PLOS ONE: Circulating méthylé ADN XAF1 Indique un mauvais pronostic pour gastrique Cancer

Résumé

Contexte

ADN méthylé dans les fluides peut être un biomarqueur approprié pour les patients atteints de cancer. XAF1
a été montré pour être fréquemment régulés à la baisse dans le cancer gastrique humain (GC). Ici, nous avons étudié si XAF1 de la méthylation dans GC pourrait être un biomarqueur utile.

Méthodes

en temps réel RT-PCR a été utilisée pour détecter les XAF1
expression de l'ARNm; immunohistochimie et western blot ont été utilisés pour examiner XAF1 l'expression des protéines dans les tissus du GC (n = 202) et leurs tissus normaux histologiques para-cancéreuses correspondantes (PCHNTs). méthylation en temps réel spécifique de PCR a été utilisée pour étudier promoteur de la méthylation de XAF1 dans le même panneau de tissus GC, leurs PCHNTs et sérums.

Résultats

Nous confirmé fréquents XAF1
régulation à la baisse à la fois des taux de protéines dans les tissus GC ARNm et par rapport aux témoins et PCHNTs normales. XAF1 de l'hyperméthylation a été attestés à 83,2% (168/202) des tissus GC et 27,2% (55/202) de PCHNTs, alors qu'aucune méthylation a été détectée dans les 88 témoins normaux. Le niveau de méthylation dans les tissus GC était significativement plus élevé que celui PCHNTs ( p < 0,05
). L'hyperméthylation de XAF1
significativement corrélée avec la régulation négative de XAF1
dans les tissus du GC dans les deux niveaux d'ARNm et de protéine ( p
< 0,001 chacun). De plus, nous avons détecté haute fréquence de XAF1 de la méthylation (69,8%, 141 sur 202) dans les ADN de sérums provenant des mêmes patients, tandis que les ADN de sérums provenant de 88 témoins non-tumorales ont été négatifs pour XAF1
méthylation. Le XAF1 de la méthylation dans les deux tissus GC et dans le sérum pourrait être un bon biomarqueur pour le diagnostic de GC (AUC = 0,85 pour le tissu et l'ASC = 0,91 pour les sérums) et significativement corrélée à un mauvais pronostic ( p
< 0,001). En outre, négatif à positif transition de XAF1 de la méthylation dans les sérums fortement associées à une récidive tumorale.

Conclusions

1) Dysfonctionnement de XAF1 après la chirurgie
est fréquente et est réglementée par le promoteur hypermethylation
XAF1; 2) Détection de circuler méthylé XAF1 de ADN dans le sérum peut être un biomarqueur utile pour le diagnostic, l'évaluation des résultats (le pronostic et la récurrence du patient) pour les patients du GC

Citation:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Circulant méthylé XAF1 de l'ADN indique un mauvais pronostic pour le cancer gastrique. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195

Editeur: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu 12 Mars 2013; Accepté: 16 mai 2013; Publié le 27 Juin, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Ling et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche a été soutenue par une subvention du projet science et technologie générale de la province du Zhejiang (. pas 2009C33143), et en partie par une subvention du Talent Backbone du Zhejiang Medicine Programmes provinciaux et plate-forme d'hygiène (. 2011RCA009 pas). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'un des cancers les plus fréquents en Chine, avec une forte incidence et de la mortalité, ce qui représente environ 10% de toutes les tumeurs malignes [1]. tumorigenèse gastrique est un processus en plusieurs étapes complexes impliquant des altérations de nombreux gènes [2]. Aberrant méthylation de promoteur est l'un des principaux mécanismes pour réduire au silence des gènes suppresseurs de tumeur et les gènes de tumeurs associées et joue un rôle très important dans la pathogenèse et la progression des cancers humains [3], [4] - [6], y compris le cancer gastrique [7] , [8]. Pendant ce temps, les données accumulant fortement suggéré que méthylation de l'ADN pourrait être biomarqueur utile et puissant dans l'évaluation du risque de cancer [5], [7], le diagnostic précoce [7], prédire le pronostic des patients [7], [8], et l'évaluation de la sensibilité à la des médicaments chimiothérapeutiques [9]. Notre étude récente et d'autres recherches ont démontré que la détection de l'ADN circulant méthylé dans le sang est une approche puissante et pratique pour les patients atteints de cancer [7], [10], [11].

X-linked inhibiteur de l'apoptose ( XIAP
) -Associated facteur 1 ( XAF1
) est un nouveau régulateur négatif de la XIAP
, qui inverse le rôle de protection de XIAP sur les cellules tumorales [12] - [14]. La perte de XAF1 de l'expression rendra les cellules tumorales à l'apoptose et la résistance à favoriser la survie des cellules tumorales [14] - [17]. Dysfonctionnement de XAF1
a été rapporté dans plusieurs cancers humains probablement par la méthylation du promoteur [15] - [19], ce qui suggère son importance dans la tumorigenèse. Dans le cancer gastrique humain, XAF1
a été signalé à être fréquemment et considérablement réglementés vers le bas, et ce bas-régulation de XAF1
probablement par l'ADN hypermethylation des sites CpG spécifiques [15], [16 ], [18]. Toutefois, aucun rapport n'est disponible sur XAF1 de la méthylation dans le sang et son potentiel en tant que biomarqueur. Dans la présente étude, nous avons examiné promoteur de la méthylation de XAF1 dans des échantillons de tissus et de sérum appariés à partir d'un large panel de patients atteints de cancer gastrique, et évalué circulant méthylé XAF1
comme un biomarqueur potentiel pour le cancer gastrique .

Matériel et méthodes

Déclaration d'éthique

échantillons de tissus humains de-identifiés et les sérums ont été obtenus à partir de la province du Zhejiang tissus humains banque de spécimens. L'utilisation de spécimens a été approuvé par le comité d'examen institutionnel à l'hôpital Zhejiang Province du cancer. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque patient en conformité avec les exigences du conseil d'éthique de notre institution. 88 volontaires non-cancéreuses ont donné par écrit leur consentement éclairé. Une partie des échantillons provenaient de l'hôpital du Zhejiang populaire de la province et de l'Hôpital des Premiers Peuples de Chunan County. Le comité d'examen institutionnel sur l'éthique médicale de l'hôpital du Zhejiang populaire de la Province et de l'Hôpital des Premiers Peuples de Chunan County a approuvé la méthode de collecte de l'échantillon, y compris le consentement éclairé de tous les patients, respectivement.

Tissue Specimen

tumorales et para-cancéreuse des tissus normaux histologiques appariés (PCHNT) échantillons ont été prélevés au moment de la chirurgie de 202 patients atteints d'un adénocarcinome gastrique primaire à l'Hôpital du Zhejiang province Cancer, Hôpital du Zhejiang populaire de la province et de l'Hôpital des Premiers Peuples de Chunan comté de Janvier 2008 à Décembre 2009. le PCHNT a été évaluée au microscope pour détecter la présence de cellules normales et à l'absence de cellules dysplasiques. Aucun de ces cas n'a subi aucun traitement médical avant la chirurgie. Les paramètres démographiques, cliniques et histopathologiques de ces cas ont été présentés dans le tableau 1. Le modèle de croissance des cellules tumorales a été déterminée selon la classification de Ming [20]. Tous les patients recrutés avaient été suivis périodiquement jusqu'à la date d'échéance. Antraux échantillons de biopsie muqueuse de 88 volontaires non cancéreux par gastroscopie ont été recueillies au hasard que les contrôles au sein de la même période, dont 54 hommes et 34 femmes, avec un âge moyen de 52,9 ans. Parmi ces volontaires, 48 ​​patients ont été diagnostiqués avec la gastrite non-atrophique chronique. Pendant ce temps, des échantillons de sérum appariés ont été recueillies avant la chirurgie ou l'endoscopie.

Analyse de Helicobacter Pylori ( H. Pylori
) Infection

Les biopsies ont été obtenues à partir de tous les patients qui ont eu un examen endoscopique . H
. statut pylori
a été déterminée par un test d'uréase rapide et Giemsa méthodes de coloration [21], [22]. Il a été considéré comme H
. infection pylori
lorsque les deux tests ont été positifs, et les échantillons avec un seul positif ont été exclus de l'analyse statistique [22].

en temps réel
RT-PCR

L'expression de l'ARNm de XAF1
a été analysé par temps réel RT-PCR [23]. Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du Trizol (Gibco). Un total de 3 ug d'ARN totaux a été soumis à une transcription inverse en utilisant M-transcriptase inverse de MLV (Promega). Le phosphate déshydrogénase de glycéraldéhyde ( GAPDH
) a été choisi comme référence interne. Les séquences de XAF1 de les amorces sont les suivantes: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. Les séquences d'amorces de GAPDH sont les suivantes: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. Le 2 ^{-ΔΔCt méthode a été utilisée pour calculer les changements relatifs dans l'expression des gènes.}

Coloration immunohistochimique

L'expression de la protéine XAF1 a été déterminée par analyse immunohistochimique avec l'anticorps monoclonal XAF1 (Santa Cruz Biotechnology ). Une coloration immunohistochimique pour XAF1 a été effectuée en utilisant des échantillons inclus dans la paraffine représentant des 202 patients atteints de GC. Après déparaffinage, l'extraction de l'antigène dans un tampon 0,01 M de citrate, et l'inactivation de l'activité de peroxydase endogène dans 3% de H _{2 O 2 /méthanol, on fait incuber les lames avec l'anticorps pour XAF1 à 4 ° C pendant une nuit, et la coloration immunohistochimique, selon une technique complexe de peroxydase avidinbiotin standard a été réalisée en utilisant la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comme chromogène. Nuclei ont été contre l'hématoxyline. Le score de coloration immunohistochimique (ISS) est déterminée par trois pathologistes indépendantes combinant fréquence et l'intensité de coloration comme suit: [24], [25]: aucune coloration est notée comme 0, 1~10% des cellules colorées a marqué comme 1, 11~50% comme 2, 51~80% en 3 et 81~100% en 4. intensité de coloration est évaluée sur une échelle de 0 à 3, 0, négative; 1, faible; 2, modérée; et 3, forte. Quand il y a immunoréactivité multifocale et il y a des différences significatives dans l'intensité de coloration entre les foyers, la moyenne de la coloration moins intense et la plus intense a été enregistré. Les données brutes ont été converties à l'ISS en multipliant le score de fréquence et le score d'intensité de coloration. Théoriquement, l'ISS pourrait aller de 0 à 12. Une ISS de 9~12 immunoréactivité forte a été considéré, 5~8 a été considérée comme modérée, 1~4 était considéré comme faible, et 0 a été marqué comme négatif. Les articles dont la coloration ne pouvait pas être bien caractérisés ont été considérés comme équivoques.}

Analyse Western Blot

échantillons tumoraux appariés et PCHNT de 20 cas ont été choisis au hasard parmi 202 patients atteints de cancer gastrique pour l'analyse western blot. La protéine totale a été extraite et ensuite quantifié en utilisant la méthode de Lowry [26]. analyse par Western blot a été réalisée en utilisant des anticorps monoclonaux anti-XAF1 (Santa Cruz, CA) selon le rapport précédent [6]. β-tubuline a été servi comme un contrôle interne.

Extraction d'ADN, bisulfite Modification et méthylation en temps réel spécifique PCR (MSP)

sections série de 5 mm qui contenaient un carcinome et non néoplasique les tissus ont été montées sur des lames de verre non revêtues et séchées à 37 ° C pendant une nuit. Après déparaffinage et la coloration à l'hématoxyline et l'éosine (H & E), nous avons recueilli 5000 noyaux de 5 à 10 sections en série à l'aide d'une aiguille de 27G. Les noyaux recueillis ont été traités avec 40 ml de 200 mg /ml de proteinase K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) à 42 ° C, pendant 72 heures. La technologie de bille paramagnétique (kit AxyPrep Mag Sang ADNg, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) a été utilisé pour isoler l'ADN génomique à partir de sang frais selon le protocole du kit. Le protocole consiste en les étapes suivantes: la lyse, la fixation, le lavage et l'élution. Les contaminants sont éliminés au cours des étapes de liaison et de lavage. La qualité de l'ADN a été évaluée par le rapport A260 /280 rapport au spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), l'intégrité de l'ADN a été vérifiée par électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose.

ADN ont été modifiés par bisulfite de sodium en utilisant le kit EpiTect bisulfite (Qiagen Inc.) suivant les instructions de manufacture. Les ADN modifiés ont été analysés par MSP en temps réel sur la PCR ABI7500 (ABI Co.) en utilisant le kit Taq SYBR Prémélange ExTaq (Takara Co. Ltd.). méthylation et méthylation des amorces spécifiques de XAF1 ont été conçus comme suit: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. L'ADN génomique humain (l'ONÉ) traités par SssI méthyltransférase in vitro a été utilisé comme témoin positif. Un ADN du sang périphérique provenant d'un sujet sain a été utilisé comme témoin négatif. Le pourcentage d'ADN méthylé dans les échantillons ont été calculées d'après les références que précédemment décrit [27], [28]. Indice méthylé ADNs a été évaluée en fonction du pourcentage de méthylation de l'ADN; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% à 80%; et 4, > 80%. Le score de l'indice de 0 est considéré comme l'ADN méthylation et scores 1-4 ont été considérés comme hyperméthylé, respectivement [7], [27]. Le seuil de 20% coupé pour l'ADN hypermethylation a été basée sur des échantillons de contrôle normaux et des contrôles de qualité internes obtenus dans l'analyse du MSP en temps réel.

Culture cellulaire et drogues Traitement

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine (AGS et KATO-III) ont été cultivées dans un milieu RPMI1640 complété avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U /ml de pénicilline et 100 U /ml de streptomycine à 37 ° C et 5% de CO _{2, respectivement. Les cellules cultivées ont été traités par 5-aza-2'-désoxycytidine (5-aza-CdR) (Sigma-Aldrich) à une concentration finale de 1,0 pmol /L. Trichostatine A (TSA) (Sigma-Aldrich) à une concentration finale de 20 ng /ml a été administré après le traitement par 5-aza ou seul pendant 24 h. Les cellules ont été recueillies et soumises à l'ADN, l'ARN et la purification des protéines et des analyses ultérieures.}

Analyse statistique

SPSS 17.0 logiciel statistique a été adopté pour l'analyse des données. Comptage des comparaisons de données entre les groupes ont été soumis à la χ
^{2 tests et le test exact de Fisher. L'analyse de survie a été computered au moyen de la méthode de Kaplan-Meier et des niveaux significatifs ont été évalués au moyen du test du log-rank. Une analyse univariée avec le modèle de régression de Cox a été utilisé pour déterminer les facteurs pronostiques identifiés, et une analyse multivariée sur le modèle de régression de Cox a été utilisé pour étudier les effets combinés. Pour toutes les analyses statistiques, p
valeurs <. 0,05 ont été considérés comme la signification statistique}

Résultats

Down-régulation de XAF1
dans gastrique primaire tumeurs

Pour étudier gène le profil d'expression de XAF1, nous avons examiné l'expression de l'ARNm de XAF1
dans 88 volontaires non-cancéreuses, et 202 tissus de cancer gastrique primaire et leurs PCHNTs correspondants. Comme le montre la figure 1A, le XAF1 de l'expression a été significativement réduite dans les échantillons de cancer gastrique par rapport à celle des témoins et PCHNTs normaux ( p <
0,001). Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans XAF1 de l'expression dans PCHNTs par rapport aux témoins non-cancéreuses.

En outre, XAF1 de l'expression était significativement plus faible dans les tumeurs avancées (stade III /IV) que dans les tumeurs à un stade précoce (stade I /II) ( p <
0,0001, Figure S1A), et était significativement plus faible dans les tumeurs différenciées mal que dans bien /tumeurs modérément différenciés ( p <.
0,0001, Figure S1B)

Pour vérifier le niveau de protéine XAF1 dans les tissus de cancer gastrique, nous avons effectué une analyse immunohistochimique dans les 202 tissus de cancer gastrique et leurs PCHNTs correspondants. expression XAF1 nucléaire était toujours présent dans les épithéliums gastrique normale montrant les scores immunoréactifs élevés. La protéine expression XAF1 a été détectée dans de haut niveau dans 97,5% (197/202) des PCHNTs (figure 1B). Cependant, une forte expression de la protéine XAF1 n'a été détecté dans 16,8% (34/202) des tissus de cancer gastrique; la majorité des tissus du cancer de l'estomac sont absents ou à un faible niveau de protéine XAF1 (figure 1C). Les résultats immunohistochimiques sont résumées dans le tableau 1. Le score de coloration immunohistochimique dans les tissus du cancer gastrique était significativement plus faible que celui PCHNTs ou dans des contrôles normaux ( p < 0,0001
, figure 1D). La perte de la protéine XAF1 significativement corrélée avec H. pylori de l'infection, la taille de la tumeur, la différenciation histologique, envahissement ganglionnaire, invasion veineuse, la profondeur invasive, métastase ganglionnaire, métastases à distance et le stade clinique (tableau 1) (tous les p <
0,05)
.

Les résultats immunohistochimiques de 20 tissus de cancer gastrique ont été confirmées par analyse par transfert de western. Les résultats de Western blot représentatifs dans deux cas ont été présentés à la figure 1E. La quantité relative de XAF1 expression de la protéine a été étalonnée par rapport à la β-tubuline des mêmes échantillons. Le niveau de protéine XAF1 moyenne dans 20 tissus de cancer gastrique était significativement plus faible que dans PCHNTs ( p
< 0,05). (Figure 1F)

Promoteur hyperméthylation de XAF1
à la primaire gastrique tumeurs

pour étudier les mécanismes moléculaires pour la XAF1 de silence dans les cancers gastriques, nous avons appliqué une technologie MSP en temps réel pour étudier l'état de méthylation d'ADN de XAF1
promoteur. La fréquence de XAF1 de l'hyperméthylation dans les tissus de cancer gastrique, PCHNTs correspondants et les contrôles non-cancéreux étaient 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) et 5,7% (5/88), respectivement. La fréquence de hypermethylation de XAF1
dans les cancers est nettement plus élevé que dans PCHNTs et les contrôles non-cancer (tous p
< 0,0001, Figure 2).

Note , l'état méthylé de XAF1
corrélation significative avec certains paramètres clinico-pathologique dans le cancer gastrique, telles que les métastases ganglionnaires, stade T, H
. infection pylori
, etc (tous p <
0,05, tableau 2). Aucune corrélation significative entre l'hyperméthylation de XAF1
et le sexe, l'âge au moment du diagnostic, le site de la tumeur et des métastases à distance a été attestés (tous p
> 0,05). (Tableau 2)

XAF1
Promoteur hyperméthylation est associé à son transcriptionnelle Silencing dans Gastric cellules
cancer

Pour examiner les relations entre XAF1 de la méthylation et XAF1
expression, nous avons comparé niveau de méthylation avec XAF1 niveaux de niveau ARNm et la protéine de XAF1 déterminée soit par analyse immunohistochimique (figure 3A) ou transfert de type western (figure 3B) par l'analyse de corrélation de Spearman. Comme le montre la Figure-3A, XAF1 expression de la protéine (déterminée par analyse immunohistochimique) dans 202 tissus GC était étroitement corrélée avec le niveau d'ARNm de XAF1 [lg (T /N)] (déterminée par RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Plus important encore, le niveau de méthylation de XAF1 était significativement associée à niveau d'ARNm de XAF1 ( γ
= - 0,846, p <
0,0001) et de protéines XAF1 niveau ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Des résultats similaires ont été obtenus lors de l'analyse de la corrélation de promoteur de la méthylation de XAF1 et la protéine expression XAF1 déterminée par analyse western blot (figure 3B). Ces résultats fortement mis en accusation que XAF1 de l'expression est régulée par la méthylation du promoteur
XAF1.

5-aza-CdR administration Restaure l'expression de XAF1

Pour confirmer davantage la régulation épigénétique de XAF1 de l'expression, les cellules AGS et KATO-III ont été traités avec 5-aza-CdR et /ou TSA. ARNm l'expression de XAF1 a été réactivé dans les deux lignées cellulaires de cancer gastrique, accompagné de déméthylation de XAF1 de promoteur (figure 4), ce qui indique que XAF1
est transcriptionnelle taire dans ces cellules hyperméthylation par l'ADN. Fait intéressant, le traitement TSA seul était efficace dans le rétablissement XAF1 de l'expression dans AGS et KATO-III sans changement significatif de le niveau de méthylation de XAF1, ce qui suggère que les modifications des histones peuvent également être impliqués dans la régulation de XAF1 de l'expression. Cependant, l'administration de TSA suivant 5-aza-CdR a un effet additif dans le rétablissement de l'expression du gène avec une nouvelle diminution du niveau de XAF1
de méthylation. Ces résultats sont en accord avec des études récentes qui ont été proposées que TSA peut avoir un effet de déméthylation d'une manière spécifique d'un gène [5]. L'analyse Western blot en utilisant des cellules AGS, comme un modèle, a confirmé la régulation positive des protéines XAF1 suivant la 5-aza-CdR et 5-aza-CdR traitements /TSA (Figure 4).

Détection de Circulating XAF1
méthylation

Nous avons détecté haute fréquence de XAF1 de la méthylation dans le cancer gastrique primaire (83,2%), ce qui suggère qu'il pourrait être un bon biomarqueur si XAF1
méthylation pourrait être détectable dans le sérum. Par conséquent, nous avons examiné XAF1 de la méthylation dans les ADN de sérum appariés des 202 patients du GC. XAF1 de la méthylation a été détectée dans 141 (69,8%) ADNs de sérum provenant de 202 patients atteints d'un cancer de l'estomac (figure 5). En revanche, XAF1 de la méthylation n'a pas été détectée dans les ADN de sérum provenant de 88 témoins non-cancéreuses.

Ensuite, nous avons confirmé la cohérence dans XAF1 de la méthylation entre les tissus tumoraux et sérum correspondant. Dans 168 cas qui ont montré XAF1 de la méthylation dans les tissus tumoraux, 141 affichés XAF1 de la méthylation dans leur sérum appariés, ce qui donne une consistance de 83,9% entre les deux. Et dans les 34 patients atteints de cancer gastrique sans XAF1 de la méthylation dans leurs tissus de cancer gastrique, aucune méthylation a été trouvé dans tous les ADN sériques (figure S2).

XAF1
méthylation comme un biomarqueur dans le diagnostic du cancer gastrique

Pour évaluer la valeur de XAF1 de la méthylation comme biomarqueur pour le diagnostic GC, nous avons tracé le récepteur caractéristique de fonctionnement (ROC) courbes et surface calculée sous la courbe (AUC) des valeurs en utilisant les données de méthylation de l'ADN des deux tissus GC et sérums. Tant le ROC analyse de XAF1 de la méthylation dans les tissus et sérums a révélé la capacité discriminative significative (Figure 6); la valeur AUC des tissus XAF1 de la méthylation était 0,849 (intervalle de confiance de 95%, 0,806 à 0,892; p
< 0,0001), la valeur AUC de sérum AXF1
méthylation était 0,909 (intervalle de confiance de 95%, 0,875 à 0,942; p
< 0,0001).

en outre, comme le statut de méthylation de XAF1 dans les tissus de cancer gastrique et les sérums corrélation significative avec métastases ganglionnaires, stade T, le stade clinique, et d'autres paramètres clinico-pathologique (tous p <
0,05, tableau 2)

XAF1
méthylation. corrélée avec pronostic de cancer gastrique les patients

la corrélation significative de XAF1 de la méthylation avec de nombreux paramètres clinico-pathologiques (tableau 2) a suggéré qu'il pourrait associer le pronostic des patients atteints de cancer gastrique. Jusqu'à la date d'échéance de suivi, 113 des 168 patients avec XAF1 de l'hyperméthylation dans les tissus de cancer gastrique est allé progression rapide de la maladie ou de mort. La survie sans maladie médian (DFS) était seulement 23,4 mois. En revanche, dans les 34 patients sans XAF1 de l'hyperméthylation dans leurs tissus de cancer gastrique, seuls 5 patients se compliquèrent, et le DFS médian était de 39,6 mois. L'analyse de Kaplan-Meier a démontré que les patients avec XAF1 de l'hyperméthylation dans leurs tissus de cancer gastrique présentaient un taux de survie pire évident que sans XAF1 de l'hyperméthylation ( p <
0,0001) (Figure 7A). De même, l'analyse de Kaplan-Meier prouvé que les patients atteints de sérum positif XAF1 de la méthylation avaient DFS nettement inférieurs à ceux que chez les patients sans sérum XAF1 de la méthylation ( p
< 0,0001 ) (figure 7B), indiquant que promoteur de la méthylation de XAF1 dans le sérum était un prédicteur défavorable pour les patients atteints de cancer gastrique.

analyse de régression de Cox a révélé que XAF1
méthylation dans le sérum est un facteur indépendant sur la survie des patients: les patients avec XAF1 de la méthylation avaient pire pronostic ( p <
0,0001; rapport de risque, 5.710; IC à 95%, 3.474~9.383). En outre, les stades TNM et l'âge au moment du diagnostic pourrait être considéré comme le facteur déterminant du pronostic dans le cancer gastrique, que lorsque l'effet de XAF1 de la méthylation a été éliminé. En outre, circulant méthylé XAF1
dans le sang a eu un plus grand impact sur le pronostic que dans les stades TNM (tableau S1).

Transition positive de Circulating XAF1
méthylation Prédit Tumor Récurrence et

Parmi les 202 patients qui ont été évalués pour préopératoire circulants XAF1 de la méthylation, 72 patients ont reçu des examens de suivi de la circulation XAF1
méthylation 2~5 les temps de mauvais pronostic à des intervalles de 1~6 mois après la chirurgie. Parmi 12 patients récurrents, 10 patients affichés négatif à positif dans la transition le statut de méthylation de XAF1 dans leur sérum, les deux autres ont montré toujours positif pour XAF1 de la méthylation, ce qui suggère que la surveillance des XAF1 de la méthylation dans le sérum peut être un bon marqueur pour prédire la récidive tumorale (tableau 3).

Discussion

XAF1
( XIAP
facteur -Associated 1) est un roman XIAP
protéine qui pourrait perturber la combinaison de liaison XIAP
avec caspases, abolisse sa protection sur les cellules tumorales et les résultats dans l'apoptose des cellules tumorales [12] - [ ,,,0],14]. La fonction anti-apoptose de XIAP
est déterminé par le rapport entre les niveaux de XIAP
expression contre XAF1
[15]. expression ou silence de Réduction XAF1
est un événement fréquent dans les tumeurs humaines [16] - [19]. Dans la présente étude, nous avons d'abord confirmé que l'expression du gène de XAF1 était significativement régulée à la baisse à la fois le niveau d'ARNm et des protéines dans un large panel de tissus de cancer gastrique primaire, et la régulation négative de XAF1
expression était significativement associée à des étapes de la tumeur, les métastases et ainsi de suite, ce qui implique une perte de fonction XAF1
dans la progression tumorale. Ceci est cohérent avec d'autres rapports de recherche [17] - [19]. Pour explorer les mécanismes moléculaires responsables du silence
XAF1, nous avons examiné promoteur de la méthylation de XAF1 dans un tissus de cancer gastrique grand panneau ( n
= 202) et les contrôles normaux ( n
= 88) en utilisant une technologie de MSP en temps réel. Nous avons détecté une fréquence élevée (83,2%) de l'ADN hypermethylation de XAF1
dans les tissus de cancer gastrique. L'hyperméthylation d'ADN de XAF1
significative corrélée avec la régulation négative de XAF1
à la fois les niveaux de protéines dans les tissus de cancer gastrique ARNm et (Figure 3). En outre, le traitement 5-aza-CdR considérablement restauré XAF1 de l'expression dans XAF1
réduits au silence des lignées cellulaires de cancer gastrique (Figure 4). Ces données suggèrent fortement que la régulation fréquente de XAF1
dans les cellules de cancer gastrique est régulée par son hyperméthylation de promoteur. Fait intéressant, le traitement des cellules de cancer gastrique avec TSA, un inhibiteur d'histone déacétylase a également restauré l'expression de XAF1, seul ou combiné avec le traitement 5-aza-CdR, indiquant que la modification des histones peut également être impliqué dans XAF1 <. br> régulation

méthylation de l'ADN peut être utilisé en tant que biomarqueur de tumeur potentielle dans divers cancers humains [3] - [11], [23]. La présence d'ADN exempte de cellules circulant dans le sang périphérique a été décrite chez des patients présentant des processus malins, et la libération active de l'ADN tumoral dans la circulation a été rapporté [29] - [31]. De nombreuses études ont démontré des altérations spécifiques de la tumeur dans les ADN récupérés à partir du plasma ou du sérum de patients atteints de diverses tumeurs malignes qui correspondent à des changements génétiques présents dans les tumeurs primaires, une constatation qui a le potentiel pour le diagnostic moléculaire et le pronostic [29] en circulation - [32]. Les marqueurs d'acides nucléiques décrites dans les ADNs de circulation comprennent des mutations oncogènes, des altérations microsatellites, des réarrangements de gènes, et des modifications épigénétiques, comme aberrante hyperméthylation de promoteur [7], [8], [30] - [34]. Sur la base de ces observations, en particulier, nous avons détecté une fréquence élevée de ADN de méthylation de XAF1 dans les tissus de cancer gastrique (83,2%), nous avons décidé d'étudier la possibilité d'utiliser promoteur de la méthylation de XAF1 dans le sérum en tant que biomarqueur chez les patients atteints de cancer gastrique. Tout d'abord, nous avons démontré une grande cohérence dans la détection de XAF1 de la méthylation entre les sérums et les tissus de cancer gastrique primaire. Ensuite, nous analysons la possibilité d'utiliser circulant méthylé XAF1
comme un marqueur de diagnostic en utilisant l'analyse ROC. L'AUC (aire sous la courbe) de 0,909 a démontré une valeur diagnostique élevée de détection de XAF1
méthylation dans des échantillons de sérum. Par conséquent, nos données suggèrent que la détection de XAF1 de la méthylation de l'ADN circulant peut être utilisé en tant que biomarqueur non invasif pour le diagnostic d'un cancer gastrique. En outre, nos résultats ont également montré que positif XAF1 de la méthylation dans le sérum était un facteur pronostique indépendant; prédire un mauvais pronostic. Plus intéressant, la transition du négatif au positif de la circulation XAF1 de la méthylation après la chirurgie était significativement associée à la récidive de la tumeur. Ces données indiquent que la détection de XAF1 de la méthylation dans l'ADN circulant dans le sérum peut également être un marqueur biologique de la tumeur pour prédire le pronostic des patients atteints d'un cancer de l'estomac et de pour contrôler la récidive de la tumeur après traitement par chirurgie. Parce que le nombre des patients ont subi cet examen de sérum suivi était petit, de nouvelles recherches dans une grande taille du nombre de patients de l'échantillon est nécessaire pour confirmer cette constatation intéressante et d'optimiser la stratégie et le protocole à cet effet. En tout état de cause, la comparaison avec les méthodes traditionnelles telles que l'examen gastroscopie pour les patients atteints de cancer gastrique, la caractéristique la plus remarquable de circuler méthylé La détection XAF1 de est rapide et efficace, à faible coût, de l'environnement, non-invasive, ne pas détruire, haute taux conformable diagnostic et ainsi de suite, et en tant que tel démontrent les perspectives d'application importants à l'avenir.

Conclusions

Dysfonctionnement de XAF1
est fréquente et est réglementée par XAF1
promoteur hyperméthylation dans le cancer gastrique. Circulantes méthylé XAF1 de l'ADN a été associée à la charge tumorale et la progression maligne, qui peut être un biomarqueur utile pour le diagnostic du cancer gastrique, prédire le pronostic des patients et le suivi de la récidive tumorale après un traitement chirurgical.

Soutenir Informations
Figure S1.
jpg. A, XAF1 de niveau d'expression du gène était plus faible dans le cancer gastrique avancé (stade III /IV) que dans le cancer gastrique précoce (stade I /II). B, XAF1 de niveau d'expression du gène était plus faible dans le cancer gastrique peu différencié que dans bien /modérément cancer gastrique (bien /Mod) différencié, p <
0.05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF)
Figure S2.
jpg. L'analyse de corrélation des résultats de hyperméthylation
XAF1 entre les tissus du GC et le sang apparié périphérique (sérum)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s002
(TIF)
Tableau S1.
xls. Multivariée analyse de survie des données clinico-pathologique de 202 cas de carcinome gastrique.

• PLOS ONE: Un nouveau sous-classification des cancers gastriques pT4 selon la largeur de séreuse Invasion
• PLOS ONE: Janus Kinase 2 polymorphismes sont associés au risque chez les patients atteints de cancer gastrique dans une population chinoise