Fundo
Os microRNAs (miRNAs) são amplamente estudados RNAs não-codificantes que modulam a expressão do gene. MiRNAs são desregulados em tumores diferentes, incluindo câncer gástrico (GC) e tem implicações de diagnóstico e prognóstico em potencial. O objetivo do nosso estudo foi determinar o perfil miRNA em tecidos GC, seguido de avaliação de miRNAs desregulados em plasma de pacientes do GC. Usando disponíveis bases de dados e bioinformática métodos nós também teve como objetivo avaliar genes alvos potenciais de confirmada diferencialmente expressos miRNA e validar esses achados em tecidos GC.
O estudo incluiu 51 pacientes do GC e 51 controles. Inicialmente, foram selecionados perfil de expressão miRNA em 13 amostras de tecido de GC e 12 tecidos gástricos normais com matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA). Na segunda etapa, miARNs expressos diferencialmente foram validados em uma coorte de replicação utilizando qRT-PCR em amostras de tecido e de plasma. Posteriormente, foram analisados genes alvos potenciais de miRNAs desregulados utilizando abordagem de bioinformática, determinou a sua expressão em tecidos GC e análise de correlação realizado com segmentação miRNAs.
Profiling com TLDA revelou 15 miRNAs desregulados em GC em comparação com os tecidos da mucosa gástrica normal. análise de replicação confirmou que miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p e miR-375 foram consistentemente desregulamentado em tecidos GC. Análise de amostras de plasma dos pacientes GC mostrou significativa diminuição da regulação de miR-148a-3p, miR-375 e up-regulação do miR-223-3p comparação com indivíduos saudáveis. Além disso, usando ferramentas de bioinformática nós identificamos alvos de miRNAs replicado e realizadas análises de enriquecimento gene associado à doença. Em última análise, nós avaliamos gene alvo potencial BCL2 O nosso estudo revelou perfil miRNA em tecidos GC e mostraram que miR-148a-3p, miR-223-3p e miR-375 são desregulados em amostras GC de plasma, mas estes miRNAs circulantes mostrou desempenho diagnóstico relativamente fraco como biomarcadores únicos. análise do gene alvo demonstrou que BCL2 Citation:. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link A , Kiudelis L, Jonaitis L, et ai. (2015) Análise de desregulado microRNAs e seus genes alvo em câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10.1371 /journal.pone.0132327 editor: Lin Zhang, da Universidade da Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos Recebido: 22 de abril de 2015; Aceito: 13 de junho de 2015; Publicação: 14 de julho de 2015 Direitos de autor: © 2015 Juzėnas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação Financiamento:. Esta obra de JK, LJ, Siju, LK, JS foi apoiado pelo Fundo social Europeu No. VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. O trabalho da PM é apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, no quadro da pathogenomics ERA-Net. Grant No: BMBF-0315905D. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes Introdução A descoberta de microRNAs (miRNAs) e estabelecimento de seu papel na vias moleculares trouxe um grande avanço na biologia molecular [1] [2]. Estes pequenos RNAs não-codificantes composto de ~ 22 pb estão envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão génica. Os miRNAs são caracterizados por uma elevada estabilidade em amostras biológicas que fazem estas moléculas um alvo atraente no campo da pesquisa biomarcador [3] [4]. Acumulando a evidência mostra que miRNAs estão envolvidos em importantes vias de carcinogênese [5]. Estudos anteriores revelaram que a desregulamentação dos miRNAs ocorre praticamente em todos os principais tipos de câncer [5] [6]. Além disso, miRNAs têm sido demonstrado que têm um papel diagnóstico ou prognóstico e implicações clínicas mesmo potencial para a terapia de gene alvo em pacientes com câncer [7] [8]. A incidência de câncer gástrico (GC) nos países ocidentais tem diminuído ao longo das últimas décadas; no entanto, este tipo de câncer ainda é responsável por quase um milhão de novos casos da doença em todo o mundo e carrega uma taxa de mortalidade muito alta [9]. Pesquisas recentes sobre GC revelou muitos novos insights sobre a patogênese desta malignidade. No entanto, os mecanismos exatos da transformação maligna de Helicobacter pylori O papel crucial dos miARNs em GC tem sido demonstrado em vários estudos [12]. Volinia et ai. ter fornecido um dos primeiros perfis de expressão de miARN no tecido GC mostram um padrão específico desregulação [13]. Outros estudos também relataram desregulamentação significativa de miRNAs pertencentes a miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 e muitas outras famílias. Entre os estudos relatados nos tecidos GC, miR-21, miR-25, miR-92, miR-223 foram os miRNAs mais consistentemente sobre-regulada, enquanto que miR-375 e miR-148 foram os mais consistentemente regulada para baixo [14] [ ,,,0],15] [16]. A maioria destes estudos analisaram o perfil miRNA em pacientes com GC e mucosa emparelhado normal adjacente gástrica [14]. importantes estudos têm mostrado que miRNAs já estão desregulados nos estágios iniciais da carcinogênese gástrica, incluindo H O objetivo do nosso estudo foi determinar o perfil miRNA em tecidos GC e compará-la com a mucosa gástrica normal e saudável utilizando ampla cobertura miRNA TaqMan de baixa densidade matrizes. Em uma análise mais aprofundada, que teve como objetivo validar os nossos resultados da caracterização do tecido e plasma de um grupo maior de pacientes do GC e controles saudáveis de ascendência europeia. Em última análise, foram avaliados os potenciais genes alvo de confirmados diferencialmente expressos miRNA e realizou doença associação de análise de enriquecimento gene de seus genes-alvo. declaração Materiais e Métodos A estudo foi aprovado pelo Comitê de Kaunas Regional de Investigação Biomédica de Ética (Protocolo n ° BE-2-10). Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento para participar do estudo. As amostras de tecido foram prospectivamente coletados entre 2011 e 2014 no Departamento de Gastroenterologia e Cirurgia, Hospital da Universidade de Ciências da Lituânia Saúde (Kaunas, Lituânia). O estudo incluiu um total de 51 indivíduos controles e 51 pacientes do GC, que foram divididos em o profiling (GC, n = 13; controles, n = 12) e coortes de validação (GC, n = 38; controles, n = 39). Todos os indivíduos eram de ascendência europeia. biopsia gástrica foram obtidos de parte antral do estômago de indivíduos de controle que foram encaminhados para endoscopia gastrintestinal superior devido a sintomas de dispepsia e não tinha história prévia de malignidade. espécimes de tecidos de GC foram obtidos a partir de espécimens cirúrgicos imediatamente após a ressecção de pacientes submetidos a cirurgia primária para a GC, sem irradiação pré-operatória e quimioterapia. adenocarcinoma gástrico em pacientes GC foi verificada por meio de histologia e classificados de acordo com Lauren em difusa e tipos intestinais [22]. H preparação de amostras de tecidos e RNA extração amostras de tecido gástrico foram armazenados em RNAlater (Ambion, Austin , TX, EUA) a + 4 ° C e 24 horas depois armazenadas a -80 ° C. 30 mg de tecido foi homogeneizada em condições estéreis, antes do isolamento de ARN total com o kit de isolamento miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA) para perfilar estudo e miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA) para o estudo de validação, de acordo com o instruções dos fabricantes. A qualidade do RNA foi avaliada usando o espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, EUA). análise qualitativa da integridade do RNA foi realizada por eletroforese em gel de agarose (5%). Exemplo de Plasma e RNA extração As amostras de plasma foram coletadas de pacientes de saúde e pacientes com GC. A expressão miRNA na coorte plasma consistiu em amostras de plasma de 38 pacientes com câncer gástrico e 39 voluntários saudáveis. O sangue venoso foi recolhido em tubos de vácuo EDTA anticoagulação e foi centrifugada a 3500 rpm durante 15 min à temperatura ambiente; plasma separado foi transferido para tubos de 1,5 ml e colocada num congelador a -80 ° C para armazenagem de curta duração. Pequenos RNAs foram extraídos a partir de 200 ul de plasma utilizando o kit miRNeasy Soro /plasma (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Mirna profiling foi realizada com a matriz TaqMan Cartão Mirna Humano a v2.1 que permitiu quantificar 377 miRNAs humanos catalogados no miRBase v20 [23]. Resumidamente, 350 ng de ARN total foi inicialmente transcrito de forma inversa utilizando o Megaplex RT definir uma piscina para a versão 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA) e 800 uL de produto de ADNc foi em seguida carregado na matriz TaqMan cartão miARN humano e executado no VIIa 7 real-Time PCR System (Applied Biosystems). análise primária foi feito usando VIIa 7 Software (Applied Biosystems) para obter expressão em termos de Ct. A análise dos dados foi realizada utilizando pacote Bioconductor HTqPCR [24]. MiRNAs com um valor de Ct > 37 foram considerados sem amplificação. MiRNAs que não foram amplificados em mais de 25% das amostras foram consideradas estar modestamente expressa e, portanto, excluído de análises posteriores. dados de expressão de miRNA foi normalizada utilizando classificação normalização invariável. NormFinder e geNorm algoritmos foram usadas para identificar um gene de referência a partir de dados TLDA para estudo de validação [25]. De acordo com os algoritmos de miR-127-3p mostrou menor variância Ct e foi escolhido como gene de referência para o estudo de validação. Estudos recentes mostram que os níveis de RNU6A e alguns outros RNAs nucleares pequenos expressão pode ser instável em certos tecidos e condições e não podem servir como melhores genes de referência [26] [27] [28] [29]. Uma recente publicação também identificou miR-127-3p como um bom candidato para a seleção de genes de referência [30]. A transcrição reversa (RT ) as reacções foram realizadas utilizando TaqMan miARN Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA) e os iniciadores RT de haste-laçada específicos miARN-(Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA). singleplex reacções foram realizadas num volume de 7,5 mL. Cada reacção compreendida 2,08 mL de água livre de nuclease, 0,74 ul tampão 10 × TA, 0,08 mL de dNTP (100 mM), 1,5 ul 5 × miARN-específicos iniciadores de RT, 0,1 inibidor uL de RNase, 0,5 mL MultiScribe Transcriptase Reversa e um volume fixo de miARN molde (2,5 mL). RT foi realizada num termociclador sob as seguintes condições: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 45 min e 85 ° C durante 5 min, seguido de uma retenção em 4 ° C TaqMan real. -tempo reacções de PCR foram realizadas em reacções em duplicado compreendendo 6,25 mL TaqMan Universal 2 × mistura de PCR n mestre com AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA) 0,625 mL de 20 × miARN-iniciador específico e mistura de sonda de o Kit de Ensaio TaqMan miARN (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA), 3 uL do produto de transcrição reversa e 2.625 mL de água livre de nuclease. RT-PCR foi realizada usando um rápido em tempo real do sistema 7500 de PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA), sob as seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 60 s, seguido de uma retenção em 4 ° C. Cada amostra foi executado em duplicado. Os dados foram analisados com definições automáticas para atribuir a linha de base, e os valores Ct e SD médios foram calculados. O nível de expressão de miARN no tecido foi normalizada para miR-127-3p e o nível de expressão no plasma foi normalizada para HSA-miR-16-5p. Os resultados foram calculados utilizando o método ΔΔCT [31]. Os dados foram analisados com definições automáticas para atribuir a linha de base, e os valores médios de Ct e SD foram calculados. cDNA para BCL2 Comprar e Análise DNMT3B A listas de genes alvo validadas das miRNAs candidatos foram obtidos a partir miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) e bases de dados miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org). dados de associação de genes de doenças foram recuperados a partir da base de dados DisGeNET (http://www.disgenet.org/). A fim de identificar genes GC-associados, o termo "adenocarcinoma gástrico" (UMLS: C0278701) foi usado como consulta do banco de dados. redes biológicas foram criados usando Cytoscape v3.2 software de código aberto com a aplicação CyTargetLinker [32]. A análise estatística As características clínicas entre os grupos foram comparados usando o χ perfil de expressão de miRNA de GC e do tecido da mucosa gástrica saudável, TLDA TaqMan miRNA Human Low-Density análise de arranjo foi realizada para identificar miRNAs candidatos que exibem expressão alterada em tecido de cancro gástrico. Tecido de miARN perfis de pacientes GC foram comparados com perfis de mucosa gástrica a partir de indivíduos saudáveis. Depois de filtrar para baixo miRNAs abundantes (valor Ct > 37 e não detectáveis em mais de 25% das amostras), um conjunto de 193 miRNAs (do total de 377) permaneceram para análise posterior. Uma comparação entre canceroso contra o tecido normal identificaram 15 miRNAs diferencialmente expressos, dos quais 7 foram up-regulamentados e 8 foram regulados negativamente com FDR valor de p < 0,01 ajustado e dobre as alterações > 2 (Tabela 2). Os resultados são demonstrados na trama vulcão (Fig 1). Entre estes, 6 miRNAs (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p e miR-155-5p), mostrando a maior importância e dobre alterar valores, foram seleccionados para o estudo de validação. agrupamento hierárquico sob distância euclidiana de dados de expressão normalizada miRNA selecionados revelaram dois subgrupos: uma correspondente ao grupo controle e o segundo correspondentes, principalmente, ao grupo de doentes. (Fig 2). Os seis miRNAs candidatos selecionados para verificação foram quantificados utilizando qRT-PCR. Para a seleção gene de referência os dados TLDA foi analisada utilizando dois algoritmos diferentes (NormFinder e geNorm) para identificar genes de referência. MiR-127-3p mostraram maior estabilidade de expressão em todas as amostras de dados TLDA e devido a esta característica de miR-127-3p foi escolhido como gene de referência para normalizar os dados qPCR. Os níveis de miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p e miR-375 de expressão mostraram expressão diferencial significativa no mesmo sentido, como no estudo descoberta (FDR ajustado p < 0,05), enquanto não significativa foram detectadas diferenças nos níveis de miR-135a-5p e miR-155-5p expressão (; 0,05; FDR p >ajustado Fig 3) Plasma miRNAs como potenciais biomarcadores para o câncer gástrico Alvo previsão gene Para investigar mais os possíveis alvos de miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223- 3p e miR-375, todas as suas interações miRNA-alvo experimentalmente validadas foram obtidos a partir de duas bases de dados diferentes (miRTarbase e miRecords). Os dados foram visualizados em Cytoscape como uma rede biológica contendo todos os miARNs mencionados e as suas interacções alvo (Fig 5). Cada interação na rede consistia de dois nós, um nó miRNA regulamentar (vermelho) e um nó de mRNA alvo (rosa), ligado através de uma aresta dirigida. Em geral, a rede 593 alvos incluídos validados, 419 deles atribuído a miR-375, atribuída a 88 de miR-204-5p, 83 atribuído para miR-148a-3p 21 e atribuído a miR-223-3p. A análise de rede revelou que miR-148a-3p e miR-375 tinha seis metas compartilhadas (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 e RAB10), miR-204-5p e miR-375 também teve seis metas compartilhadas (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 e IL1RAP), miR-148a-3p e miR-204-5p tinha dois alvos em comum (AURKB e CDC25B), miR-223-3p e miR-148a-3p também tinha dois alvos em comum (HSP90B1 e IRS1), miR-223-3p e miR-375 tinha um alvo compartilhado (PARP1) e miR-148a-3p, miR-204-5p e miR-375 também tinha um alvo compartilhado (BCL2). genes-alvo que foram regulamentados simultaneamente por dois ou três miRNAs são representados em cores laranja e verde, respectivamente (Fig 5). enriquecimento gene associado à doença análise A fim de identificar se a doença genes -associated foram significativamente enriquecida em nosso conjunto de alvos de miRNA, foi realizada análise de enriquecimento. Em primeiro lugar, a lista de genes foi recuperado a partir do banco de dados DisGeNet. Como consulta para o banco de dados foi utilizado o termo "adenocarcinoma gástrico" (UMLS: C0149826). Depois de filtrar para fora miARN, lncRNA e os genes que não estavam em miRTarbase e miRecords, 115 foram identificados genes para ser associado com GC. Na análise de rede 20 de genes associados à GC foram sobrepostos, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 e JAG1) deles atribuído a miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 e SPARC) atribuído a miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, e NR1I2 CCKBR) atribuído a miR-148a-3p e 2 (STMN1 e IGF1R) atribuído a miR-223-3p. Os genes alvo que foram associados com GC são representadas a azul (Fig 5). Finalmente, a análise de enriquecimento do gene associado à doença foi realizada utilizando um teste baseado na distribuição hipergeométrico que levou para avaliar se o número de genes associados a GC é maior do que o esperado, no conjunto de genes alvo de miARNs seleccionados. Análise de Enriquecimento de revelou que os genes associados a GC foram significativamente sobre-representados (p < 0,05) em miR-148a-3p, miR-204-5p e miR-223-3p, enquanto nenhum enriquecimento significativo foi observado em miR-375 genes alvo (p > 0,05) (Tabela 3) BCL2 Discussão Altered perfis de expressão de miRNA tem. foi relatado em tecidos e amostras de sangue GC [13] [20] [14] [38]. Alguns destes miARNs desregulados têm sido associados com a sobrevivência, o comportamento metastático de tumores e outras características clinicopatológicas de GC [39] [40]. Além disso, miARNs têm sido mostrados para regular o crescimento do tumor por acção sobre a proliferação, a adesão, invasão e migração em linhas celulares de GC [41]. Mais importante ainda, genes alvo de miARNs desreguladas em GC estão envolvidos na apoptose, ciclo celular e outras vias de carcinogénese cruciais [12]. Portanto, a investigação de miRNAs e seus genes-alvo potencial em GC pode servir para o desenvolvimento de importantes alternativas de diagnóstico e tratamento. É evidente que miRNAs são grandes jogadores na carcinogênese gástrica, mas ainda não temos dados precisos sobre os mecanismos e potenciais aplicações clínicas destas moléculas em GC. O presente estudo teve como objetivo determinar o perfil de miRNAs desregulados em GC tecidos, avaliá-los em amostras de plasma e avaliar genes alvos potenciais de miRNAs desregulados. Usando TaqMan miRNA TLDA cartões, englobando 377 miRNAs primers, encontramos 15 miRNAs diferencialmente expressos entre GC canceroso e tecidos gástricos saudáveis. Oito miRNAs foram regulados negativamente (deixe-7a-5p, deixe-7G-5p, miR-26b-5p, miR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), enquanto sete miRNAs foram regulados positivamente (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p e miR- 484). Nossos resultados de perfis não revelou alguns dos miRNAs comumente desregulamentados, que foram previamente relatados a ser desregulamentado em outros estudos, incluindo miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-29c-3p, e alguns outros [15] [19] [14]. Uma das possíveis explicações para esses miRNAs falta pode estar relacionada com critérios estatísticos muito estritas que foram aplicados para análise TLDA dos nossos dados (FDR p-valor ajustado < 0,01 e dobre as alterações > 2). Além disso, algum nível de discrepância no miRNA profiling resultados entre os estudos podem resultar de diferenças na localização anatômica do estômago, subtipo histológico, análise estatística e métodos especialmente perfis [18]. Um estudo realizado por Mestdagh et al. mostra que diferentes plataformas de miARN perfis têm diferentes taxas de detecção, especificidade e reprodutibilidade, e que a plataforma mais adequada deve ser escolhida com base na configuração experimental e as questões específicas de pesquisa (Mestdagh et al., 2014). na segunda fase do nosso estudo utilizamos qRT-PCR em coorte de replicação incluindo seis miRNAs mais desregulamentados desde a fase de perfilamento (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p e miR-375). Nós mostramos que miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p e miR-375 foram consistentemente desregulada entre tecidos normais e cancerosos GC. Os resultados do nosso coorte de replicação são suportados por relatórios anteriores. Vários estudos têm mostrado que o miR-148a-3p foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de GC e amostras de tecidos em comparação com os tecidos normais adjacentes [42] [43]. Baixos níveis de expressão de miR-375 também foi relatada por estudos, levantando a hipótese de que o miR-375 foi associada a carcinogénese gástrica [44] [16]. Identificou-se que o miR-223-3p foi significativamente regulada para cima no tecido do GC em relação ao tecido normal, tal como sugerido por vários relatórios anteriores [15] [19]. Mir-204-5p foi menos frequentemente relatada em GC miRNA profiling estudos; No entanto, nossos resultados estão em linha com um estudo anterior que mostrou significativa diminuição da regulação deste miRNA no tecido GC e linhas de células GC [45]. expressão de miR-135a-5p foi menor em tecidos GC que nos indivíduos controle; no entanto, a tendência para baixo-regulação observada foi semelhante a relatórios anteriores [15] e poderia ter alcançado significância com um maior número de indivíduos dentro dos grupos necessário. É importante ressaltar que não encontramos diferenças para miR-155-5p em nossa coorte de replicação comparando indivíduos controle e pacientes do GC. Muito provavelmente este achado está relacionado com o facto de, na coorte de avaliação inicial, os sujeitos controle foram H Para investigar o papel potencial dos miRNAs diferencialmente expressos como biomarcadores em GC, analisamos miRNAs desregulamentado em amostras de plasma. miARNs de circulação, particularmente a combinação de vários miARNs, pode apresentar como biomarcadores promissoras para o diagnóstico de cancros gastrointestinais [21]. Um estudo realizado por Zhu et al. demonstraram que um painel de cinco miARN pode servir como um biomarcador potencial na detecção de GC fase inicial [47]. Até à data, relataram perfis de miARN no soro ou plasma GC diferir consideravelmente entre os diferentes estudos [21].
e DNMT3B
expressão por qRT-PCR em tecidos GC, que se correlacionou com a segmentação expressão miRNA.
Conclusões
e expressão DNMT3B
no tecido GC correlacionada com a sua expressão miRNA alvo
( H
. pylori
) infecção para gastrite atrófica crônica, metaplasia intestinal e GC é ainda mal compreendida [10 ]. hipótese atual de desenvolvimento GC envolve efeitos combinados de origem bacteriana, hospedeiro e fatores nutricionais; no entanto, até à data, esta teoria sugere muito poucas implicações translacionais clinicamente som [11]. A maioria dos casos de GC são diagnosticados em estágios avançados da doença, que está associada a maus resultados de pacientes. Por conseguinte, um dos principais focos da investigação GC é a avaliação dos biomarcadores potenciais que poderiam ser usados para o diagnóstico precoce não-invasiva deste malignidade.
. pylori
gastrite e estágios pré-malignas de atrofia gástrica e metaplasia intestinal [17] [18]. Curiosamente, algumas das miARNs têm direcções opostas desregulação na presença de GC, como estudos de perfil separadas mostram inconsistência significativa entre miARNs desregulados [14]. MiR-9 foi encontrado para ser regulado para cima em dois estudos [15] [19], enquanto dois outros papéis mostraram significativa diminuição da regulação deste miRNA em tecidos GC [13] [20]. Estas discrepâncias entre os resultados de desregulamentação opostas para miR-9 e muitas outras miRNAs são provavelmente ligadas a diferenças na localização anatômica da GC, subtipo histológico, estágio da doença, plataformas de criação de perfil, análise estatística e muitos outros potenciais fatores de confusão. Além disso, a maioria dos estudos publicados atualmente no perfil miRNA em tecidos GC abranger temas de países asiáticos; Enquanto isso, os dados sobre pacientes GC europeus ainda é escassa [21].
Ética
População do estudo
. Status pylori
foi avaliada em GC e controles usando ELISA indirecta para detectar o antígeno específico IgG de soro (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Alemanha). As características clínicas e patológicas de coortes de pacientes, incluindo idade, sexo e estágio da doença estão resumidos na Tabela 1.
preparação
miARN de perfil usando a matriz TaqMan Low-Density
reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase de transcrição (qRT-PCR)
expressão do gene foi sintetizado a partir 500 ng de ARN utilizando um High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA). singleplex reacções foram realizadas num volume de 7,5 mL. Cada reacção de composto 2,1 mL de água livre de nuclease, 1 ul de tampão 10 × RT, 0,4 uL dNTPs (100 mM), 1? L 10 × iniciadores RT aleatório, 0,5 mL MultiScribe Transcriptase reversa e um volume fixo de molde miARN (2,5 uL). RT-PCR foi realizada num termociclador sob as seguintes condições: 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 120 min e 85 ° C durante 5 min, seguido de uma retenção em 4 ° C. Antes de amostras de ADNc de qPCR foram diluídas 1: 1 com água isenta de nuclease e 2 ul utilizado em 10,5 ul reacções de RT-qPCR juntamente com 6,25 ul de 2x rápida TaqMan Universal Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA), 0,625 TaqMan Gene Expression Assay ul 20x (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) e 3.625 mL de água estéril. Os ensaios de RT-qPCR foram realizadas em triplicado num rápido em tempo real do sistema 7900HT PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, Califórnia, EUA), sob as seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, depois 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 60 s, seguido de uma retenção em 4 ° C. Os níveis de BCL2 Comprar e expressão DNMT3B
no tecido foi normalizado para ACTB
.
análise de rede gene alvo
2 e teste exato de Fisher para dados qualitativos e teste t para dados quantitativos. Os dados TLDA foi analisada utilizando o teste t e correcção Benjamini Hochberg para taxa de detecção falsa de tal modo que a expressão diferencial foi considerada significativa com um p < 0,01. Os dados foram normalizados utilizando classificação normalização invariante [33] e analisados utilizando o pacote HTqPCR. Os dados de expressão de qPCR de validação e o plasma foi analisado utilizando teste não paramétrico de Mann-Whitney U-test. A Benjamini Hochberg p <ajustado; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os dados de qRT-PCR, os níveis de expressão relativos de cada um miARN alvo (Log2 nível relativo) foram calculados de acordo com a diferença de valores entre os CT miARN alvo e miR-127-3p em amostras de tecido e miR-16-5p em amostras de plasma (ΔCT) [34]. Hypergeometric teste foi utilizado para a análise de enriquecimento alvo associada ao GC. A curva receiver operating characteristic (ROC) foi gerado para cada miRNA usando dados ΔCT. A área sob a curva de valor (AUC) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados para determinar a especificidade e sensibilidade. Para analisar o valor de diagnóstico de alterações nos níveis de miARN combinados de plasma, foi utilizado o algoritmo médio da expressão do gene univariada [35]. Curvas ROC foram geradas usando o pacote ROCR [36]. Todas as análises de dados foram realizadas usando a versão R 3.1.1 software.
Resultados
validação Mirna em GC e do tecido da mucosa gástrica saudável com qRT-PCR
e DNMT3B
sobre-expressão e correlação inversa com a segmentação miRNAs em tecidos com câncer gástrico
como um alvo putativo para miR-148a-3p, miR-204-5p e miR-375 e DNMT3B Compra de miR-148a-3p e miR-375. Todos estes miRNAs em nosso estudo foram encontrados para ser regulada para baixo no tecido câncer gástrico. Para apoiar ainda mais estes resultados, em primeiro lugar a análise do BCL2
e expressão DNMT3B
genes foi realizada. Os dados de qRT-PCR mostrou aumento significativo nos níveis de ambos Expression BCL2
e DNMT3B
genes em tecidos de câncer gástrico. BCL2
mostrou um aumento de 2,7 vezes, enquanto DNMT3B
tiveram um aumento de 16,7 vezes nos níveis de ARNm (Figura 6). análise de correlação de Pearson foi realizada a fim de desvendar a relação entre o BCL2
e DNMT3B
mRNAs e seus segmentação níveis de miRNA em tecidos gástricos normais e cancerosos (Fig 6). Foi observada uma correlação inversa para ambos do previsto DNMT3B
-targeting miRNAs: miR-375 (r = -0,49; p = 0,00001) e miR-148a-3p (r = -0,26; p = 0,0328) . Observou-se uma correlação negativa entre o BCL2 Comprar e miR-375 (r = -0,32; p = 0,0116), enquanto não foi encontrada relação entre BCL2 Comprar e miR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) ou BCL2 Comprar e miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
. pylori
livre, enquanto no conjunto de replicação, alguns dos indivíduos do grupo controle tiveram sorologia positiva para esta bactéria. É bem sabido que o miR-155-5p está envolvida em vias inflamatórias incluindo H
. pylori
gastrite [46]; portanto, isso pode dar um certo preconceito com nossos resultados. Nossos resultados estão de acordo com estudo anterior pela Link et al. (2015), onde a diferença na expressão de miR-155 em biópsias de GC em comparação com controlos não atingiu significância estatística [18]. Na fase de replicação do nosso estudo miRNA perfis foram selecionados apenas seis miRNAs, que mostraram a maior relevância biológica e significância estatística. Concordamos que seria interessante para olhar miRNAs em tudo significativamente desregulados e que poderia ser uma tarefa potencial em estudos futuros.
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