PLoS ONE: Циркуляционный метилированный XAF1 ДНК Указывает неблагоприятный прогноз для рака желудка

Абстрактный

Фон
<р> метилированной ДНК в жидкостях может быть подходящим биомаркером для больных раком. XAF1
было показано, часто понижающей регуляции в рака желудка человека (GC). Здесь мы исследовали, если XAF1
метилирование в GC может быть полезным биомаркером.

Методы
<р> в режиме реального времени RT-PCR использовали для обнаружения XAF1 <бр> экспрессия мРНК; иммуногистохимии и вестерн-блот были использованы для изучения экспрессии белка XAF1 в GC тканях (п = 202), а также их соответствующие пара-раковая гистологические нормальных тканей (PCHNTs). В режиме реального времени метилирования конкретных ПЦР использовали для исследования XAF1
промотор метилирование в той же панели GC тканей, их PCHNTs и сывороток.

Результаты
<р> Мы подтвердили частые XAF1
понижающая регуляция как в мРНК и уровня белка в тканях GC по сравнению с контрольной группой и PCHNTs. XAF1
гиперметилирование наблюдалась у 83,2% (168/202) ГК тканей и 27,2% (55/202) из ​​PCHNTs, а не метилирование не был обнаружен в 88 нормального контроля. Уровень метилирования в тканях GC была значительно выше, чем в PCHNTs ( р и л;
0,05). Гиперметилирование XAF1
достоверно коррелирует с понижающую регуляцию XAF1
в GC тканей в обоих уровней мРНК и белка ( р
&л; 0,001 каждая). Кроме того, мы обнаружили высокую частоту XAF1
метилирование (69,8%, 141 из 202) в сыворотке крови ДНК из одних и тех же пациентов, в то время как сывороток ДНК из 88 контрольных неопухолевыми были отрицательными для XAF1
метилирование. XAF1
метилирования в обеих тканях GC и в сыворотке крови может быть хорошим биомаркером для диагностики GC (AUC = 0,85 для ткани и AUC = 0,91 для сывороток) и достоверно коррелирует с плохим прогнозом ( р
&л; 0,001). Кроме того, после операции отрицательного к положительному переходу XAF1
метилирование в сыворотке тесно связано с рецидивом опухоли.

Выводы
<р> 1) Дисфункция XAF1
часто и регулируется с помощью XAF1
гиперметилированием промотора; 2) Обнаружение циркулирующего метилируется XAF1
ДНК в сыворотке крови может быть полезным биомаркером в диагностике, оценке пациента исхода (прогноз и рецидивов) для пациентов GC
<р> Образец цитирования:. Ling ZQ, Lv P , Лу XX, Ю. JL, Хан J, Ин LS и др. (2013) Циркуляционный метилированных XAF1
ДНК Указывает неблагоприятный прогноз для рака желудка. PLoS ONE 8 (6): e67195. DOI: 10.1371 /journal.pone.0067195
<р> Редактор: DunFa Пэн, Vanderbilt University Medical Center, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 12 марта 2013 года; Принято: 16 мая 2013 года; Опубликовано: 27 июня 2013
<р> Copyright: © 2013 Ling и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была поддержана грантом научно-технических проектов и технологий General провинции Чжэцзян (нет. 2009C33143), а частично за счет гранта от Backbone Талант провинции Чжэцзян медицины и гигиены платформы программ (нет. 2011RCA009). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака в Китае, с высоким уровнем заболеваемости и смертности, приблизительно составляет 10% от всех злокачественных опухолей [1]. Желудочный туморогенез сложный, многоступенчатая процесс, включающий изменения многих генов [2]. Аберрантная метилирования промотора является одним из основных механизмов, чтобы заглушить некоторые гены опухолевых супрессоров и гены, связанные с опухолевые и играет очень важную роль в патогенезе и прогрессии рака у человека [3], [4] - [6], в том числе рака желудка [7] , [8]. В то же время, накапливая данные убедительно показывают, что метилирование ДНК может быть полезным и мощным биомаркеров в оценке риска развития рака [5], [7], ранняя диагностика [7], прогнозируя прогноз пациентов [7], [8], а также оценку чувствительности к химиотерапевтические лекарственные средства [9]. Наше недавнее исследование и другие исследования показали, что обнаружение циркулирующих метилированных ДНК в крови является мощным и практичным подходом для больных раком [7], [10], [11].
<Р> Х-хромосомой ингибитор апоптоза ( XIAP
) -associated фактор 1 ( XAF1
) является новым негативным регулятором XIAP
, которая меняет роль защиты XIAP на опухолевых клетках [12] - [14]. Потеря XAF1
выражение будет оказывать резистентности опухолевых клеток к апоптозу и способствуют выживанию опухолевых клеток [14] - [17]. Дисфункция XAF1
сообщалось в ряде злокачественных опухолей человека, вероятно, через метилирования промотора [15] - [19], что говорит о его важности в онкогенеза. При раке желудка человека, XAF1
Сообщалось, что часто и значительно вниз регулируется и это вниз регулирование XAF1
вероятно, через ДНК гиперметилированием конкретных сайтов CpG [15], [16 ], [18]. Тем не менее, отчет не доступен о XAF1
метилирования в крови и его потенциальные возможности в качестве биомаркеров. В настоящем исследовании мы рассмотрели XAF1
промотор метилирование спаренных ткани и сыворотки крови из большого панели больных раком желудка, и оценивали циркулирующего метилируется XAF1
в качестве потенциального биомаркера для рака желудка .

Материалы и методы

Заявление по этике
<р> обезличенной образцы человеческих тканей и сыворотки были получены из провинции Чжэцзян человеческие ткани образцов банка. Использование образцов было одобрено Советом по рассмотрению Institutional в Чжэцзян онкологической больницы провинции. Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента в соответствии с требованиями борту нашего учреждения этики. 88 неонкологические добровольцы дали письменное информированное согласие. Часть образцов были из провинции Чжэцзян Народной больницы и первый Народной больницы Chunan County. Совет Институциональный Обзор по медицинской этике провинции Чжэцзян народной больницы и первый Народной больницы Chunan County одобрил метод сбора образцов, включая письменного информированного согласия от всех пациентов, соответственно.

Tissue образцов
<р> Спаренные опухоли и пара-раковая гистологические нормальные ткани (PCHNT) образцы были собраны во время операции от 202 пациентов с первичной аденокарциномы желудка в провинции Чжэцзян онкологической больницы, провинция Чжэцзян народной больницы и первый Народной больницы Chunan Каунти с января 2008 года по декабрь 2009. PCHNT оценивали микроскопически на наличие нормальных клеток и отсутствие диспластических клеток. Ни один из этих случаев не подверглись никакой медицинской помощи перед операцией. Демографические, клинические и гистологические параметры этих случаев были приведены в таблице 1. Модель роста опухолевых клеток была определена в соответствии с классификацией Мин [20]. Все набранные пациенты были прослежены периодически до истечения срока. Образцы антральных слизистая биопсии из 88 нераковых добровольцев по гастроскопии были случайным образом собраны в качестве контроля за тот же период, в том числе 54 мужчин и 34 женщин, средний возраст 52,9 лет. Среди этих добровольцев, 48 пациентов были диагностированы с хроническим гастритом-атрофический. В то же время, парные образцы сыворотки были собраны перед хирургическим вмешательством или эндоскопии.

Анализ Helicobacter Pylori ( H. Пилори
) Инфекция
<р> Биопсии были получены из всех пациентов, перенесших эндоскопическое исследование , H
. статус пилори
определяли с помощью быстрого уреазного теста и методы окрашивания Гимза [21], [22]. Это рассматривалось как H
. пилорусов
инфекции, когда оба теста были положительными, и образцы с одного положительного были исключены для статистического анализа [22].

в режиме реального времени RT-PCR
<р> Выражение мРНК из XAF1
анализировали в режиме реального времени RT-PCR [23]. Тотальную РНК экстрагировали с помощью Trizol (Gibco). В общей сложности 3 мкг тотальную РНК подвергали обратной транскрипции с использованием M-MLV обратной транскриптазы (Promega). Глицеральдегид фосфат дегидрогеназы ( GAPDH
) была выбрана в качестве внутреннего эталона. Последовательности XAF1
Праймеры были следующими: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 '(R) 5'- GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
последовательности праймеров были следующими: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 '(R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. 2 -ΔΔCt метод был использован для расчета относительных изменений в экспрессии генов.

Иммуногистохимическое Окрашивание
<р> выражение белка XAF1 определяли с помощью иммуногистохимического анализа с XAF1 моноклональных антител (Santa Cruz Biotechnology ). Иммуногистохимическое окрашивание на XAF1 проводили с использованием репрезентативных залитых парафином образцов из 202 больных ГХ. После депарафинизации, поиска антигена в 0,01 М цитратном буфере, и инактивацию эндогенных пероксидазной активности в 3% Н <суб> 2O <суб> 2 /метанол, мы инкубировали слайдам с антителом для XAF1 при температуре 4 ° С в течение ночи, и иммуногистохимического окрашивания, в соответствии со стандартной комплексной методики avidinbiotin-пероксидаза, проводили с использованием 3,3'-диаминобензидина (DAB) в качестве хромогена. Ядра контрастному окрашиванию гематоксилином. Иммуногистохимического окрашивания счет (МКС) определяется тремя независимыми патологоанатомами, сочетающих частоту и интенсивность окрашивания следующим образом [24], [25]: нет окрашивания не забит как 0, 1~10% клеток окрашенных оценивали как 1, 11~50% как 2, 51~80% в 3 и 81~100% по 4. Окрашивание интенсивность оценивается по шкале от 0 до 3, с 0, отрицательные; 1, слабый; 2, умеренный; и 3, сильный. Когда есть мультифокальной иммунореактивности и существуют значительные различия в интенсивности окраски между фокусами, регистрировали среднее наименее интенсивного и наиболее интенсивного окрашивания. Исходные данные были преобразованы в МКС путем умножения счет частоты и оценку интенсивности окрашивания. Теоретически, МКС может лежать в диапазоне от 0 до 12. МКС из 9~12 считался сильной иммунореактивности, 5~8 считался умеренным, 1~4 считался слабым, и 0 был забит как отрицательный. Разделы, в которых окрашивание не может быть хорошо охарактеризованы считались сомнительными.

Вестерн-блот анализ
<р> Спаренные опухоли и PCHNT образцы 20 случаев были выбраны случайным образом из 202 больных раком желудка для Вестерн-блот-анализа. Общий белок экстрагировали и затем количественно с помощью метода Лоури [26]. Вестерн-блот-анализ проводили с использованием анти-XAF1 моноклональных антител (Santa Cruz, CA) в соответствии с предыдущим докладом [6]. β-тубулина был подан в качестве внутреннего контроля.

ДНК Extraction, бисульфит Модификация и в режиме реального времени Метилирование Specific-PCR (MSP)
<р> Серийные срезы 5 мм, которые содержали карцинома и неопухолевых ткани были установлены на непокрытые предметные стекла и сушили при 37 ° с в течение ночи. После депарафинизации и окрашивания гематоксилином и эозином (H &Amp; E), мы собрали 5000 ядер от 5 до 10 последовательных секций, используя 27G иглу. Собранные ядра обрабатывали 40 мл 200 мг /мл протеиназы К (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури), при 42 ° С, в течение 72 ч. Парамагнитного технологии шарик (AxyPrep Mag крови гДНК комплект, Axygen Scientific, Inc., Юнион-Сити, штат Калифорния) был использован для выделения геномной ДНК из свежей крови в соответствии с протоколом комплекта. Протокол состоит из следующей стадии: лизис, переплет, промывки и элюирования. Загрязняющие вещества удаляются при связывании и промывки. Качество ДНК оценивали с помощью /соотношение А260 280 в NanoDrop ND-1000 спектрофотометр (NanoDrop Technologies, Inc., Уилмингтон, DE), целостность ДНК проверяли с помощью денатурирующих электрофореза в агарозном геле.

ДНК были изменены бисульфит натрия с использованием набора EpiTect бисульфит (Qiagen Inc.) в соответствии с инструкциями мануфактуры. Модифицированные ДНК были проанализированы в реальном времени МПВ на ABI7500 ПЦР (ABI Co.) с использованием набора SYBR Премикс Taq ExTaq (Takara Co. Ltd). XAF1
метилирования и unmethylation специфические праймеры были сконструированы следующим образом: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'- CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Человеческой геномной ДНК (NEB) обрабатывают SssI метилтрансферазе в пробирке был использован в качестве положительного контроля. Периферийный ДНК в крови от здорового субъекта, использовали в качестве отрицательного контроля. Процент метилированных ДНК в образцах были рассчитаны в соответствии с ссылкой, как и предыдущие описанные [27], [28]. Индекс метилированный ДНК оценивали в соответствии с процентом метилирования ДНК; 0, ≪ 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; и 4, > 80%. Индекс оценка 0 рассматривается как unmethylation ДНК и оценки 1-4 были рассмотрены гиперметилированы соответственно [7], [27]. 20% отрезан порог для гиперметилированием ДНК была основана на контрольных образцах нормального и внутреннего контроля качества, полученных в ходе анализа ССП в режиме реального времени.

Культура клеток и наркотиков Лечение
<р> желудка человека линии раковых клеток (АГС и КАТО-III), культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед /мл пенициллина и 100 ед /мл стрептомицина при 37 ° с и 5% CO <югу> 2, соответственно. Культивируемые клетки обрабатывали 5-аза-2'-дезоксицитидин (5-аза-СРВ) (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 1,0 мкмоль /л. Трихостатин А (ТСА) (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 20 нг /мл вводили после обработки 5-аза или только в течение 24 ч. Клетки собирали и подвергали ДНК, РНК и очистки белков и последующего анализа.

Статистический анализ
<р> SPSS 17,0 статистического программного обеспечения был принят для анализа данных. Счетные сравнения данных между группами были подвергнуты <ЕМ> χ
2 испытания и точный критерий Фишера. Анализ выживаемости был computered с помощью метода Каплана-Мейера и значительные уровни были оценены с помощью теста лог-ранга. Одномерный анализ с регрессионной модели Кокса использовали для определения идентифицированных прогностических факторов, и многомерный анализ с регрессионной модели Кокса использовали для изучения комбинированных эффектов. Для всех статистических анализов, р
значения &л;. 0,05 рассматривались как статистическая значимость

Результаты

понижающую регуляцию XAF1
в первичном желудочной Опухоли
<р> Для исследования XAF1
профиль экспрессии генов, мы исследовали экспрессию мРНК XAF1
в 88 нераковых добровольцев и 202 первичных раковых тканей желудка и их соответствующих PCHNTs. Как показано на рисунке 1А, то XAF1
выражение было значительно снижено в образцах рака желудка по сравнению с таковым в нормальных управления и PCHNTs ( р и л;
0,001). Тем не менее, не было никаких существенных различий в XAF1
выражение в PCHNTs по сравнению с контрольной группой нераковых.

Кроме того, XAF1
выражение было значительно ниже в поздних стадиях раковых заболеваний (стадия III /IV), чем в ранних опухолей стадии (стадия I /II) ( р и л;
0,0001, рис S1A) и был значительно ниже в слабо дифференцированных опухолей, чем в хорошо /умеренно дифференцированные опухоли ( р и л;.
0,0001, Рисунок S1B)
<р> Чтобы проверить уровень белка XAF1 в желудочном раковых тканей, мы провели иммуногистохимический анализ в 202 желудочных раковых тканей и их соответствующих PCHNTs. Выражение Nuclear XAF1 последовательно присутствуют в нормальном желудочном эпителии, показывая высокие баллы иммунореактивных. Экспрессии белка XAF1 был обнаружен в высоком уровне в 97,5% (197/202) из ​​PCHNTs (Фиг.1В). Тем не менее, высокий уровень экспрессии белка XAF1 был обнаружен только в 16,8% (34/202) желудка раковых тканей; большинство желудочных раковых тканей отсутствовали или на низком уровне белка XAF1 (рис 1C). Иммуногистохимические результаты приведены в таблице 1. иммуногистохимического окрашивания счет в желудочных тканях рака была значительно ниже, чем в PCHNTs или нормальным контролем ( р &ЛТ;
0,0001, рис 1D). Потеря белка XAF1 достоверно коррелирует с H. Pylori
инфекция, размер опухоли, гистологической дифференцировки, лимфатической инвазии, венозная инвазия, инвазивный глубина, узел метастаз лимфатический, отдаленных метастазов и клинической стадии (Таблица 1) (все р и л;
0,05)
.

иммуногистохимические результаты 20 желудочного раковых тканей были дополнительно подтверждены с помощью Вестерн-блот-анализа. Представительные западные блоттинга в двух случаях были показаны на рисунке 1E. Относительное количество экспрессии белка XAF1 нормализовали к бета-тубулина тех же образцов. Средний уровень XAF1 белка в 20 раковых тканей желудка была значительно ниже, чем в PCHNTs ( р
&л; 0,05). (Рисунок 1F)

Promoter Гиперметилирование XAF1
в первичной опухоли желудка
<р> чтобы исследовать молекулярные механизмы для XAF1
молчание рака желудка, мы применили технологию MSP в режиме реального времени для изучения состояния ДНК метилирования XAF1 <бр> промоутер. Частота XAF1
гиперметилирование в желудочном раковых тканей, соответствующих PCHNTs и управления нераковых были 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) и 5,7% (5/88), соответственно. Гиперметилирование частота XAF1
в раковых заболеваний значительно выше, чем в PCHNTs и управления нераковых (все р
&л; 0,0001, рисунок 2).
<Р> Следует отметить метилированный статус XAF1
достоверно коррелирует с некоторыми клинико-патологических параметров при раке желудка, таких как метастазов в лимфатических узлах, T-стадии, H
. пилори
инфекция и т.д. (все р и л;
0,05, таблица 2). Нет существенной корреляции между гиперметилированием XAF1
и пол, возраст на момент постановки диагноза, свидетельствовал сайт опухоли и отдаленных метастазов (все р
> 0,05). (Таблица 2)

XAF1
Promoter Гиперметилирование связано с его Транскрипционная шумопоглотительные в Клетки рака желудка
<р> Чтобы исследовать отношения между XAF1
метилирования и XAF1
выражения, мы сравнили XAF1
уровень метилирования с определяется XAF1
уровни уровня мРНК и белка либо путем иммуногистохимического анализа (рис 3А) или вестерн-блоттинга (рис 3B) с помощью корреляционного анализа Спирмена. Как показано на фигуре 3А, экспрессии белка XAF1 (определяется иммуногистохимического анализа) в 202 тканей GC тесно коррелировало с XAF1
Уровень мРНК [Л.Г. (Т /N)], (определено методом ОТ-ПЦР) ( γ
= 0,841, р и л;
0,0001). Что более важно, XAF1
уровень метилирования в значительной степени связано с XAF1
уровня мРНК ( γ
= - 0,846, <ет> р и л;
0,0001) и белка XAF1 уровень ( γ
= -0,969, р и л;
0,0001). Аналогичные результаты были получены при анализе корреляции XAF1
метилирования промоторов и экспрессии белка XAF1 определяли с помощью Вестерн-блот-анализа (рис 3B). Эти результаты сильно предъявлены обвинения, что XAF1
выражение регулируется XAF1
метилирования промотора.

5-Аза-корд Администрирование Восстанавливает Выражение XAF1

Для дальнейшего подтверждения эпигенетической регуляции XAF1
выражение, AGS и КАТО-III клетки обрабатывали 5-аза-корд и /или АСП. XAF1
экспрессия мРНК была возобновлена ​​в обоих желудочных линиях раковых клеток, сопровождающееся деметилирования XAF1
промотор (Рисунок 4), указывая, что XAF1
транскрипционно притихли в этих клетках с помощью гиперметилированием ДНК. Интересно отметить, что лечение АСП в одиночку был эффективен при восстановлении XAF1
выражение в AGS и КАТО-III без существенного изменения XAF1
уровень метилирования, предполагая, что модификации гистонов могут также принимать участие в регулировании XAF1
выражение. Однако введение TSA следующие 5-аза-корд имел аддитивный эффект в восстановлении экспрессии генов с дальнейшим снижением уровня метилирования XAF1
. Эти результаты согласуются с недавними исследованиями, предположили, что TSA может иметь эффект деметилирования таким образом, ген-специфического [5]. Вестерн-блот анализ с использованием AGS клеток, в качестве модели, подтвердили повышающей регуляции XAF1 белков следующих 5-аза-корд и 5-аза-корд лечения /TSA (Рисунок 4).

Обнаружение Циркулирующие XAF1
метилирования
<р> Мы обнаружили высокую частоту XAF1
метилирование первичного рака желудка (83,2%), предполагая, что это может быть хорошим биомаркером, если XAF1
метилирования может быть обнаружен в сыворотке крови. Таким образом, мы рассмотрели XAF1
метилирование совпавших сыворотки ДНК из 202 пациентов GC. XAF1
метилирование был обнаружен в 141 (69,8%) в сыворотке крови ДНК из 202 больных раком желудка (рисунок 5). В отличие от этого, XAF1
метилирование не обнаружен в сыворотке крови ДНК из 88 контрольных нераковых.

Далее, мы подтвердили последовательность в XAF1
метилирование между опухолевых тканей и соответствующая сыворотка. В 168 случаях, которые показали XAF1
метилирования в опухолевых тканях, 141 отображается XAF1
метилирование в их парного сыворотке, давая последовательность 83,9% между ними. А в 34 больных раком желудка без XAF1
метилирование в их желудочных раковых тканей, не метилирование не было обнаружено во всех сывороточных ДНК (рис S2).

XAF1
метилирования как биомаркер в диагностике рака желудка
<р> Для того, чтобы оценить значение XAF1
метилирование в качестве биомаркеров в диагностике GC, были построены кривые приемник операционных характеристик (ROC) и рассчитанную площадь под кривой (АУК) значения с использованием ДНК-метилирования данные из обеих тканей GC и сывороток. И ROC анализ XAF1
метилирования в тканях и сыворотке крови выявили значительный дискриминационный потенциал (рисунок 6); АУК значение тканей XAF1
метилирование было 0,849 (95% доверительный интервал, 0.806-0.892; р
&л; 0,0001), АУК значение сыворотки AXF1
метилирование был 0,909 (95% доверительный интервал, 0.875-0.942; р
&л; 0,0001).
<р> Кроме того, как и XAF1
статус метилирования в желудочном раковых тканей и сывороток достоверно коррелирует с метастазов в лимфатических узлах, Т-стадии, клинической стадии и других клинико-патологических параметров (все р &ЛТ;
0,05, таблица 2)

XAF1
метилирования. коррелируют с прогноз у больных раком желудка
<р> достоверная корреляция XAF1
метилирование со многими клинико-патологических параметров (таблица 2) предположил, что она может ассоциировать с прогнозом у больных раком желудка. До наступления срока последующей деятельности, 113 из 168 пациентов с XAF1
гиперметилирование в желудочном раковых тканей пошел быстрым прогрессированием болезни или смерти. Медиана выживаемости без признаков заболевания (ДФС) было всего 23,4 месяцев. В отличие от этого, в 34 пациентов без XAF1
гиперметилирование в их желудочных раковых тканей, только 5 пациентов были ухудшается, и медианный ДФС был 39,6 месяцев. Анализ Каплана-Мейера показал, что у пациентов с XAF1
гиперметилирование в их желудочных тканях рака проявляли очевидный хуже, чем выживание, что без XAF1
гиперметилирования ( р &ЛТ;
0,0001) (рис 7А). Аналогичным образом, анализ Каплана-Мейера показал, что у пациентов с положительной сыворотки XAF1
метилирование имели значительно более низкие, чем ДФС, что у больных без сыворотки XAF1
метилирования ( р
&л; 0,0001 ) (рисунок 7B), указывая, что XAF1
промотор метилирование в сыворотке крови был неблагоприятным прогностическим фактором для больных раком желудка.
<р> Cox регрессионный анализ показал, что XAF1
метилирование в сыворотке крови является независимым фактором на выживаемость пациентов: пациенты с XAF1
метилирование был худший прогноз ( р и л;
0,0001; отношение рисков 5,710; 95% ДИ, 3.474~9.383). Кроме того, TNM этапы и возраст на момент постановки диагноза можно было бы рассматривать в качестве фактора, влияющего прогноза при раке желудка, только тогда, когда эффект XAF1
метилирование была ликвидирована. Кроме того, циркулирующий метилируется XAF1
в крови имели большее влияние на прогноз, чем в TNM стадии (таблица S1).

Положительный Переход Циркуляционный XAF1
метилирования Предсказывает Опухоль Рецидив и неблагоприятный прогноз

Среди 202 пациентов, которые были оценены для предоперационной циркулирующей XAF1
метилирование, 72 пациентов получили последующие осмотры циркулирующего XAF1
метилирование 2~5 раз с интервалом 1~6 месяцев после операции. Среди 12 больных рецидивирующей, 10 пациентов отмечалось отрицательное к положительному переходу в XAF1
статус метилирования в их сыворотке крови, а два других всегда показали положительный результат на XAF1
метилирование, предполагая, что мониторинг XAF1
метилирование в сыворотке крови может быть хорошим маркером для прогнозирования рецидива опухоли (таблица 3).

Обсуждение

XAF1
( XIAP
-associated фактор 1) является новым <ЕМ> XIAP
связывающий белок, который может нарушить совмещение XIAP
с каспаз, ликвидирует его защиту на опухолевые клетки и приводит к апоптозу опухолевых клеток [12] - [ ,,,0],14]. Антиапоптоз функция XIAP
определяется отношением уровней экспрессии XIAP
против XAF1
[15]. Снижение экспрессии или молчание XAF1
является частым событием в опухолях человека [16] - [19]. В настоящем исследовании мы впервые подтвердили, что XAF1
экспрессии генов был значительно понижающей регуляции как в уровне мРНК и уровня белка в большой панели первичных раковых тканей желудка, и понижающей регуляции XAF1
выражение было в значительной степени связано с опухолевыми стадии, метастаз и так далее, вовлекая потерю XAF1
функции в опухолевой прогрессии. Это согласуется с другими отчетами исследований [17] - [19]. Для того, чтобы изучить молекулярные механизмы, ответственные за XAF1
тишине, мы исследовали XAF1
промоутер метилирование в большой панели желудка раковых тканей (<ет> п
= 202) и обычные средства управления ( N
= 88) с использованием технологии MSP в режиме реального времени. Мы обнаружили высокую частоту (83,2%) ДНК гиперметилированием XAF1
в желудочном раковых тканей. ДНК гиперметилирование XAF1
значительным коррелировать с понижающей регуляции XAF1
как в мРНК и уровня белка в раковых тканях желудка (рисунок 3). Кроме того, лечение 5-Аза-корд значительно восстановлена ​​ XAF1
выражение XAF1
притихли желудка клеточных линий рака (рисунок 4). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что частое понижающего регулирование XAF1
в желудочном раковых клеток регулируется его гиперметилированием промотора. Интересно отметить, что лечение клеток рака желудка с TSA, ингибитор гистондезацетилазы также восстановлены XAF1
выражение, сами по себе или в сочетании с обработкой 5-аза-корд, указывая, что модификация гистонов также могут быть вовлечены в XAF1 <. BR> регулирование
<р> метилирование ДНК может быть использована в качестве потенциального биомаркера опухоли в различных злокачественных опухолях человека [3] - [11], [23]. Присутствие ДНК бесклеточной циркулирующих в периферической крови было описано у больных со злокачественными процессами и активного высвобождения ДНК опухоли в кровоток сообщалось [29] - [31]. Многочисленные исследования показали, опухолевые специфические изменения в циркулирующей ДНК оправился от плазмы или сыворотки крови больных с различными злокачественными опухолями, которые соответствуют генетические изменения, присутствующие в первичных опухолях, нахождения, который имеет потенциал для молекулярной диагностики и прогнозирования [29] - [32]. Маркеры нуклеиновых кислот, описанные в циркулирующей ДНК включают онкоген мутации, микросателлитных изменения, генная перестроек и эпигенетические изменения, такие как аномальным гиперметилированием промотора [7], [8], [30] - [34]. На основании этих наблюдений, особенно мы обнаружили высокую частоту XAF1
метилирования ДНК в раковых тканях желудка (83,2%), мы решили исследовать возможность использовать XAF1
промотор метилирование сыворотка в качестве биомаркера у больных раком желудка. Во-первых, мы продемонстрировали большую последовательность при обнаружении XAF1
метилирование между сывороткой и первичных раковых тканей желудка. Далее мы проанализировали возможность использования циркулирующего метилируется XAF1
в качестве диагностического маркера с помощью анализа ROC. AUC (площадь под кривой) из 0,909 продемонстрировали высокую диагностическую ценность обнаружения XAF1
метилирования в образцах сыворотки. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что обнаружение XAF1
метилирование в циркулирующих ДНК может быть использована в качестве неинвазивного биомаркера для диагностики рака желудка. Кроме того, наши результаты также показали, что положительное XAF1
метилирование в сыворотке крови был независимым прогностическим фактором; предсказания плохой прогноз. Более интересно, переход от отрицательного к положительному циркулирующего XAF1
метилирование после операции была в значительной степени связано с рецидивом опухоли. Эти данные указывают на то, что обнаружение XAF1
метилирование в циркулирующих ДНК в сыворотке крови также может быть биомаркером опухоли для предсказания прогноза у больных раком желудка »и для мониторинга рецидива опухоли после хирургического лечения. Поскольку число пациентов прошли это наблюдение в сыворотке крови исследование было небольшим, необходимы дальнейшие исследования в большом объеме выборки числа пациентов необходимо, чтобы подтвердить этот интересный вывод и оптимизировать стратегию и протокол для этой цели. В любом случае, по сравнению с традиционными способами, такими как гастроскопия для обследования больных раком желудка, самой примечательной особенностью циркулирующего метилируется XAF1
обнаружение является эффективным, быстрым, низкая стоимость, неинвазивный, не разрушая окружающую среду, высокая диагностики созвучно скорость и так далее, и как таковые демонстрируют важные перспективы применения в будущем.

Выводы
<р> Дисфункция XAF1
часто и регулируется с помощью XAF1
промотор гиперметилирование при раке желудка. Циркулирующий метилируется <ЕМ> XAF1
ДНК была связана с распространенностью опухоли и злокачественной прогрессии, которая может быть ценным биомаркеров для диагностики рака желудка, прогнозируя прогноз пациентов и мониторинга рецидива опухоли после хирургического лечения.

Поддержка информация Рисунок S1
.
JPG. А, XAF1
уровень экспрессии гена был ниже в поздних стадиях рака желудка (стадия III /IV), чем в начале рака желудка (стадия I /II). B, XAF1
уровень экспрессии генов в плохо дифференцированным раком желудка ниже, чем в хорошо /умеренно (хорошо /Mod) дифференцированный рак желудка, <ет> р и л;
0,05
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF) Рисунок S2
.
JPG. Корреляционный анализ XAF1
результаты гиперметилирование между GC тканей и парного периферической крови (сывороток)
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0067195.s002
(TIF)
Таблица S1.
XLS. Многофакторный анализ выживаемости клинико-патологических данных 202 желудка случаев рака.

• PLoS ONE: Новый подклассификация pT4 рака желудка Согласно Ширина серозной Invasion
• PLoS ONE: Янус киназ 2 полиморфизмы связаны с риском у пациентов с раком желудка в китайском Population