Ploche ONE: inhibičný účinok Pseudolaric Acid B na rakoviny žalúdka a multidrug odporu cez Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway

abstraktné

Cieľ

Pre zistenie inhibičnej účinok kyseliny B pseudolaric o podkožných xenoimplantátů ľudského adenokarcinómu žalúdka a podkladové molekulárnych mechanizmov zapojených do jeho mnohopočetné liekovej rezistencie.

Metódy

ľudská žalúdočné adenokarcinóm SGC7901 buniek a rezistentné SGC7901 buniek /ADR boli injekciou do holých myší zaviesť podkožný modelu xenotransplantátov. Účinky pseudolaric kyseliny B alebo bez adriamycín liečby sa porovnali na základe stanovenia veľkosti a hmotnosti zhubného nádoru. Cyklooxygenáza-2, proteín kinaseC-α a P-glykoproteínu expresné hladiny boli stanovené pomocou imunohistochémia a western blot.

Výsledky

Pseudolaric kyselina B významne potlačil rast nádoru indukovaného SGC7901 bunkách a bunky SGC7901 /ADR. Kombinácia kyseliny B pseudolaric a tradičné chemoterapiou adriamycín vykazovali silnejšie inhibičné účinky na rast rakoviny žalúdka in vivo, ako liečba buď pseudolaric kyseliny B alebo Adriamycínom samotným. Hladiny expresie proteínu cyklooxygenázy-2, proteín kinaseC-α a P-glykoproteínu bola inhibovaná samotnou alebo v kombinácii s Adriamycínom v bunkových xenoimplantátů SGC7901 /ADR kyseliny B pseudolaric.

Záver

Pseudolaric kyselina B má významný inhibičný účinok a aditívny inhibičný účinok v kombinácii s Adriamycínom na rast rakoviny žalúdka in vivo, ktorý obráti odpor liečivám žalúdka nádoru k chemoterapii drog downregulating Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 signálnej dráhy

Citácia :. Sun Q, Li Y (2014), inhibičný účinok Pseudolaric kyseliny B na rakoviny žalúdka a multidrug odporu cez COX-2 /PKC-α /P-gp dráhy. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10,1371 /journal.pone.0107830

Editor: Soumitra Pal, Detská nemocnica Boston & Harvard Medical School, Spojené štáty |

prijatá: May 15, 2014; Prijaté: 20 augusta 2014; Uverejnené: 24.Septembra 2014

Copyright: © 2014 Sun, Li. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená Grantovou agentúrou programu Shenyang Mestského vedu a technológie Bureau (1091136-9-02). Financovateľom nemal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších nádorových ochorení na svete [1], a chemoterapia je dôležitá stratégia proti karcinómu žalúdka [2]. Vzhľadom k tomu, viac chemoterapeutickej lieky rôznych tried sa používajú na liečbu karcinómu žalúdka, citlivosť protirakovinových liekov na rakovinu žalúdka sa postupne znižuje, a môže dôjsť odolnosť proti mnohým rôznych liekov s rôznymi chemickými štruktúrami a rôzne mechanizmy účinku. Tento typ odolnosti sa nazýva multidrug odporu (MDR) a výrazne znižuje účinnosť liečby o rakovine žalúdka. MDR sa stáva veľkým problémom pre úspešnú liečbu rakoviny [3]. Bolo zistené, že hlavným dôvodom MDR rakoviny je nadmerná expresia P-glykoproteínu (P-gp), produkt z ľudského génu MDR1. P-gp je ATP-dependentný efluxnej pumpy, ktoré môžu znižovať akumuláciu lieku v rakovinových bunkách. Navrhuje sa, že P-gp, dobre prijímané biomarker MDR, by mala byť tiež považovaná za molekulárneho ciele pri karcinóme multirezistentnej [4]. Nedávne štúdie preukázali, že v nádorových bunkách s MDR, hladiny expresie cyklooxygenázy-2 (COX-2) a izoformy proteínu kinaseC (PKC-alfa), sú obaja up-regulované, a ich inhibícia môže zvrátiť neoplastické MDR [5] - [10].

Pseudolaric kyseliny B (PAB, Obrázok 1), čo je diterpénov kyseliny izolovaná z koreňov a trupu kôry Pseudolarix Kaempfer
Gordon (Pinaceae), je používaný v tradičná čínska medicína pre jeho široké spektrum biologických funkcií, napríklad anti-plesňové účinky a účinky proti plodnosti. Navyše, jeho antiangiogenetické účinky boli tiež postupne vykázaný v posledných rokoch [11], [12]. Nedávne štúdie preukázali, že PAB vyvoláva inhibíciu rastu, zástavu bunkového cyklu a apoptózu. Okrem toho PAB obráti multiléčivové rezistencie rakovinových buniek [13], [14]. PAB potláča rast žalúdočné neoplastických AGS bunkové línie a indukuje apoptózu jej [15]. Naše predchádzajúce výskum preukázal, že má tiež PAB dramatický inhibičný účinok na ľudské žalúdočné rakovina SGC7901 bunkách in vitro [16]. Avšak, štúdie in vitro protinádorové pôsobenie PAB sú zriedkavé, a ani in vivo účinnosť tejto novej bylinné zlúčeniny proti nádorom, ani jeho presný molekulárnej mechanizmus proti MDR bol úplne preskúmaný.

Cieľom prítomného štúdie je vyhodnotiť anti-neoplastickou účinok PAB in vivo, vrátane zvrátenie MDR, s použitím modelu s xenoštěpem u nahých myší a preskúmať, či základné molekulárnej mechanizmus PAB je súvisí s inhibíciu MDR cez Cox-2 /PKC-alfa /P-gp dráha.

materiály a metódy

materiály

RPMI-1640 kultivačné médium a fetálne hovädzie sérum (FBS) pre bunkové kultúry boli získané od Gibco BRL, Gaithersburg , MD, USA. Králičie anti-COX-2 monoklonálna protilátka, myší anti-PKC-alfa a myší monoklonálne protilátky anti-P-gp boli zakúpené od Santa Cruz Corporation, CA, USA. Sekundárne protilátky proti králičej a myšou protilátky, streptavidin-peroxidáza (SP) výstroja a 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) boli získané z Pekingu Zhongshan Biotechnology, Čína. BCA proteín výstroja a SDS-PAGE na prípravu súpravy gélu boli získané z Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Čína. PAB bol zakúpený od Liao-ning ústavu pre kontrolu liečiv, China číslo 201003 (čistota: > 98%). Adriamycín (ADR) sa získa z Zhejiang HISUN Pharmaceutical Co., Ltd., Čína č 120906. Tween80 a polyetylénglykol boli zakúpené od firmy Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA.

Bunková kultúra

ľudská adenokarcinóm SGC7901 bunky žalúdočnej boli kultivované v centrálnej laboratóriu Shengjing nemocnice pridružená k Číne lekárskej univerzity [16], a adriamycín rezistentné SGC7901 /buniek ADR boli nadaný od inštitútu choroby zažívacieho ústrojenstva v Xijing nemocnice pridružený k štvrtému Vojenskej lekárskej univerzity [17]. Ľudské žalúdočné adenokarcinóm SGC7901 bunky a SGC7901 bunky adriamycín rezistentné /ADR boli kultivované v médiu RPMI-1640 doplnenom 10% FBS a antibiotikami (100 U /ml penicilínu a streptomycínu) s 5% CO _{2 vlhké s inkubátora pri 37 ° C ° C. ADR (1 ug /ml), sa pridá k SGC7901 /ADR bunkového kultivačného média na udržanie ich MDR. Bunky v logaritmickej fáze rastu boli centrifugovány a zriedi RPMI-1640 pre prípravu jednobunkové suspenzie s koncentráciou 2,5 x 10 ^{6 /ml pre siatie.}}

Vytvorenie modelu xenoimplantátu nahých myší

in vivo protinádorového účinku PAB bola skúmaná v myšiam modeli s xenoštěpem. Pre model, 4-6 týždňov staré mužskej a ženskej imunodeficientných Balb /c (nu /nu) myší, s hmotnosťou 18 až 22 g, boli zakúpené z Pekingu HFK Bioscience Co, Ltd (Čína) a udržiavané v akreditovaných zariadeniach za štandardných podmienok pre hlodavce (SPF stupeň) v Oddelenie laboratórnej Animal Science. Päťdesiat myši boli vybrané a náhodne rozdelení do dvoch skupín (25 na skupinu). Celkom 25 myší boli subkutánne podali 2,5 x 10 ^{6 /ml SGC7901 buniek v 0,2 ml RPMI-1640 do ľavej axily a ďalších 25 myší boli injikované SGC7901 /buniek ADR do pravej podpažní oblasti v zárodočných bez podmienok.}

Experimentálne skupiny a lieky

Sedem dní po implantácii buniek, nádory hmatateľné stal (približne 3 mm x 3 mm v priemere), a potom, dve skupiny injekčne s dvoma rôznymi typmi buniek boli náhodne rozdelené do piatich podskupín (5 myší na skupinu): fyziologický roztok (NS) kontrolné skupiny, kontrolnej skupiny TWEEN, skupina ADR, skupiny PAB a PAB + skupiny ADR. Pre PAB skupiny, PAB (25 mg /kg /d do 0,1 ml) sa rozpustí vo vodnom roztoku 6% polyetylénglykolu, 3% etanolu a 1% Tween80 bola podávaná intraperitoneálne (i.p.) denne po dobu 20 dní [13]. Rovnakým objemom vodného roztoku alebo NS bol injikovaný v skupine kontrolná skupina TWEEN alebo riadenie NS, resp. Pre skupinu ADR, ADR (1,25 mg /kg v objeme 0,1 ml), zriedené v NS bola podávaná i.p. denne po dobu 20 dní [18]. myší s nádorom boli podávané ako PAB (25 mg /kg /d) a ADR (1,25 mg /kg /deň), i.p. za rovnaké obdobie v skupine CTB + ADR. Po ošetrení boli myši z každej skupiny boli usmrtené, a nádorové vzorky dvojstranných potných oblastí boli zvážené a resekcie pre imunohistochemické a western blot analýzy. Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami v Príručke pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat z National Institutes of Health. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách v Shengjing Nemocnica pridružená k Číne lekárskej univerzity (Povolenie číslo: 2013PS144K). Myši boli obetované pod 10% Chloralhydrát anestézie a boli vykonané všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia.

Meranie a výpočet objemu a hmotnosti každý deň

Telesná hmotnosť bola monitorovaná nádoru, a dve kolmé priemery (dĺžka a šírka v mm) nádorov boli merané raz za dva dni s strmeňmi po celú dobu liečby. Nádorové objemy boli odhadnuté pomocou dvojrozmerné merania a vypočíta nasledovne: Objem nádoru (mm ^{3) = dĺžka (mm) x šírka 2 (mm) /2. Relatívny objem nádoru (RTV) sa vypočíta nasledovne: RTV = (priemerný objem nádoru v priebehu liečby) /(stredný objem nádoru na začiatku liečby). Protinádorové účinky PAB a /alebo ADR boli stanovené s rýchlosťou priemerná inhibícia (IR) rastu nádoru za použitia tejto rovnice: IR (%) = [(1-stredná RTV skupiny ošetrených liečivom /priemerná RTV z kontrolnej skupiny NS ) × 100] [19]. Relatívna Telesná hmotnosť myší bola vypočítaná s použitím W _{t /W 0 index, kde W t bol telesnej hmotnosti v deň merania, a W 0 bola telesná hmotnosť pri prvý deň liečby. Zmena telesnej hmotnosti na deň 1 a 20, ktoré predstavujú začiatok a koniec experimentu, v danom poradí, bola použitá pre vyhodnotenie a analýzu účinkov liekov na telesnej hmotnosti [20].}}

Imunohistochemické farbenie expresie COX-2, PKC-alfa a P-gp

vzorky nádorov boli fixované paraformaldehydom, spracujú bežne vložením do parafínu a potom nakrájané na 4-um sekcií. Nasledujúce hematoxylínom a eosínu (HE) farbenie buniek nádorových xenografe žalúdka boli pozorované pod svetelným mikroskopom. Hladiny expresie COX-2, PKC-α a P-gp v zozbieraného nádorových buniek boli stanovené pomocou metódy SP. Krátko potom, čo bol odvoskované a rehydratované, rezy boli inkubované v 0,3% H _{2O 2 roztokom a sušia sa v mikrovlnnej rúre v pufri s kyselinou citrónovou počas 15 minút na získanie antigénov. Rezy boli blokované s normálnym kozím sére počas 30 minút pri teplote 37 ° C, a skúmal sa králičie monoklonálne protilátky proti COX-2 a myšiach monoklonálnych protilátok proti PKC-a a P-gp pri teplote 4 ° C cez noc (všetky protilátky boli nariedia na 1 : 300). Pridá sa biotinylizované anti-králičie IgG a anti-potkania IgG a inkubované pri 37 ° C počas 30 minút a potom bol pridaný enzým konjugovaný s HRP-streptavidín. Okrem toho, 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) bol použitý ako chromogénu. Sklíčka bola kontrastne hematoxylínom, dehydrované v alkohole, a upevnené na neutrálnej balzam. Kontroly boli pripravené iba pomocou sekundárnych protilátok. Päť pole každého úseku každej myši v každej skupine boli vybrané pre zber obrazu. Výsledky boli analyzované a porovnané štatisticky pomocou softvéru NIS-Elements 3.0 Br, a bola získaná priemerná hodnota optickej hustoty pre kvantifikáciu hladiny expresie COX-2, PKC-α a P-gp.}

Western blot Cox -2, PKC-α a P-gp v nahých myšiach xenografe

celkom 100 mg čerstvo zmrazených nádorových tkanivách najmenej z troch myší každej skupiny boli vážené a doplnené radio Imunoprecipitácia testu (RIPA) lyzačný pufer [obsahujúceho 100 ug /ml fenylmethansulfonylfluorid (PMSF)]. Po práškové použití nožníc, extrakty boli homogenizované pomocou ultrazvuku. Po odstredení pri 14000 otáčkach za minútu pri teplote 4 ° C počas 30 min, supernatant bol vzorku pri -80 ° C počas westernovým prenosom. Koncentrácia proteínu v extraktoch bola stanovená za použitia kyseliny bicinchoninic (BCA) Obsah proteínu kit. Celkom 100 ug proteínu na myš za denaturačných podmienok (100 ° C, 5 min) sa podrobí elektroforéze za použitia dodecylsulfát sodný, elektroforézou na polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE) v 8% separačného gélu a electrotransferred na PVDF membrány mokrú prenosového systému na 100 V (Cox-2, PKC-α, β-aktínu za 100 minút, a P-gp počas 3 hodín). Po blokovaní 5% netučného sušeného mlieka, 1 x TBST (Tris-pufrovaný soľný roztok obsahujúci 0,1% Tween 20) po dobu 90 minút, boli membrány inkubované s primárnou protilátkou [králičej monoklonálnej protilátky proti COX-2 (1: 400) alebo myši monoklonálne protilátky proti PKC-a (1: 200) a P-gp (1: 200), s beta-aktínu ako vnútorná kontrola pre nakladanie proteínu] cez noc pri teplote 4 ° C. Protilátka väzba bola vizualizované s použitím peroxidázy s sekundárne kozie anti-králičie protilátkou (1: 2000) a kozie anti-myšou protilátky (1: 2000) po dobu 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa membrány boli vizualizované zvýšenou chemiluminiscencie (ECL) činidlá. Výsledky boli analyzované pomocou obrázku J softvér.

Štatistická analýza

Všetky údaje sú uvedené ako priemerné hodnoty ± štandardná odchýlka, a mnohopočetné porovnanie medzi ktorýmikoľvek dvomi z liečených skupín boli hodnotené jedno- ANOVA s použitím SNK a metódy LSD so softvérom SPSS 17.0. Vzťah medzi zmenou telesnej hmotnosti a objemu nádoru boli analyzované pomocou korelačný analýzy Pearson. Hodnoty p menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné.

Výsledky

inhibičný účinok PAB na rast ľudského karcinómu žalúdka

nádorov u všetkých liečených skupinách po vytvorené ľahko implantácia jednobunkové suspenzie, a rýchlosť formácie bola 100%. Keď xenoimplantáty sa ukázalo, že neboli žiadne významné rozdiely v priemernej objeme xenografe medzi rôznymi skupinami (tabuľka 1), a objem nádoru bol monitorovaný v rôznych časových bodoch vo všetkých skupinách. Krivky rastu nádorov dvoch bunkových línií bola vynesená do grafu (obr 2A, 2B). Ako je uvedené v tabuľke 1, pre bunkové liečených skupín SGC7901, žiadny významný rozdiel bol pozorovaný medzi PAB skupinou a skupinou ADR v priemernej relatívnej objemy xenoimplantátů (p 0,05) a IR bola 56,4% a 59,0%, resp. Prídavok ADR pre PAB za následok vyššiu protinádorovú účinnosť ako u samotného PAB alebo ADR samotným (p menšie ako 0,05) s IR o 88,1%. Inhibičný účinok skupiny PAB je silnejší v porovnaní so situáciou skupiny ADR na xenoimplantátů buniek SGC7901 /ADR, a hodnoty IR boli 64,1% a 21,9%, v danom poradí (p menšie ako 0,05). inhibícia rastu nádoru bola zreteľnejšie u myší liečených PAB v kombinácii s ADR, s IR o 85,8%. Zistenie hmotnosti nádoru v rôznych skupinách ďalej podporovaný naše výsledky, pokiaľ ide o objem myší xenoimplantátů. Obrázok 2C a 2D ukazuje zmeny relatívnej telesnej hmotnosti myší v desiatich skupín. Telesná hmotnosť bola podobná medzi kontrolnými skupinami a PAB-liečených skupín. Avšak, telesná hmotnosť znížila v kombinovaných liečených skupinách a skupinách, ADR, a pokles zo skupín ADR bol zreteľnejší (p menšie ako 0,05). Okrem toho Obrázok 3 poskytuje priame porovnanie veľkosti nádoru SGC7901 buniek a buniek SGC7901 /ADR v rôznych skupinách. Vzťah medzi zmenou telesnej hmotnosti a objemu nádoru neboli štatisticky významné (p 0,05). Testované dávky boli dobre tolerované u myší, a žiadne zviera letalita bola počas experimentu pozorované.

Imunohistochemické farbenie pre expresiu COX-2, PKC-α a P-gp

Všetky nádory v každej skupine, pomocou imunohistochemického farbenia, zobrazí sa pozitívna expresia COX-2, PKC-a a P-gp proteínov. Cox-2 a PKC-α expresie bola definovaná ako pozitívna, ak zafarbený oblasť nádorových buniek bola v cytoplazme, a P-gp farbenie sa považuje za pozitívne, farbenie bolo pozorované v membráne a cytoplazme. Proteíny boli zafarbené žltej alebo hnedej pod optickým mikroskopom pozorovania (obrázok 4). Pre SGC7901 /bunkové línie ADR, farbenie týchto proteínov v kontrolných skupinách bola silnejšia ako u ostatných skupín (p menšie ako 0,05). Liečba PAB znižuje intracelulárnej farbenie COX-2, PKC-a a P-gp v porovnaní s ADR-liečenej skupiny (p menšie ako 0,05). Po PAB a liečby ADR, intracelulárne farbenie týchto proteínov bola redšia a slabšia v porovnaní s ostatnými skupinami. Pre xenoimplantátů dvoch kontrolných skupín NS, farbenie P-gp v SGC7901 buniek bola významne nižšia ako u SGC7901 /ADR buniek (p menšie ako 0,05). Analýza intenzity farbenie COX-2, PKC-α a P-gp expresie odhalila rovnaké výsledky (tabuľka 2).

Vplyv PAB na COX-2, PKC-alfa, a P-gp expresie u myší xenografe

k objasneniu molekulárnej mechanizmus zapojený do obrátenia účinkov PAB na SGC7901 /xenoimplantáty ADR In vivo expresie COX-2, PKC-alfa, a P-gp v nádoroch z rôznych činidlo ošetrené skupiny bola stanovená analýzou western blot. Ako je znázornené na obrázku 5, pre kontrolnú skupinu NS, hladiny expresie COX-2, PKC-alfa, a P-gp v SGC7901 buniek xenoimplantátů boli nižšie v porovnaní ako tie, ktoré v SGC7901 /tumorov ADR (p menšie ako 0,05) , Pre nádory SGC7901 /bunky ADR, že hladiny expresie všetkých troch proteínov, v kontrolnej skupine a kontrolnej TWEEN skupinu NS boli významne vyššie v porovnaní s ostatnými skupinami (p menšie ako 0,05), a nebol zistený žiadny významný rozdiel medzi dve skupiny (p 0,05). Hladiny expresie COX-2, PKC-alfa, a P-gp v PAB-liečenej skupiny boli významne nižšie v porovnaní s tými, v ADR-liečenej skupiny (p menšie ako 0,05). Expresie p-aktínu bola použitá ako vnútorná kontrola a hladiny expresie COX-2, PKC-alfa, a P-gp sa medzi kontrolnými skupinami postupne znížil, skupina ADR, skupina PAB a PAB + ADR skupina (p <0,05)

Diskusia

PAB je jednou z hlavných biologicky aktívnych zložiek kôry koreňov liečivé rastliny Pseudolarix Kaempfer stroje a zobrazuje značnej cytotoxicity k niekoľkým nádorové bunky. linky. In vitro štúdie tiež preukázali, že obráti MDR karcinómu tým, že zabráni nadmernej expresii P-gp bez zjavných vedľajších účinkov [13], [15], [20], [21]. Bolo tiež preukázané, že PAB má protinádorový účinok u myší, ktoré boli hlásené xenografe modely ľudskej rakoviny hrubého čreva a hepatocelulárneho karcinómu [13], [20], a známe žiadne vedľajšie účinky PAB na zvieratách. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že PAB má silný inhibičný účinok na SGC7901 bunkové línie in vitro a vyvoláva apoptózu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom kaspázy dráhy [16]. Naša súčasná in vivo štúdia poskytuje ďalší dôkaz, že CTB ich chráni pred žalúdočnými nádorov u myších modeloch štepov s využitím SGC7901 bunky a bunky SGC7901 /ADR. Naše predbežné experimenty ukázali, že PAB v dávke 25 mg /kg a to nielen inhibuje rast karcinómu žalúdka, ale je tiež dobre tolerovaná u myší. Navyše sme zahŕňal kontrolné TWEEN skupinu, aby bol vylúčený vplyv vodného roztoku, ktorý bol použitý, aby sa rozpustil PAB na nádoroch [13]. U citlivých buniek, protirakovinové účinky PAB žiadne významné rozdiely v porovnaní s ADR, tradičné chemoterapia drogy. Okrem toho, PAB je biologicky aktívny zlúčenina, ktorá pôsobí jej reverznej účinok proti SGC7901 /ADR bunkovej línie nádorov zameraním na signalizačné dráhu aktivovanú P-gp nadmernej expresie in vivo.

P-gp je 170 kDa membrána proteín, ktorý pôsobí ako liek efluxnej pumpy, čo má za následok kontinuálne defektu v intracelulárnej akumulácie liečiv [22]. Fenotyp mnohopočetné liekovej rezistencie je hlavnou príčinou zlyhania chemoterapie nádorových a je predovšetkým výsledkom nadmernej expresii P-gp vo väčšine nádorov, vrátane žalúdočných novotvarov [23]. Okrem toho sa inhibícia tejto dráhy môže byť spôsobom, ako zabrániť MDR z buniek karcinómu žalúdka [3], [24].

Cox-2, indukovatelný enzým, ktorý katalyzuje premenu kyseliny arachidonovej na prostanoidy ( PG) a podieľa sa na mnohých fyziologických a patologických udalostí, je indukovaný rôznych zápalových a mitogénnu podnety [25]. Silná asociácia medzi MDR a nadmernou expresiu COX-2 bola opísaná v mnohých rôznych typov nádorov. Tieto výsledky naznačujú, že predchádzajúce Cox-2 moduluje expresiu a aktivitu P-gp a podieľa sa na vývoji fenotypu MDR [26] - [28]. Okrem toho, karta dôkazy ukázali, že inhibítory COX-2, sú schopné zvyšovať citlivosť nádorových buniek k anti-proliferačnej účinky chemoterapeutických liečiv tým, že mení aktivitu ATP-väzbového proteínu kazety. Inhibítory COX-2 môže dokonca zvrátiť MDR tým, že blokuje COX-2-sprostredkované zvýšenie MDR1 expresiu a aktivitu na rakovinu, a to ako in vitro, tak in vivo [6], [7], [29]. Preto sme hypotézu, že COX-2 môže regulovať expresiu P-gp v nádorových tkanivách a že inhibícia tejto dráhy má veľký význam pre zvrátenie odolnosti rakoviny na chemoterapeutiká.

Zistili sme, že pre SGC7901 /ADR buniek tumorov, expresné hladiny COX-2 a P-gp v kontrolnej skupine NS boli zreteľne vyššie ako u xenoimplantátů z SGC7901 buniek. Po injekcii PAB, bol pozorovaný zrejmý pokles týchto expresných hladín. Avšak, ADR bol menej účinný pre potlačenie hladiny COX-2 a P-gp expresie SGC7901 /buniek xenoimplantátů ADR, a v kombinácii s PAB, bola pozorovaná nižšia úroveň proteínov. Takto sme navrhli, že modulácia expresie COX-2 u PAB by mohla znížiť expresiu a aktivitu P-gp, bráni rastu a indukujú apoptózu, okrem pôsobí kooperatívne s ADR pri potláčaní nádorov rezistentných a dokonca zrušenie MDR fenotyp karcinómu žalúdka.

PKC je serín /treonín kinázy podieľa na transdukciu signálu potrebného pre bunkovej proliferácie a diferenciácie [30]. Z PKC izoformy, nadmerná expresia a zvýšená aktivita PKC-a sú úzko zviazaná s reguláciou fenotypu MDR v ľudskej rakoviny žalúdka [31]. Výsledky tu prezentované podporujú predstavu, že PKC-α fosforizuje P-gp, moduluje funkciu výtoku P-gp, a nakoniec vedie k rezistencii na lieky [32]. Inhibícia PKC-a s špecifický inhibítor alebo zrážanie PKC-a s siRNA vedie k zníženiu expresie MDR1, zvýšenú toxicitu liečiv proti rakovine, a reverzné MDR [8] - [10]. Preto sme sa špekulovať, že transdukcia systém PKC-α signál by mohol hrať úlohu v modulácii expresie MDR1 v karcinómu žalúdka.

Za normálnych okolností, PKC je neaktívny v bunkách, a jeho aktivácia súvisí s rozvinutých aktivácie PGE. COX-2 je spojený s membránou asociované prostaglandínu E2 syntázy (MPGES-1), a syntézy PGE sprostredkované týmito proteíny sa zvyšuje a aktivuje po prúde PKC-a dráhy [33]. Bolo preukázané, že selektívne COX-2 inhibícia špecifické inhibítory alebo siRNA má terapeutický účinok na inhibíciu expresie PKC-a a P-gp, a zároveň, v rovnakej dobe, zvrátenie MDR [26], [34]. Štúdia preukázala, že PGE2 sprostredkuje indukciu expresie MDR1 prostredníctvom dráhy PKC [35]. Výsledky našich experimentov preukázali, že CTB môže inhibovať PKC-α expresiu xenoimplantátů z SGC7901 /bunkové línie ADR, ktorých účinok bol silnejší ako ADR. Okrem toho, keď bola PAB v kombinácii s ADR, PKC-α výraz inhibícia účinnosti bola ešte silnejšia. Zmena tendencie PKC-a expresie je v súlade s COX-2 a P-gp v rôznych reagenčných liečených skupín SGC7901 /ADR nádorov rezistentných. Bolo preukázané, že PAB indukuje zastavenie rastu a apoptózu inhibíciou dráhy Cox-2 v rakovinových bunkách [20], [21]. Predpokladáme, že PAB inhibuje expresiu COX-2 v bunkových SGC7901 /xenoimplantátů ADR, a že spojenie medzi COX-2 a MPGES-1 znižuje syntézu PGE, ktoré znižuje aktiváciu prúdu PKC-a. Vzhľadom k tomu, fosforylácie P-gp je inhibovaná, viac liečiv sa hromadí v nádorových bunkách, toxicita ADR sa zvyšuje a MDR je obrátený. Tieto výsledky poskytujú vhľad do novej stratégie zahŕňajúce použitie PAB k potlačeniu MDR žalúdočných rakovín človeka.

Jedným z cieľov nášho experimentu je inhibičný účinok kyseliny pseudolaric B na podkožných xenoimplantátů ľudského adenokarcinómu žalúdka a porovnanie protirakovinových účinkov liekov medzi rôznych liečebných skupín. Okrem toho, charakteristika SGC7901 buniek a buniek SGC7901 /ADR sú rôzne. Prostredníctvom našich dvoch pre-experimentu a formálne experiment, všetci zistené, že objem nádoru buniek SGC7901 /ADR nebol väčší ako SGC7901 buniek. Predpokladáme, objem nádoru môže byť spojené s počtom buniek, doba rastu, charakteristické buniek a ďalších druhov faktorov. Preto sme sa v porovnaní objeme nádoru medzi SGC7901 bunkových xenoimplantátům a bunkových xenoimplantátům SGC7901 /ADR. V Okrem toho sme špekulovať, že telo zmeny hmotnosti myší môže byť spojené predovšetkým so toxicite drog, a nemajú významný vzťah k objemu nádoru v experimente.

tiež namierená nášho experimentu je základom molekulárne mechanizmy, podieľajúce sa na mnohopočetné liekovej rezistencie. Máme teda určené iba NS kontrolná skupina bunkových xenoimplantátů SGC7901 kontrastu a potvrdiť výrazy troch druhov proteínov z bunkových xenoimplantátů SGC7901 /ADR sú skutočne výrazne vyššie, než je z bunkových xenografe SGC7901. Okrem toho, pretože odozva SGC7901 buniek protinádorových liečiv je trochu citlivejší ako bunky SGC7901 /ADR v oboch základných a klinických pokusov, ako zlepšiť citlivosť mnohopočetné liekovej rezistencie buniek, protirakovinové lieky, je náš výskum zamerať. Z tohto dôvodu sme sa porovnávali prejavy COX-2, PKC-alfa a P-gp pre nádory z SGC7901 a rôznych procedúr tejto skupiny s výnimkou NS kontrolnej skupine Western blot a imunohistochemickým farbením.

Naša štúdia zistila, že rastlinný diterpenoidov PAB nielen významne potlačené rakovinou žalúdka SGC7901 buniek in vivo, ale tiež zobrazené zjavné inhibičné účinky voči nádorov SGC7901 /buniek rezistentných ADR. Okrem toho, kombinácia PAB ADR môže inhibovať rast rakoviny žalúdka a rozvoj xenotransplantátov u nahých myší. Stojí za zmienku, že ako druh tradičnej čínskej medicíny, účinok PAB na telesnej hmotnosti u nahých myší bolo dosť nižšie ako ADR v experimente, čo je zrejmé, tú výhodu, že je PAB bezpečnejšie a znesiteľnejšie drog pre terapia rakoviny. PAB nemusí byť len nový účinný liek pre inhibíciu rastu karcinómu žalúdka a zvrátiť MDR, ale tiež môže byť použitý ako vynikajúci adjuvans s tradičnými chemoterapeutikami a chirurgickej liečbe nasledujúcich ďalšieho vývoja a výskumu.

v tejto štúdii sme skúmali, prvýkrát, inhibičný efekt PAB proti ľudskému karcinómu žalúdka a jej vplyv na obrat MDR in vivo prostredníctvom xenoimplantátu nahých myšiam modelu. Zistili sme, že jej inhibícia MDR bola sprostredkovaná Cox-2 /PKC-a /P-gp dráhy, ktorá poskytuje rozhodujúce teoretický základ o molekulárne mechanizmy žalúdočnú liečbe rakoviny. Avšak, my sme neštudovali mechanizmus MDR, čo sa týka génovej expresie a regulácie. Vzhľadom k tomu, molekulárne mechanizmy zvrátenie MDR sú mimoriadne zložité a viac typov proteínov, génov a faktory môže byť zahrnutá, slučky, ktoré sme navrhli môže byť iba časť mechanizmu pre cúvanie MDR. Viac do hĺbky a betónové regulačné mechanizmy musia byť objasnená v ďalších štúdiách.

Na záver CTB má významný inhibičný účinok na rakovinu žalúdka in vivo a môže zvrátiť MDR rakoviny žalúdka do chemoterapeutickej lieky. Mechanizmus proti MDR je sprostredkovaná aspoň čiastočne cez Cox-2 /PKC-a /P-gp dráhy. Naša štúdia poskytuje široké možnosti pre budúce vyšetrovanie PAB v žalúdku liečbe rakoviny.

Podporné informácie
Checklist S1.
prídete Guidelines Kontrolný zoznam
doi :. 10,1371 /journal.pone.0107830.s001
(DOC)

• Ploche ONE: Chemoterapia alebo cielená liečba ako druhej línii liečby pokročilého rakoviny žalúdka. Systematický prehľad a Meta-analýza publikovaných štúdií
• Ploche ONE: Intratumor IL-17-Positive žírne bunky sú hlavným zdrojom IL-17, ktorá je prediktívne prežitia v žalúdočnej pacientov s rakovinou