sinal de PKC-α pode desempenhar um papel na modulação da expressão de MDR1 em cancro gástrico.

Sob circunstâncias normais, PKC é inactivo nas células, e a sua activação a montante está relacionada com a activação de PGE. COX-2 é acoplado a prostaglandina associada à membrana E2 sintase (mPGES-1), e síntese da PGE mediada por estas proteínas aumenta e activa a via da PKC-α a jusante [33]. Tem sido demonstrado que a inibição selectiva de Cox-2 por inibidores específicos ou de ARNip tem um efeito terapêutico na inibição da expressão de PKC-α e P-gp, e ao mesmo tempo, ao mesmo tempo, reverter MDR [26], [34]. Um estudo demonstrou que a PGE2 medeia a indução da expressão de MDR1 pela via da PKC [35]. Os resultados dos nossos experimentos demonstraram que PAB pode inibir a expressão de PKC-α de xenoenxertos da linha celular SGC7901 /ADR, cujo efeito foi mais forte do que a de ADR. Além disso, quando PAB foi combinado com ADR, a eficácia da inibição de expressão de PKC-α foi ainda mais forte. A tendência de variação da expressão de PKC-α é consistente com a de COX-2 e P-gp em diferentes grupos tratados com reagentes de SGC7901 tumores resistentes a drogas /ADR. Demonstrou-se que induz a paragem do crescimento PAB e apoptose através da inibição da via da COX-2 em células cancerosas [20], [21]. Nós supomos que PAB inibe a expressão de Cox-2 em xenoenxertos de células /ADR SGC7901 e que o acoplamento entre Cox-2 e mPGES-1 reduz a síntese da PGE, o que reduz a activação de PKC-α jusante. À medida que a fosforilação de P-gp é inibida, mais drogas acumulam-se nas células de cancro, a toxicidade do ADR é reforçada e MDR é invertida. Estes resultados fornecem uma visão sobre uma nova estratégia que envolva a utilização de PAB para inibir a MDR de cancros gástricos humanos.

Um foco da nossa experiência é o efeito inibitório do ácido B pseudolaric em xenoenxertos subcutâneos de adenocarcinoma gástrico humano e a comparação de efeitos anti-tumorais de drogas entre os diferentes grupos de tratamento. Além disso, a característica de células e células SGC7901 SGC7901 /ADR são diferentes. Através de nossos dois pré-experimento e uma experiência formal, todos nós encontramos o volume do tumor de células SGC7901 /ADR não era maior do que a SGC7901 células. Nós supomos o volume do tumor pode ser associado com a contagem de células, tempo de crescimento, característica de células e outros tipos de factores. Portanto, não têm comparado o volume do tumor entre os xenoenxertos de células SGC7901 e xenoenxertos de células SGC7901 /ADR. Além disso, especula-se que a alteração de peso corporal de ratinhos pode ser principalmente relacionadas com a toxicidade da droga, e tem relação não significativa para o volume do tumor na nossa experiência.

O outro foco da nossa experiência é a base subjacente mecanismos moleculares envolvidos na resistência a múltiplos fármacos. Assim, temos apenas concebido grupo controle NS de xenoenxertos de células SGC7901 ao contraste e confirmar as expressões dos três tipos de proteínas de xenoenxertos de células SGC7901 /ADR são, de facto significativamente maior do que a partir de xenoenxertos de células SGC7901. Além disso, uma vez que a resposta de células SGC7901 para drogas antineoplásicas é bastante mais sensíveis do que as células SGC7901 /ADR em ambas as experiências básicos e clínicos, a forma de melhorar a sensibilidade das células para resistência múltipla a fármacos anticancerígenos drogas é o foco de pesquisa. Portanto, não compararam as expressões de Cox-2, PKC-α e P-gp para os tumores de SGC7901 e os vários tratamentos deste grupo, exceto para o grupo controle NS por western blot e coloração imuno-histoquímica.

o nosso estudo descobriu que a ervas diterpenóide PAB não só suprimiu significativamente células SGC7901 cancro gástrico in vivo, mas também exibiu efeitos inibidores evidentes para com os tumores de células SGC7901 /ADR resistente a drogas. Além disso, a combinação de PAB com ADR poderiam inibir o crescimento do cancro gástrico e o desenvolvimento de xenoenxertos em ratinhos nus. Vale a pena mencionar que, como um tipo de medicina tradicional chinesa, o efeito de PAB no peso corporal de ratinhos nus foi muito menor do que a de ADR na nossa experiência, o que é uma vantagem evidente que faz PAB um medicamento mais seguro e tolerável para terapia do cancro. PAB pode não só ser um novo medicamento eficaz para a inibição do crescimento de cancro gástrico e inverter a sua MDR, mas também pode ser utilizado como um excelente adjuvante com agentes quimioterapêuticos tradicionais e terapia cirúrgica seguintes maior desenvolvimento e pesquisa.

no presente estudo, nós examinamos, pela primeira vez, o efeito inibitório do PAB contra o cancro gástrico humano e o seu efeito na reversão MDR in vivo por meio de um modelo de xenoenxerto de murganhos nus. Determinou-se que a sua inibição de MDR foi mediada através da via /P-gp Cox-2 /PKC-α, que fornece uma base teórica importante sobre os mecanismos moleculares da terapia do cancro gástrico. No entanto, nós não estudamos o mecanismo de MDR no que diz respeito à expressão do gene e regulação. Como os mecanismos moleculares de reverter MDR são extraordinariamente complicadas e tipos múltiplos de proteínas, genes e factores podem estar envolvidos, o loop que propusemos pode ser apenas uma parte do mecanismo para a inversão de MDR. Mais aprofundada e mecanismos de regulação de concreto precisa ser elucidado em estudos futuros.

Em conclusão, PAB tem um efeito inibidor significativo sobre câncer gástrico in vivo e pode reverter o MDR de câncer gástrico à quimioterapia. O mecanismo contra MDR é mediada, pelo menos parcialmente através da via /P-gp Cox-2 /PKC-α. Nosso estudo fornece amplas perspectivas para futuras investigações de PAB na terapia do câncer gástrico.

Informações de Apoio
Checklist S1.
CHEGAR Diretrizes Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0107830.s001
(DOC)

• PLOS ONE: quimioterapia ou terapia-alvo como segunda linha de tratamento do cancro gástrico avançado. Uma revisão sistemática e meta-análise de estudos publicados
• PLOS ONE: Células intratumoral IL-17-positivo de mastro são a fonte principal da IL-17 que é preditiva de sobrevida em pacientes com câncer gástrico