PLoS ONE: Ориентация Cadherin-17 инактивирует Ras /Raf /MEK /ERK сигнализации и Угнетает пролиферации клеток рака желудка в

Абстрактный
<р> Cadherin-17 (CDH17), один из членов 7D-кадгерина надсемейства, был избыточно экспрессируется в рак желудка (GC) и было связано с плохой выживаемостью, рецидива опухоли, метастазирование и продвинутой стадии опухоли. До сих пор клеточная функция и сигнализации механизм CDH17 в GC остается неясным. В этом исследовании мы показали, что более 66% GC клеточных линий (20/30) были CDH17 положительными. Ткань микрочипов (TMA) Анализ показал, что 73,6% китайских тканей GC (159/216) были CDH17 положительными, а 37% соответствующие соседние нормальные ткани были CDH17 положительными. Нокдаун CDH17 ингибирует образование клеточной пролиферации, миграции, адгезии и колоний, а также индуцирует остановку клеточного цикла и апоптоз в AGS человек GC клеток. С другой стороны, избыточная экспрессия CDH17 способствовала росту опухоли GC МГЦ-803 у голых мышей. Массив Антитело и Вестерн-блоттинга Анализ показал, что нокдаун CDH17 в клетках AGS понижающей регуляции интегрина бета белков серии, далее инактивировали Ras /Raf /MEK /ERK путь и привел к р53 и накоплению р21, что приводит к подавлению пролиферации, клеточного цикла арест и индукции апоптоза. В совокупности наши данные в первую очередь продемонстрировать способность CDH17 регулировать активность Ras /Raf /MEK /ERK пути для пролиферации клеток в GC, и предполагают, что CDH17 может служить привлекательной терапевтической мишенью для будущих исследований.
<Р> Образец цитирования: Лин Z, Чжан C, Чжан М, Сюй D, Fang Y, Z Чжоу и др. (2014) Ориентация Cadherin-17 инактивирует Ras /Raf /MEK /ERK сигнализации и Угнетает пролиферации клеток рака желудка в. PLoS ONE 9 (1): e85296. DOI: 10.1371 /journal.pone.0085296
<р> Редактор: Клод Prigent, Институт де Génétique и др Développement де Ренн, Франция
<р> Поступило: 10 июня 2013 года; Принято: 26 ноября 2013 года; Опубликовано: 20 января 2014
<р> Copyright: © 2014 Лин и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> Конкурирующие интересы: Все авторы являются сотрудниками или предыдущие сотрудники компании Рош R &Amp; D Center (Китай), за исключением Yanfen Fang, который является сотрудником Восточно-Китайского педагогического университета, Шанхай, Китай.. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> Рак желудка (GC) оценивается как второй ведущей причиной глобальной смертности от рака и четвертым наиболее распространенным видом рака во всем мире [1], [2]. Средняя продолжительность жизни больных ГХ 7~10 месяцев. Большинство пациентов с GC настоящее время с заболеванием на поздней стадии с общей 5-летней выживаемости примерно на 20% и объективных скоростей реакции на обычных химиотерапевтического диапазоне режимов может быть повышена с 20% до 40% [1], [3]. В настоящее время, цисплатин терапия на основе по-прежнему широко используется в клинических условиях для продвинутых и метастатическим GC. Кроме того, для HER2-Neu гиперэкспрессией желудка аденокарциномы, трастузумаб (Герцептин) в сочетании с химиотерапией увеличивает медиана общей выживаемости с 11,1 месяцев (только химиотерапии) до 13,8 месяцев [4]. Учитывая высокий уровень смертности GC, есть еще огромная неудовлетворенная медицинская потребность найти чувствительный и надежный биомаркер для ранней диагностики GC и мощной терапевтической мишенью для лечения GC.
<Р> CDH17, один член 7D-кадгерина надсемейство, представляет в эмбриональной печени и желудочно-кишечного тракта во время эмбриогенеза, таким образом, также называют печени-кишечного кадгерину (LI кадгерина). CDH17 избыточно экспрессируется в гепатоцеллюлярной карциномой [5], [6], рак желудка [7], протоковой рак поджелудочной железы [8] и колоректального рака [9] - [11]. Как сообщалось, CDH17 в основном присутствует на клеточной мембране и отсутствует в нормальных тканях желудка и положительный показатель составил почти 78,4% [12]. Уровень экспрессии CDH17 было характерно для продвинутой карциномы желудка, что было связано с плохим прогнозом [13]; и она была также в значительной степени связано с метастазировании в лимфатические узлы при раке желудка [14]. Нокдаун CDH17 с лентивирусов-опосредованной микроРНК ингибирует пролиферацию, приверженность, рост опухоли и метастазирование BGC823 человека клеток рака желудка в пробирке и в естественных условиях [15] - [17]. CDH17 был предложен как онкоген и полезным маркером для диагностики рака желудка [18]. Было о чем свидетельствует, что CDH17 опосредованной онкогенными сигнализации в НСС связан с Wnt сигнального пути [5]. Недавно было сообщено о том, что CDH17 индуцированной туморогенез и лимфатическую метастаз в GC через активацию NFκB пути [19] сигнализации. CDH17 регулируется α2β1 интегрин сигнализации, чтобы вызвать определенную фокальную адгезию и активацию киназы Ras, что привело к увеличению адгезии и пролиферации клеток в клетках рака толстой кишки [11]. Тем не менее, главную роль и механизм сигнализации CDH17 в GC остается неясным. В данном исследовании для проверки CDH17 в качестве потенциальной терапевтической мишени для GC и исследовать механизм сигнализации в CDH17 в GC, мы охарактеризовали экспрессию CDH17 в линиях клеток человека GC и китайских тканей GC, проверяли влияние CDH17 нокдауна или пере- выражение онкогенных и метастатического эффект GC клеточных линий, и исследовали возможные каскады сигналов, связанных с CDH17. Мы наблюдали высокий уровень экспрессии CDH17 в линиях клеток человека GC и китайских тканей GC, а также четкое ингибирование клеточной пролиферации, миграции, адгезии, образование колоний, индукции апоптоза и клеточного цикла после того, как глушение CDH17 в линиях клеток человека GC. Кроме того, наши результаты в первую очередь продемонстрировать способность CDH17 регулировать активность интегрина-Ras /Raf /MEK /ERK пути для пролиферации клеток в GC, и предполагают, что CDH17 может служить привлекательной терапевтической мишенью для будущих исследований.

материалы и методы

Этика заявление
<р> использование и уход за экспериментальных животных было одобрено по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC), Roche R &усилитель с; D Center (Китай). Блоки GC ткани человека с соответствующими блоками соседних тканей были получены из Шанхая биочипа Company, компании CRO услуг. Все человеческие ткани были собраны с письменного согласия пациентов источника. Все клеточные линии были приобретены у АТСС, США, японской Сборник научных биоресурсам, и Шанхай института биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук.

Клеточные линии и реактивы

Все клеточные линии из американской коллекции типичных клеток (АТСС), японский сборник научных биоресурсам, и Шанхай института биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук были сохранены в соответствующей среде роста, которые были рекомендованы поставщиками. PMD-18Т-CDH17 плазмиду из Sino биологической Inc. тетрациклина (Tet) был от сигмы, Cell Counting Kit-8 был из DOJINDO Molecular Tech. Человеческой плазмы фибронектин от R &усилителя; D системы. Transwell камера была от Corning (6,5 мм диаметр, 8 мкм размер пор). CDH17 олиго миРНК был от Genepharma Ко с последовательностью 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Катись контроль РНК (Allstar®) был из QIAGEN.

Tissue микро массив иммуногистохимии
<р> Двести шестнадцать парафиновых блоков желудка раковой ткани вместе с соответствующими смежными блоками ткани (смежной ткани отбирали по меньшей мере, 5 см от первичной опухоли) были собраны и сданы на хранение Шанхай биочипа компании. Ткани рассекают и случайным образом готовили на 3 микро слайдов массива. Возрасты пациентов были 32-84 лет (средний возраст 65) с постановкой от 1А-4 в соответствии с американским Объединенным комитетом рака (AJCC) рекомендации ver.7. Все случаи были диагностированы двумя старшими патологоанатомов с опытными специальности в желудочном онкопатологии. Срезы инкубировали в блокирующем сыворотки в течение 20 мин, затем покрывают 100 мкл анти-человеческий кадгерин-17 аффинно очищенного моноклонального Ab, мышь IgG (R &Amp; D MAB1032 1:2000 в TBS /T) при 4 ° С в течение ночи. Слайды были охвачены 100 мкл DAKO Envision + /HRP, Кролик /мышь после того, как тщательно промывают TBS. Сто мкл субстрата раствор хромогена (DAB) были применены к слайдам и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Витражи слайды исследуют под микроскопом двумя экспертами иммуногистохимии. Нормальный IgG мыши использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание считается отрицательным, когда никаких положительных клеточных мембран окрашивание не может быть идентифицирован и положительный результат, когда более 10% опухолевых клеток показали клеточную мембрану положительное иммунное окрашивание.

TR стабильной линии клеток
<р> pLenti6 /TR вектор (Invitrogen, кат. номер V48020) и pLenti3.3 /TR вектор (Invitrogen, кат. номер A11114) были использованы для создания стабильных клеточных линий, которые конститутивно экспрессируют высокие уровни репрессора Tet. Эти экспрессирующие плазмиды содержат элементы, которые позволяют упаковки конструкции в вирионов и бластицидин или генетицин маркера устойчивости для селекции стабильно трансдуцированных клеточных линий. Вкратце, упаковочные клетки 293FT (Invitrogen, Cat. No. R700-07) трансфицировали pLenti6 /TR или pLenti3 /TR и ViraPower TM Упаковка Mix (Invitrogen, Cat. No. K4975-00) для получения Lentiviral частицы. Лентивирусов были использованы для трансдукции клеток AGS или MGC-803 и бластицидин (8 мкг /мл, Invitrogen, Кат. Номер R210-01) или генетицин (200 мкг /мл, Invitrogen, Кат. Номер 10131-027) был используется для выбора для стабильной TR-экспрессирующих AGS клеток, названных TR-AGS стабильной клеточной линии или TR-клетки, экспрессирующие MGC-803 под названием TR-MGC-803 стабильная клеточная линия. Эти TR выражающий клеточные линии были использованы в качестве хозяев для экспрессии конструкций, которые облегчают Tet-регулируемую экспрессию CDH17 shRNA (короткая шпилька РНК) или гена CDH17 соответственно.

Стабильные AGS клетки с Tet-регулируемую экспрессию гена shRNA CDH17
<р> Четыре микроРНК олигонуклеотиды с таргетингом ген CDH17 ([гомо сапиенс] ген ID: 1015) были разработаны с использованием системы интернет-приложений (Invitrogen). Эти двухцепочечной ДНК были лигированы в ™ выражение системы -GW /EmGFP-Mir pcDNA6.2 (Invitrogen, Cat. No. K4936-00), которые затем были трансфицированы в AGS клетках стандартными процедурами Липофектамин 2000 (Invitrogen, Cat . No. 11668-027). В соответствии с в режиме реального времени ПЦР-анализа, последовательность 90-2 (Прямой праймер: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; обратный праймер: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') микроРНК показал высокую эффективность и был выбран для выполнения, BP рекомбинации получить pENTR-микроРНК. Этот вектор вход был затем использован в LR рекомбинации с pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. K4920-00) для получения pLenti4 /TO /V5-микроРНК лентивирусов с использованием технологии Gateway® (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Лентивирусов были использованы для трансдукции TR-AGS стабильные клетки и 200 мкг /мл зеоцину (Invitrogen, Cat. No. R250-05) был использован для выбора для стабильных Tet-регулируемых клетках экспрессии CDH17 shRNA имени TR-AGS-CDH17_KD стабильную клеточную линия.

Устойчивые клетки MGC-803 с регулируемой Tet избыточная экспрессия гена CDH17
<р> Вкратце, последовательность CDH17 амплифицировали из PMD-18Т-CDH17 плазмиды (Sino Биологический Inc.) и субклонируют в IRES -EGFP вектор для получения CDH17-IRES-EGFP с использованием праймеров: прямой праймер: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Обратный праймер: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Эта конструкция была использована для выполнения BP рекомбинации для получения pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Тогда вектор входа и pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) вектор были использованы в LR рекомбинации для получения pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Тогда лентивирусов были произведены для трансдукции TR-MGC-803 стабильные клетки и 4 мкг /мл бластицидин использовали для отбора стабильных Tet-регулируемых клеток экспрессии генов CDH17 названных TR-MGC-803-CDH17_Over стабильная клеточная линия.

пролиферации клеток для анализа
<р> Для киРНК временной трансфекции анализов, клетки высевают в 10-см чашку с плотностью 5 × 10 ^{6 клеток /чашку и трансфицировали 20 нМ siCDH17 или скремблирования миРНК. Через 48 ч инкубации клетки и переносили в отрыве на 96-луночный планшет при плотности 3000 клеток /лунку, а затем инкубируют еще в течение 72 ч. Выживаемость клеток анализировали с ССК-8 комплект (Donjindo, Япония). Для TR-индуцируемых АГС-CDH17_KD стабильные клетки, клетки высевали в 60 мм × 15 мм чашку и обрабатывают или без Tet (0, 2,5 и 5,0 мкг /мл) в течение различного времени. Клетки собирали после 2, 3, 4, 5 и 6 дней, и число клеток подсчитывали с помощью ScepterTM Ручной Автоматизированный Счетчик клеток (Millipore). Для пролиферации спасательного анализа TR-индуцируемые АГС-CDH17_KD стабильные клетки высевали в 60 мм × 15 мм чашку и культивировали в течение 10 дней с или без 5,0 мкг /мл Tet. Для группы спасения, культуральную среду, содержащую Tet была заменена свежей средой, на 4-й день, а клетки продолжали культивировать в 10 день клетки в каждой группе были собраны в день 2, 4, 6, 8 и 10 для номера ячейки подсчета и Вестерн-блоттинг анализ.}

миграция клеток анализ

TR-AGS-CDH17_KD стабильные клетки высевают в 10 см чашку и обрабатывают с использованием или без Tet (5 мкг /мл). Через 120 ч культивирования клетки собирали и подсчитывали. 0,1 мл клеточной суспензии (1, 2, 3 × 10 ^{4 клеток /мл) добавляли в верхний отсек камеры. 0,6 мл 10% среднего ФБС был добавлен в нижний отсек, как химио- аттрактанта. Через 24 ч инкубации при температуре 37 ° С, клетки фиксировали 90% этанола при температуре 4 ° С в течение 30 мин, а затем окрашивают 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 15 мин. В немигрирующих клетки были удалены из верхней поверхности Transwell мембраны с помощью ватного тампона. Окрашенные клетки были впоследствии фотографировали и подсчитывали под световым микроскопом.}

Адгезия клеток пробирного
<р> TR-АГС-CDH17_KD стабильные клетки высевали в 10-см чашку и обрабатывали с использованием или без Tet (5 мкг /мл). Предварительное покрытие 96-луночных планшетах проводили путем инкубации лунки с 25 мкг /мл фибронектина при 4 ° С в течение ночи. Для снижения неспецифического связывания, добавляли 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в каждую лунку и инкубировали в течение 60 мин при температуре 37 ° С, БСА промывали два раза стерильной PBS. 120 ч после нокдауна CDH17 с Tet, клетки собирали и высевали в предварительно покрытых 96-луночных планшетах с 4 × 10 4 клеток /лунку. 2 ч позже, не прилипшие клетки удаляли путем промывки стерильной PBS в течение в два раза. Адгезивные клетки анализировали с помощью набора ССК-8.

Колонии Анализ образования
<р> Во-первых, 6-луночные планшеты готовили с нижним слоем агара (0,6% гель). Затем, TR-АГС-CDH17_KD клетки или siCDH17 трансфицированные клетки (как анализ пролиферации) суспендировали в полной среде, содержащей 0,3% -0,4% Noble агар (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), и высевали в подготовленную 6-луночного планшета и культивировали в течение 7 или 14 дней. Клетки окрашивали тиазолил тетразолия бромидом (МТТ) в течение 2 ч. подсчитывали количество клеток колоний.

клеточного цикла анализа

TR-AGS-CDH17_KD стабильные клетки высевают в шесть-луночного планшета на 1,0 × 10 ^{5 клеток /лунку и обрабатывали 5 мкг /мл Tet. 120 ч спустя клетки собирали с помощью трипсина и фиксировали этанолом при температуре 4 ° С в течение 3 ч. Затем клетки центрифугировали при 1500 г в течение 5 мин и промывают PBS. Ресуспендировали клеток в растворах РНКазы /PBS (20 мкг /мл), инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин, затем добавляли растворы PI /PBS (20 мкг /мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, осмотр окрашенных клеток с BD FACS Calibur и анализировали данные с BD CellQuest Pro программное обеспечение.}

Апоптоз анализ

TR-AGS-CDH17_KD стабильные клетки высевают в шесть-луночного планшета на 1,0 × 10 ^{5 клеток /лунку и обрабатывают 5 мкг /мл Tet. 120 ч спустя клетки собирали с помощью трипсина и промывали предварительно охлажденным PBS один раз. Клетки повторно суспендируют в 500 мкл 1 × буфера для связывания и 5 мкл PI и добавляли 5 мкл AnnexinV (BD). После инкубации в темноте (при комнатной температуре) в течение 10 мин, окрашенные клетки были осмотрены с BD FACS Calibur. Собранные данные были проанализированы с BD CellQuest Pro программного обеспечения.}

Вестерн-блоттинга
<р> Клетки лизируют RIPA буфером [150 мМ NaCl, 1% NP40, 0,25% деоксихолат и 10 мМ HEPES (рН 7,4)], содержащий ингибитор протеаз (Roche Molecular Biochemicals). Концентрации белка определяли количественно, используя метод бицинхониновой кислоты (ВСА) (Pierce). Тридцать микрограммов белка на пробу кипятили в буфере для загрузки и подвергали электрофорезу в 8-12% градиентном SDS полиакриламидном геле (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны зондируют антителами (CDH17, Интегринзависимая β 1, ИНТЕГРИНОВ beta; 4, ИНТЕГРИНОВ β5, п-p53, p53, p21 были из R &усилителя; D, Raf, п-MEK, MEK, п-ЭРК, ЭРК были из клеточной сигнализации, и K-Ras был из Санта-Круса), и с последующим конъюгированным с пероксидазой иммуноглобулина. Вестерн-блоты были визуализированы с повышенной хемилюминесценции (ECL) комплект (GE, Healthcare)

массивы анализа антител
<р> Три типа массивов антител были получены от R &Amp;. D Systems, Inc. для антитела массивы анализа. Человек фосфо-киназа Массив Kit (Cat. No. ARY003) содержит 43 различных киназ. Человек Растворимый Рецептор Массив Kit негемопоэтических Panel (Cat. No. ARY012) содержит 119 различных растворимых рецепторов. Апоптоз Массив Kit человек (Cat. No. ARY009) содержит 35 различных антител апоптоза. Более исчерпывающую информацию об этих массивах можно найти в звене R &усилителя; D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-АГС-CDH17_KD стабильные клетки собирали через 120 ч, обработанных с использованием или без Tet (5 мкг /мл) и белки подвергали лизису с помощью лизирующего буфера с ингибиторами протеазы, клеточные экстракты разбавляли и инкубировали с тремя типами массивов антител в течение ночи , Массивы промывали для удаления несвязанных белков с последующей инкубацией с коктейлем биотинилированных антител обнаружения. Все процедуры в соответствии с инструкцией к набору. Пятна анализировали с помощью денситометра, и экспрессия белка нормализовалось к положительному контролю, который был представлен в каждой мембране.

Измерение активности в естественных условиях
<р> TR-MGC803-CDH17_Over клетки (1 × 10 7 клеток в 0,2 мл PBS) вводили в левую подмышку 5~6 недели BALB /с ню /ню бестимусных самок мышей (китайско-британских SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Китай). Объем опухоли (мм 3) измеряли с суппортами и рассчитывается как (W 2 × L) /2, где W- ширина и L является длиной. Когда объем опухоли достигал ~ 100 мм 3, мышей случайным образом делили на две группы (9 мышей в каждой группе). Tetracylcine индукция (Invitrogen, 0,2 мг /мл, поставляется в стерилизованной питьевой воды, содержащей 2,5% сахарозы) был инициализирован на группирования день. Стерилизованные питьевой воды, содержащей 2,5% сахарозы, подавали в мышей в неиндуцированной группы. Объемы опухоли регистрировали каждые 3 дня, пока животные не были принесены в жертву. После 35 дней индукции, ксенотрансплантатов опухолевых тканей собирали и подвергали Вестерн-блот-анализа для относительной экспрессии белка.

Статистический анализ
<р> Данные выражали в виде среднего ± S.D. и статистически подвергали непарного т-критерия Стьюдента. Уровень P < 0,05 считалось значимым

Результаты

Выражение профиля CDH17 в желудочном
рака <р> Уровень экспрессии CDH17 белков в 30 клеточных линиях был отнесен к категории. на 4 группы, основанные на данных анализа оптической плотности против бета-актина. клеточная линия АГС использовали в качестве внутреннего стандарта для избежания несоответствия между гелей. Более 66% GC клеточных линий (20/30) были CDH17 положительными (Рис. 1А)
<р> Экспрессия и локализация CDH17 в секции первичной ткани парафина был обнаружен иммуногистохимии на микрочипов ткани. По сравнению с контрольными слайдах, окрашенных с помощью обычной мыши IgG, CDH17 мАт окрашивания была продемонстрирована локализация четкой клеточной мембраны (рис 1B). Среди 216 больных с подтвержденным диагнозом патологии отчета, 73,6% раковых тканей (159/216) таил положительный CDH17 пятно с скоринга от + до +++, в то время как 37% положительных CDH17 пятно в соответствующих соседних нормальных тканей (Таблица 1). В CDH17 положительных случаях уровень экспрессии CDH17 имеет положительную корреляцию с метастазов в лимфатических узлах. Тем не менее, уровень экспрессии в противоположном направлении связано с желудочным инвазии стенки, опухоли отдаленных метастазов и стадии опухоли TNM. Наше наблюдение согласуется с предыдущими клиническими отчетами [20] - [22]. Среди CDH17 положительных случаев, раковые ткани выставлены более сильное окрашивание CDH17 (32,1% в качестве выигрыша + 25,2%, как скоринг ++ и 42,8% как скоринг +++), чем у соседних нормальных тканей (62,5% как скоринг +, 21,3%, как тем самым увеличив счет ++ и 16,3%, как скоринг +++). Хотя никаких существенных отношений не наблюдалось между скоринг пятен и клинической стадии. Принимая все это свидетельствует о том, вместе, CDH17 может быть диагностическим маркером для ранней стадии рака желудка в китайских популяциях.

RNAi-опосредованной нокдаун CDH17 на GC клеточных линий показали подавление пролиферации клеток и образование колоний в пробирке
<р> на основании результатов профиля экспрессии CDH17 в панели ГХ клеточных линий (рис 1А), AGS (выше CDH17), КУП-823 (низший CDH17) и HGC-27 (ни один CDH17) клеточные линии были выбраны для дальнейшего в пробирке сотовой функциональной оценки с RNAi-опосредованной CDH17 глушителей. Вестерн-блоттинг показал, что AGS клетки имели высокий уровень белка CDH17 и экспрессия CDH17 был сбит почти полностью на siCDH17. BGC823 клетки имели низкий уровень белка CDH17 и ГГК-27 не имел CDH17 белка (рис 2А). По сравнению с контрольными клетками скремблирования, CDH17 сбивание оказывает незначительное влияние на пролиферативную способность BGC823 и HGC27 клеток, в то время имел сильное влияние на АГС (на 60% через 72 ч, рис 2В). Мягкие агар Анализ показал, что способность образовывать колонии подавлялось в AGS клетках, если CDH17 был нокдаун (на 66% на 14 г), но в BGC823 клетках и HGC27 клетках, CDH17 сбивание оказывает незначительное влияние на способность формирования колонии (рис 2С). Там не было видно, разница между BGC823 клеток (низкий уровень) и CDH17 ТЖК-27cells (не CDH17) при ингибировании пролиферации и образования колоний индуцированных миРНК CDH17 нокдаун.

Стабильные клеточные линии, несущие TR индуцируемый нокдаун CDH17 в AGS клетках и избыточная экспрессия CDH17 в клетках MGC-803
<р> последовательность-мишень в exon13 (90-2), полученных в результате выше снижения уровня мРНК (рис 3А) 90%. Тогда мы использовали pLenti4 /TO /V5-микроРНК-90-2 CDH17 лентивирусов для трансдукции TR-AGS стабильные клетки и получили стабильную Tet-регулируемую экспрессию shRNA клеток генов CDH17 (TR-AGS-CDH17_KD), который был снижен уровень белка CDH17 около 90% после того, как индуцированное с 5 мкг /мл Tet (рис 3б). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP лентивирусов использовался для трансдукции TR-MGC-803 стабильные клетки и выбраны с бластицидин, чтобы получить стабильный Tet-регулируемую экспрессию генов клетки CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) , Избыточная экспрессия CDH17 в этой устойчивой ячейки был подтвержден на уровне белка с помощью Вестерн-блоттинга (рис 4A).

Нокдаун CDH17 индуцированного ингибирования клеточной пролиферации, миграции, адгезии, образование колоний и индукции в остановке клеточного цикла и апоптоз

TR-AGS клетки (контрольные клетки) и клетки TR-AGS-CDH17_KD были использованы для оценки потенциальных клеточных функциональных эффектов shRNA-опосредованной CDH17 нокдауна в AGS клетках. TR-АГС-CDH17_KD клетки обрабатывают 5 мкг /мл Tet показали снижение пролиферации клеток (на 75,8% в течение 5 дней), миграции клеток способность (на 68,1% в 16 ч), клеточной адгезии способность (на 46,8% в течение 30 минут ), а также способность колонии (на 92,7% в течение 7 дней формирования) по сравнению с Tet свободной (рис 3C). В спасательной исследовании пролиферации, CDH17 нокдаун в клетках TR-AGS-CDH17_KD индуцированных Tet можно спасти путем удаления Tet. После удаления Tet на 4-й день, наблюдалось повторное выражение CDH17 на 8-й день и 10 культуры в CDH17 shRNA нокдаун AGS клеток. Повторное выражение CDH17 может спасти способность пролиферации клеток TR-AGS-CDH17_KD (Рисунок 3D). По сравнению с Tet свободных клеток TR-AGS-CDH17_KD, Tet на клетках продемонстрировал значительно увеличенный процент клеток в G0 /G1 и G2 /M фазе и резко умершей процент клеток в фазе S (рис 3e). В то же время, мы также наблюдали, что количество апоптотических клеток (на 52,2% за 5 дней) был увеличен на понижающей регуляции CDH17 в клетках TR-AGS-CDH17_KD (рис 3F). Никаких существенных различий не было найдено в TR-AGS стабильной клеточной линии с или без Tet инкубации.

Гиперэкспрессия CDH17 способствовало росту ксенотрансплантатов опухолей у голых мышей

клеток TR-MGC-803-CDH17_Over вводили подкожно в бок BALB /C голых мышей с образованием твердой опухоли. Выражение CDH17 была под контролем Tet в питьевой воде. Результаты показали, что после 35 дней индукции, Tet-индуцированной группы (объем опухоли = 1849,08 ± 423.46m3) выставлены 2,27 раза выше темпов роста прогресса в сравнении с Tet-свободной группы (объем опухоли = 814.04 ± 234.69m3) (р &л; 0,05) ( 4В), и индуцированную экспрессию CDH17 в опухолевых тканях можно анализировать с помощью вестерн-блоттинга (фиг.4С). Он показал, что CDH17 играет важную роль в канцерогенезе рака желудка. Мы также использовали клетки TR-AGS-CDH17_KD соблюдать ли глушение CDK17 может повлиять на онкогенность у голых мышей. К сожалению, опухоль принимают скорость этой клеточной линии была очень низкой и не надежны в естественных условиях результаты наблюдались с клеточной линией TR-AGS-CDH17_KD.

Определение соответствующие уровни белка после нокдауна CDH17 антителами массивов анализа <бр> <р> в соответствии с онкогенных эффектов (ингибирование пролиферации клеток, образование колоний, и рост опухоли в естественных условиях) и метастатических эффектов (ингибирование миграции клеток и адгезии) из CDH17 нокдауна, мы выбираем три антител массивов (от R &Amp; системы D ), чтобы проверить относительные изменения белков и надеются найти сильнодействующим CDH17 регулируемых родственных белков. В массиве апоптозу, фосфо-р53 (S15, S46 и S392), и выражение /CDNK1A P21 /CIP1 увеличилась примерно в два раза после того, как 5 мкг /мл лечения Tet в течение 5 дней по сравнению с необработанными клетками (рис 5А (а) и 5В). В фосфо-киназы массива, фосфо-р53 (S15, S46 и S392) выражение также увеличилось после лечения Tet и, в то же время, экспрессия фосфо-ERK1 /2 (T202 /Y204) уменьшилась (рис 5А (б) и 5В). В массиве растворимого рецептора, нокдаун CDH17 в AGS клетках может значительно уменьшить экспрессию интегрина β 1, β4, β5, в то время как не влияет на экспрессию EGFR (рис 5A (с) и 5В). Изменение соотношения заинтересованных белков между Tet-на и Tet свободных AGS клетки были обобщены на рисунке 5B.

Нокдаун CDH17 в AGS подавляются бета-интегрины и Ras /Raf /MEK /ERK сигнализации тропинка

изменения белка из анализа массива антитела были подтверждены с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показали значительное снижение интегрина β1, β4, β5 и фосфо-ERK в CDH17 нокдаун клетки AGS, но никаких существенных изменений в общей ERK (5С). Затем мы провели оценку участия других компонентов сигнального пути Ras /Raf /MEK /ERK. Нокдаун CDH17 привела к понижающей регуляции Raf, фосфо-MEK и фосфо-ERK белков (рис 5в). От TR-MGC-803-CDH17_Over исследования в естественных условиях, мы наблюдали суперэкспрессия CDH17 повысили интегрина β 1, beta; 4, β5 экспрессии и активации ERK (Рис 4C), и это согласуется с результатами выше. Для того, чтобы исследовать влияние CDH17 на интегринами или белка Ras, является ли прямое взаимодействие или нет, ко-иммунопреципитация CDH17 с интегрином β 1, интегринов beta; 4, интегрина β5, интегрина а2, и Ras проводили в желудочном раковых клетках AGS, соответственно. Из ожидания, в отличие от результата Bartolome [11], не было никакой прямой связи между CDH17 и любой из этих интегринов или белка Ras (данные не показаны).

Обсуждение
<р> Это большой проблемой для врачей и основных ученых, чтобы определить молекулярные маркеры, связанные с прогрессированием и прогноза раковых заболеваний, связанных. В печени и рака желудка, полагают, что высокий уровень экспрессии CDH17 было связано с плохой выживаемостью, рецидива опухоли, опухолевой инвазии, метастазирования и стадия запущенная опухоль [23] - [25]. В данном исследовании, в том числе 30 панелей линий GC клеток, более 66% наших испытанных клеточных линий (20/30) являются CDH17 положительными, и почти половина из этих клеточных линий имеют более высокую экспрессию CDH17. В нашем отчете диагностики патологии, 73,6% Китайский GC раковые ткани (159/216) питал положительное CDH17 пятно. В CDH17 положительных случаях уровень экспрессии CDH17 имеет положительную корреляцию с метастазов в лимфатических узлах. Тем не менее, уровень экспрессии в противоположном направлении связано вторжение стенки желудка, опухоли отдаленных метастазов и стадии опухоли TNM. Наше наблюдение согласуется с предыдущими клиническими отчетами [20] - [22]. Принимая все это свидетельствует о том, вместе, CDH17 может быть диагностическим маркером для ранней стадии рака желудка в китайских популяциях.

Для того, чтобы определить влияние CDH17 в желудочном tumorigensis рака и метастатического потенциала, как олиго миРНК и TR индуцибильных векторы pLentiviral с специфические микроРНК (exton13) против CDH17 были использованы для нокдауна экспрессии CDH17 в желудочном линиях раковых клеток. CDH17 глушение с помощью олиго миРНК может ингибировать клеточную пролиферацию и образование колоний в клеточных линиях GC с высоким уровнем экспрессии CDH17. Тормозящий эффект был драматичным на АГС, который имеет более высокую экспрессию CDH17, но не на клетках BGC823 и HGC27, которые имеют очень низкое или отсутствует экспрессия белка CDH17 (рисунок 2). Она указала, что выражение CDH17 может способствовать пролиферации раковых клеток и образования колоний способности в AGS клетках. Кроме того, аналогичные результаты были также отмечены в Tet-индуцированной shRNA-опосредованной CDH17 нокдауна в AGS клетках, что привело к ингибированию пролиферации клеток, миграции, адгезии, образование колоний и индукции апоптоза и клеточного цикла в пробирке. Повторное выражение CDH17 может спасти способность пролиферации клеток TR-AGS-CDH17_KD (рисунок 3). Кроме того, Tet индуцированной избыточная экспрессия CDH17 в клетках TR-MGC803-CDH17_Over может способствовать росту опухоли ксенотрансплантаты в естественных условиях (рисунок 4). Принимая все это свидетельствует о том, вместе, мы можем сделать вывод, что существует значительная корреляция между экспрессией CDH17 и онкогенных и метастатических способностей рака желудка, и CDH17 может служить в качестве потенциальной терапевтической мишени для будущих исследований
. <Р> Хотя несколько предыдущих исследования сообщили о том, что глушение CDH17 может ингибировать клеточную пролиферацию в клетках GC, механизм сигнализации CDH17 остается неясным. Было о чем свидетельствует, что CDH17 опосредованной онкогенными сигнализации в НСС связан с Wnt сигнального пути [5]. Тем не менее, существуют некоторые различия между нашими результатами и результаты, представленные Лю в ГЦК. Наши результаты показали никаких изменений в фосфорилированной форме гликоген-синтаза-киназы 3 β (GSK-3 &beta и стопорное -катенина в ядре после глушителей CDH17 (данные не показаны). Это несоответствие может объясняться использованием различных типов раковых клеток и

• PLoS ONE: микроРНК 135a Подавляет лимфоузла Метастазы через понижающую регуляцию Rock1 в раннем Желудочный Cancer
• PLoS ONE: клинические исходы для рака желудка после адъювантной химиолучевой Использующ с модуляцией интенсивно…