Абстрактный
Фон
<р> Рак желудка (GC) связано с высокими показателями смертности и неблагоприятным прогнозом на поздних стадиях. Кроме того, не существует эффективных методов диагностики рака желудка на ранней стадии или для прогнозирования результатов с целью выбора конкретного пациента варианты лечения. Поэтому, важно, чтобы исследовать новые методы диагностики ГХ.
Методология /Основные выводы
<р> Для того, чтобы облегчить его использование в диагностической установке, группа из 74 генов с диагностической и прогностической информации была переведена на заказной микрочипов, содержащий сокращенный набор 1042 зондов, пригодных для высокая пропускная способность обработки. В этом отчете мы демонстрируют впервые, что пользовательский мини-массив может использоваться в качестве надежного диагностического инструмента при раке желудка. С АУК значением 0,565 (95% ДИ 0.305-0.825), указывающим идеальный тест, чувствительность и специфичность диагностики, из кривой СОХ были рассчитаны на 70% и 80%, соответственно.
Выводы /Значение
<р> Данные ясно демонстрируют воспроизводимость и надежность небольшой заказ микрочипов. Массив является отличным инструментом для классификации и прогнозирования исхода заболевания у больных раком желудка
<р> Цитирование:. Инь Y, Чжо W, Y Чжао, Чэнь S, Li J, Ван L, и др. (2013) Преобразование Microarray подписи в диагностический тест: судебный процесс над 74 пользовательских Гена массива для осветления и прогнозирования прогноза рака желудка. PLoS ONE 8 (12): e81561. DOI: 10.1371 /journal.pone.0081561
<р> Редактор: Courtney Г. Монтгомери, штат Оклахома Фонд медицинских исследований, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 25 июня, 2013 года; Принято: 14 октября, 2013 года; Опубликовано: 3 декабря 2013
<р> Copyright: © 2013 Инь и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Национальная программа фундаментальных исследований Китая (973 программа) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка (GC) имеет высокую частоту и является второй ведущей причиной смертности от рака [1,2]. Прогноз GC сильно зависит от стадии заболевания на момент постановки диагноза и метода лечения [3]. Уровень 5-летней выживаемости в прогрессирующих больных раком желудка составляет около 20%, тогда как в ранней стадии рака желудка она выше 60% [4-6]. Тем не менее, не было никаких эффективных и осуществимых методов для выявления ранней стадии рака, а также для прогнозирования возможного прогноза, чтобы обеспечить соответствующее лечение для каждого пациента. В Японии, хотя они могли более эффективно обнаруживать и лечить ранним раком желудка (EGC) путем широкого скрининга, только эндоскопии может быть широко использован для обнаружения Г.К.Ц.. Поэтому ранняя диагностика и способность различать злокачественные и предраковых заболеваний имеют большое значение [7]. Поэтому, важно, чтобы исследовать новые методы для GC диагностических или прогностических предсказаний для клинического применения.
<р> Некоторые изменения генов могут быть связаны с малигнизации и прогрессирования GC [8-11]. Например, предыдущие данные, которые мы изучали предположение, что гены, коллаген может быть потенциальным биомаркером отличить злокачественные от предраковых поражений в желудке [12]. Поскольку прогрессирование заболевания от предраковых условий для GC является динамическим процессом [13-15], обнаружение генов изменений может позволить идентификацию заболеваний генов, ассоциированных с более ранними, чем патологических обследований. Кроме того, экспрессия гена дает дополнительную информацию о состоянии пациента [16]. Таким образом, анализ микрочипов может быть важным и полезным методом для диагностики и стратификации риска при раке желудка.
<Р> Кроме того, с помощью настраиваемых мини-массивов для клинической практики могут быть не только дешевле, но может также потребовать меньше образца входных РНК для маркировки и гибридизации, а также от времени обработки данных может быть существенно уменьшена по сравнению с обычными микрочипов [17]. Произвольный микрочипов из 70 генов для прогноза рака молочной железы, который был одобрен Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), проверяет целесообразность пользовательских микрочипов при клиническом применении [18,19]. Несмотря на то, было проведено несколько исследований по определенным группам генов для диагностики ГХ, технология микрочипов в настоящее время не используется в качестве диагностического инструмента при раке желудка.
<Р> В этой статье мы описываем впервые разработке индивидуальные диагностические GC мини-массив, и продемонстрировать, что пользовательский мини-массив может быть использован в качестве надежной диагностики и прогнозирования инструмента рака желудка.
Результаты
Пользовательский мини-массив из группы возможных генов, связанных с GC злокачественного и прогресса
<р> В предыдущем исследовании мы использовали олигонуклеотидный микрочип из 38,500 генов систематически рассматривать дифференциальную экспрессию генов среди 33 образцов от нормальных, предраковых и злокачественных поражений в желудке [12]. Фракцию генов 696 дифференцированы-экспрессирующих нашли в формальном исследовании, были разработаны в пользовательском мини-массив как часть научно-исследовательской базы. Кроме того, для некоторых групп, в которых были обнаружены гены, которые, возможно, были тесно связаны с GC, то пользовательские мини-массив также включены 44, связанных с коллагеновых генов [20-22], 54 генов половых рецепторов гормонов и путей, обнаружили гены дифференцированы экспрессия в других исследованиях, а также генов 915 нормализации (подробные данные в таблице S1). В этом исследовании, профиль экспрессии 1042-ген был создан в качестве мощного диагноза и предсказатель исхода заболевания у больных раком желудка.
Сравнение массива Performance 1042-Gene с тем, что из оригинала 25k Microarray
Для того, чтобы определить, выполняет ли настроить тест мини-массив похож на оригинальный 25 K микрочипов [12] два образца ( LYXT и LYXS) из тех же пациентов, используемых в оригинальной серии разработать 1042-диагностический классификатор были извлечены. Выражения 696 генов, полученных с помощью диагностического мини-массив были очень похожи (Пирсона корреляции 0,957, р &л; 0,01). К исходным опубликованным данным (Рисунок 1)
Идентификация генов дифференцированно выраженных в злокачественные и предраковые желудочные ткани
<р> Все данные гибридизацию фон скорректированные, нормализуется, и проанализированы с целью идентификации генов дифференцированный-экспрессии в 40 образцах, которые представляют злокачественных поражений и предраковых заболеваний (п = 20 в каждой группе). Набор 371 генов было обнаружено отделения злокачественных поражений от предраковых поражений, используя иерархическую кластеризацию и SVM несмываемые один выход подтверждение, в то время как предраковые образец (МФР) были классифицированы в злокачественную группу, и пять злокачественных образцов (XSHT, GJFT, CXCT , XYT и QLTT) были классифицированы в предраковые группу. МФР и образец был собран из окружающей ткани перстень карциномы. Патологический отчет показал, что образец XSHT был Умеренно дифференцированная аденокарцинома, образец GJFT был Умеренно хорошо дифференцированной аденокарциномы, тогда как CXCT, XYT и образцы QLTT были хорошо дифференцированная аденокарцинома. Эти дифференциально экспрессируемые гены включены 199 до регулируемых генов и 172 понижающей регуляции генов в злокачественных поражений по сравнению с предраковыми поражениями (рисунок 2).
Пользовательские массив с минимальным количеством генов для диагностики и прогнозирования GC
<р> неконтролируемой двумерный анализ кластера генов кластеризации и GC кластеризация проводили независимо друг от друга с использованием агломерационных алгоритма иерархической кластеризации с 371 генов которые могли бы выявить злокачественную GC и предраковых поражений. Коэффициент корреляции экспрессии для каждого гена с исход заболевания рассчитывали, и были найдены 252 генов, в значительной степени связаны с исходом заболевания (коэффициент корреляции и ЛТ; -0,3 или > 0,3) (подробные данные в таблице S1).
<р> Эти 252 генов ранга упорядоченных на основе величины коэффициента корреляции. Число генов в 'прогностической классификатор' была оптимизирована путем последовательного добавления подмножества 5 генов от вершины этого ранга упорядоченного списка и оценки его мощности для правильной классификации с помощью метода "оставить-один-аут" для перекрестной проверки. Классификация была сделана на основе соотношения уровней экспрессии остальных образцов из хороших и плохих пациентов, соответственно. Точность улучшилась до достижения оптимального количества генов-маркеров. Следовательно, 74 генов были определены как минимальное число генов, которые могут быть отнесены к двум подгруппам различного прогноза (Рисунок 4). С рассчитывались АУК значение 0,565 (95% ДИ 0.305-0.825), указывающий идеальный тест, чувствительность и специфичность диагностики от кривой ROC до 70% и 80%, соответственно (Рисунок 5).
<Р> на основе Генная онтология (ГО) классификации функции, функциональная аннотацию для генов, вовлеченных в клеточный цикл, инвазию и метастазирование, ангиогенез и трансдукции сигнала значительно повышающей регуляции в неблагоприятным прогнозом подписи (аннотацию генов, перечисленных в таблице S1). Эти гены включают в себя несколько групп, для которых функция аннотаций дает представление базового биологического механизма, приводящего к основным функциям, участвующих в онкогенеза и прогрессии. Гены, участвующие в клеточном цикле, инвазию и метастазирование, ангиогенез и сигнальной трансдукции были значительно дифференцированно выражены между двумя подписями (например, GKN1, INHBA, SPP1 и THBS4). В то же время, неконтролируемая кластерный анализ проводится различие между различными прогностическими опухолей. Оценивая все 74 прогностических репортерных генов, больше генов, принадлежащих к этим функциональным категориям становятся очевидными (например, GKN1, GKN2, GIF, ВВЦУ и LiPF).
<Р> Пациенты в обеих группах, классифицированных по 74 генов и целые зонды почти одинаковы, для образца LCM, которая была классифицирована в группе хорошего прогноза в целом зондов микрочипов и в группе с неблагоприятным прогнозом в классификации 74-гена, за исключением. Образец LCM собирали из злокачественной ткани пациента, страдающего от муцинозной аденокарциномы в стадии IV с меньшим временем жизни, чем у других пациентов в формальных группах. Таким образом, 74-ген классификации микрочипов может быть более надежным.
в списке пользовательских микрочипов 74-гена, мы обнаружили группу генов с классификацией GO воспроизводства (таблица 2), в котором 5 гены рецепторов половых гормонов и путей (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 и FOXL2), может не только эффективно отделить злокачественная от предраковых образцов, но и классифицировать плохой и хороший прогноз с иерархической кластеризации и SVM (рисунок 9). Кроме того, два гена полового гормона имели значительное differentiated- выражение хорошим прогнозом с плохим прогнозом GC (ESRRG 8,83, AR 0,37, р &л; 0,01).
Символ
Fold изменение
Символ
Fold change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table 2. Гены с GO классификации воспроизводства в 74 генов микрочипов группы.
CSV Загрузить CSV
Обсуждение
В настоящем исследовании мы сообщаем впервые, что обычай микрочипов может быть эффективным методом для диагностики и прогнозирования прогноза у GC клинически. Отсутствие клинических биомаркеров для раннего рака желудка без каких-либо специфических ранних симптомов приводит к задержке диагностики и вносит свой вклад в высокую смертность от рака желудка [23]. В некоторых случаях, изменения происходят только на генном уровне, без каких-либо патологических изменений. Изменения в экспрессии генов может помочь в ранней диагностике, прогнозе и руководства лечения для послеоперационной лучевой и химиотерапии. Развитие технологий микрочипов позволяет исследовать возможности патологического разворота и оценки и руководства терапии. Кроме того, создание целевого микрочипов оборудования может сделать метод более полезным. Из-за плохой специфичности и дефицита зрелой совместной диагностики, обычай микрочипов не применяется в клинической практике для лечения рака желудка все же, хотя есть исследования в генной диагностике.
<р> анализ микрочипов является широко используемой технологией для изучения экспрессии генов в глобальном масштабе. Несколько молекулярных анализов в настоящее время используемые в клинической оценки раковых заболеваний являются производными от микрочипов экспрессии генов профилирования. Одним из примеров анализа микрочипов является MammaPrint, обычай микрочипов из 70 генов, связанных с риском раннего развития отдаленных метастазов у молодых пациентов с лимфатического узла рака молочной железы отрицательный. MammaPrint был ратифицирован FDA. Возможность использовать этот профиль в высокой пропускной способности диагностической установке может быть большим преимуществом в прогнозе и лечении рака молочной железы [17-19]. Тем не менее, эта технология в настоящее время не используется в качестве рутинного диагностического инструмента при раке желудка, и не было ни в одном исследовании пользовательских микрочипов, используемых в диагностике или предсказания прогноза. В этом отчете мы демонстрируют впервые, что пользовательский мини-массив может использоваться в качестве надежного диагностического инструмента при раке желудка.
<р> В этой статье мы опишем разработку индивидуальных диагностических рака желудка мини-массива и описывают его надежное использование в диагностической установке. Многие клинические исследования коррелируют изменения в экспрессии отдельных генов с желудочной исходом рака, часто с противоречивыми результатами. Примеры включают CXCL1, HOXA10 и метилирование PCDH10 [24-26]. Тем не менее, эти гены не были включены в нашем мини-массива. Вполне возможно, что другие исследования уделяли больше внимания функции этих генов, в то время как мы сосредоточились на выражениях мРНК. Обычай массив 74-ген может быть возможным прогностическим инструментом для рака желудка. Данные ясно демонстрируют воспроизводимость и надежность небольшой заказ микрочипов. Использование пользовательских микрочипов может обеспечить ряд преимуществ, таких как точная информация о риске рецидива по сравнению с обычными клиническими критериями, и, таким образом, улучшить руководство по требованию адъювантной терапии.
<р> В то же время, из-за 2 раза выше заболеваемость у мужчин, чем у женщин с GC [1], несколько крупных эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что пол является важным независимым прогностическим фактором для общей выживаемости у больных [27,28 GC ] и преобладание мужчин рака желудка коррелирует с задержкой на 10-15 лет, в начале рака желудка кишечного типа у женщин по сравнению с мужчинами [29]. В этом профиле 74 гена пользовательских мини-массива, 5 генов были дифференцированно выражены между злокачественных новообразований и предраковых поражений GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 и FOXL2). Эта группа половых генов, ассоциированных с возможными ролями в GC была впервые предложена, и существует мало исследований по этой группе генов, ассоциированных с раком. Важно отметить, что последнее исследование сообщает Мэтсон и его коллеги показали возможную связь и тропу DMRT1, FOXL2 и гендерного гормона [30]. DMRT1, DMRT3 и DMRTA1 все включены в кластер из семейства генов, которые имеют цинковый палец, как ДНК-связывающий мотив (домен DM) общего, который также является ключевым регулятором мужского развития у мух и нематод. Кроме того, главные гены в этом пути, все включены в наши данные. Данные могут предоставить нам направление исследований для секс-ассоциированных генов в GC и выявить возможные пути и механизм GC малигнизации.
<р> Таким образом, массив может быть отличным инструментом для классификации и прогнозирования исхода заболевания у больных раком желудка. Тем не менее, существуют некоторые ограничения в нашем профиле. Образцы должны быть расширены для проверки клинической достоверности и воспроизводимости.
Пациенты и образцы
<р> Сорок хирургическим резецированные желудка образцов рака и прилегающих к ним образцы неопухолевой были получен от сэра Run Run Shaw больницы, школы медицины университета Zhejiang и в июне 2007 года было использовано по май 2011 года мы собрали злокачественные и предраковые ткани из разных областей резекцию желудка от каждого пациента, который перенес операцию. Сорок сгруппированных образцы ткани из двадцати пациентов с первичным раком желудка, перенесших операцию (двадцати злокачественных новообразований, двадцать предраковых поражений) были выбраны для анализа олигонуклеотид микрочипов (таблица 1, подробные данные в таблице S2). Все собранные образцы фиксировали, заливали, окрашивали H &Amp; E, и с диагнозом Лорен и классификации ВОЗ независимо друг от друга тремя профессиональными патологоанатомов. Двенадцать парных образцов со злокачественными и предраковых поражений у пациентов, перенесших операцию были выбраны для количественной обратной транскрипции-ПЦР (количественный RT-PCR). Результаты количественного RT-PCR были сопоставлены с патологическими записей из участвующих учреждения. Окончательный патологический анализ был определен на основе консенсуса и рассмотрен в случае необходимости. "Злокачественные" относится к различным видам рака желудка. "Предраковых" указывает на атрофический гастрит, кишечная метаплазия и /или дисплазии. Образцы были немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до дальнейшей обработки. Письменное информированное согласие было получено до отбора проб, а протокол исследования был одобрен Clinical Research комитетом по этике сэра Run Run Shaw больницы путем.
оригинальный настраиваемой 8 * 15k мини-массив содержал 1042 малигнизации и прогноз родственных генов, идентичных зондами на исходном массиве [12]. Мини-массив включены 696 дифференцированно выраженных генов между злокачественных новообразований и предраковых поражений больных ГЦ, которые мы нашли в предыдущем 38, 500 фишек гена, 44 связанных с коллагеновых генов, 54 генов половых гормонов рецепторов и путей, а также гены, дифференцированная-найденное выражение в другие исследования, которые были замечены в трех экземплярах. Каждый массив также включает в себя 1042 зондов для гибридизации и контроля качества печати, а также 915 генов, нормализацию (подробные данные в таблице S1). Восемь одинаковых мини-массивы присутствуют на одном 1 "× 3" слайд, что позволяет в течение восьми отдельных гибридизация должны выполняться одновременно (настраивается в Шанхае биочипа Co. Ltd., Agilent Technologies).
олигонуклеотидных микрочипов
<р> Общую РНК экстрагировали и очищали с использованием TRIzol Реагент (Invitrogen, США) и RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) с помощью стандартных процедур, рекомендованных производителями. Уровни и качества кРНК были измерены с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США), и качество РНК контролировали с помощью стандартной 2100 RIN > = 7,0 и 28S /18S > = 0,7. КРНК фрагментированы с образцом Cleanup Module Gene Chip (Affymetrix, США) и маркируется одним цветом с помощью Agilent увеличить метод обозначения. Гибридизация, окрашивание, стиральные и сканирующие процедуры проводили, как описано в Gene Chip Анализ экспрессии технического руководства (Affymetrix, США).
Результаты микрочипов были сканируется сканером Agilent. Данные были нормализованы и общалось после получения изображений и количественной оценки, чтобы идентифицировать гены со значительными дифференциальных выражений с помощью функции извлечения программного обеспечения. С открытым исходным кодом интерпретированы компьютерный язык (R) использовали для статистического вычисления и графики [12]. Исходные данные пользовательских микрочипов были загружены на ArrayExpress, как номер доступа A-Mexp-2338.
Количественный оТ-ПЦР анализ
<р> Общую РНК экстрагировали из образцов в противоположном направлении транскрипции в кДНК с помощью набора первичный сценарий реагентом ТМ RT (Takara, Japan) при 37 ° с в течение 15 мин и при 85 ° с в течение 15 сек. ПЦР-реакции с использованием SYBR® premis Ex Taq TM комплекта были выполнены при температуре 95 ° С в течение 30 сек с последующими 40 циклами при 95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C в течение 10 сек и 72 ° С в течение 40 сек с 7500 в реальном масштабе время PCR System (Applied Biosystems, США). Ген домашнего хозяйства β-актина служил в качестве внутреннего контроля. Вперед последовательность праймера INHBA является GTGATGGCAAGGTCAACATCT, а обратный один GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.
Изменения микробиома кишечника при приготовлении растительной пищи,
Микробы на языке могут быть использованы для диагностики рака поджелудочной железы
Пептид паучьего яда может помочь снять боль при синдроме раздраженного кишечника
Тяжелые осложнения COVID-19, связанные с нарушением кишечного барьера
Лейкоциты и их роль в головном мозге
Грибы и бактерии в кишечнике могут в равной степени влиять на здоровье человека и тяжесть заболевания.
Почему у пациентов с COVID-19 больше патогенных бактерий в носу
Исследователи сравнили носовой микробиом пациентов с коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19). здоровые люди, и медицинские работники. Эти исследования показали увеличение патогена. Синегнойная палочк
Глицирризиновая кислота как кандидат в лекарство от COVID-19
Терапии для противодействия ущербу, причиненному тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), были немногочисленными и далекими друг от друга, несмотря на усилия по
Инфликсимаб может снизить эффективность некоторых вакцин против COVID-19
Поскольку многие страны сильно страдают от повторяющихся волн инфекции, вызванной тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), с сопутствующими высокими показателями