Plos ONE: ciljanje kadherina-17 onesposobi Ras /Raf /MEK /ERK signalizacijo in zavira proliferacijo celic, želodčnega raka

Povzetek

kadherina-17 (CDH17), en član 7D-kadherina superdružine je prekomerno raka želodca (GC) in je bila povezana s slabim preživetja, tumorja ponovitve, metastaz in poznejši fazi tumorja. Doslej celične funkcije in signalizacijo mehanizem CDH17 v GC ostaja nejasna. V tej študiji smo pokazali, da je bilo preko 66% GC celičnih linij (20/30) CDH17 pozitivna. Tkivo mikromrež (TMA), test je pokazal, da je bilo 73,6% kitajskih GC tkiva (159/216) CDH17 pozitiven, medtem ko je bilo 37% zadevne sosednje normalnih tkiv CDH17 pozitiven. Rasklapanje od CDH17 zaviral proliferacije celic, migracije, oprijem in kolonij nastanek, in tudi povzroča aretaciji je celičnega ciklusa in apoptozo v AGS človek GC celic. Na drugi strani pa čezmernim CDH17 olajšano MGC-803 GC rast tumorja pri golih miših. Protitelesa nizi in Western blot test je pokazala, da je rasklapanje za CDH17 v AGS celicah navzdol urejeno integrin beta serije proteinov, nadalje inaktiviran v Ras /Raf /MEK /ERK poti in je privedla do p53 in kopičenje p21, kar je povzročilo inhibicijo orožja, celičnega cikla aretirati in indukcija apoptoze. Kolektivno, naši podatki najprej dokazati sposobnost CDH17 urediti dejavnost Ras /Raf /MEK /ERK poti za proliferacijo celic v PK, in kažejo, da se lahko CDH17 služi kot privlačna terapevtski cilj za prihodnje raziskave.

citat: Lin Z Zhang C Zhang M Xu D Fang Y, Zhou Z et al. (2014) Ciljanje kadherina-17 onesposobi Ras /Raf /MEK /ERK signalizacijo in zavira proliferacijo celic v želodca raku. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Urednik: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francija

Prejeto: 10. junij 2013; Sprejeto: 26. november 2013; Objavljeno: 20 januar 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

Konkurenčni interesi: Vsi avtorji so zaposleni ali prejšnji zaposleni Roche R & D Center (Kitajska), razen YanFen Fang, ki je zaposlen v East China Normal University, Šanghaj, Kitajska.. To ne spremeni pripadnost avtorjev vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

Rak želodca (GC) je uvrščen kot drugi vodilni vzrok za globalno umrljivosti za rakom in četrti najpogostejši rak na svetu [1], [2]. Mediana časa preživetja bolnikov GC je 7~10 mesecev. Večina bolnikov z GC Trenutno z pozni fazi bolezni, katerih skupna 5-letno preživetje približno 20% in objektivne odzivnosti konvencionalno kemoterapije območju je mogoče izboljšati z 20% na 40% [1], [3]. Trenutno je zdravljenje s cisplatinom je še vedno pogosto uporablja v kliničnih okoljih za napredne in metastatskega GC. Poleg tega je za HER2-neu čezmerno izraženim želodčne adenokarcinomov, trastuzumab (Herceptin) v kombinaciji s kemoterapijo podaljša Mediana celokupnega preživetja je z 11,1 mesecev (kemoterapijo) do 13,8 mesecev [4]. Glede na visoko stopnjo umrljivosti GC, je še vedno veliko neizpolnjenih zdravstvenih potreb, da bi našli občutljive in zanesljive biomarker za zgodnje odkrivanje GC in močnih terapevtske tarče za zdravljenje GC.

CDH17, en član 7D-kadherina naddružina, predstavlja v fetalnih jetrih in prebavnem traktu med embriogenezo, zato se imenuje tudi jeter trakta kadherina (LI kadherina). CDH17 se prekomerno v hepatocelularnega karcinoma [5] [6], želodčni rak [7], duktalni rak trebušne slinavke [8] in kolorektalnega raka [9] - [11]. Kot poročajo, je CDH17 glavnem prisoten na celične membrane in ni v normalnih želodčnih tkivih in pozitivna stopnja je bila skoraj 78,4% [12]. Nivo izražanja CDH17 bila značilnost naprednih želodca raka, ki je povezano s slabo prognozo [13]; in je bilo tudi značilno povezana z metastazami bezgavke pri raku želodca [14]. Rasklapanje CDH17 z lentivirusni posredovano miRNA inhibira proliferacijo, lepljenje, rast tumorja in metastaz BGC823 človeške želodčne rakave celice tako in vitro kot in vivo [15] - [17]. CDH17 je bil predlagan kot onkogena in uporaben marker za diagnozo želodčnega raka [18]. Ugotovljeno je bilo razvidno, da je CDH17 posredovana onkogeni signalizacijo v HCC, povezanih z NT signalne poti [5]. V zadnjem času, so poročali, da CDH17 inducirane tumorigeneze in limfno metastaze v GC z aktivacijo NFκB signalne poti [19]. CDH17 regulirano α2β1 integrin signalizacijo za sprožanje specifične goriščne oprijem kinaze in aktivacijo Ras, kar je pripeljalo do povečanja celične adhezije in proliferacijo v rakavih celicah debelega črevesa [11]. Vendar pa je glavna vloga in signalizacija mehanizem CDH17 v GC ostaja nejasna. V tej študiji, da bi preverili CDH17 kot potencialnega terapevtskega cilja za GC in raziskati mehanizem signalizacijo CDH17 v GC, smo značilno izražanje CDH17 človeških GC celičnih linij in kitajskih GC tkiv, preveri vpliv CDH17 rasklapanje ali preveč izraz na tumorogenega in metastatskega učinek GC celičnih linij, in raziskati možne kaskadah signala v zvezi z CDH17. Opazili smo veliko CDH17 izraz človeških GC celičnih linij in kitajski GC tkiv in jasno zaviranje v celično proliferacijo, migracijo, oprijem, nastanek družin, indukcijo apoptoze ter aretacijo celičnega ciklusa po utišanje CDH17 v GC humanih celičnih linijah. Poleg tega naši rezultati najprej dokazati sposobnost CDH17 za urejanje aktivnosti integrin-Ras /Raf /MEK /ERK poti za proliferacijo celic v PK, in kažejo, da se lahko CDH17 služi kot privlačna terapevtski cilj za prihodnje raziskave.

materiali in metode

Etika izjava

uporaba in oskrbo poskusnih živali je odobril Odbor za institucionalne živali nega in uporabo (IACUC), Roche R & D Center (Kitajska). Bloki človekovih GC tkiva z ustreznimi blokov sosednjih tkiv so bili pridobljeni iz Shanghai biochip Company, CRO storitev. Vsa človeška tkiva so bili zbrani s pisnim dovoljenjem bolnikov vira. Vse celične linije so bile kupljene iz ATCC, ZDA, japonski Zbirka raziskovalnih BioResources in Shanghai inštituti za biokemijo in biologijo celice, kitajske akademije znanosti.

celičnih linij in reagenti

Vsi celične linije se iz ameriške Tipična Cell Collection (ATCC), japonski Zbirka raziskovalnih BioResources in Shanghai inštituti za biokemijo in biologijo celice, so bile kitajske akademije znanosti vzdrževati v ustreznem rastnem mediju, ki so jih prodajalci priporoča. PMD-18T-CDH17 plazmida je od kitajsko biološki Inc. tetraciklin (Tet) je bila od sigma, je Cell Štetje Kit-8 od Dojindo molekularno Tech. Človeška plazma fibronectina je iz R & D sistemi. Transwell komora je iz Corning (6,5 mm premera, 8-im velikost por). CDH17 oligo siRNA je od Genepharma Co. z zaporedjem 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 ". Izgini nadzor RNA (Allstar®) je bil iz Qiagen.

Tissue micro niz imunohistokemija

dvesto šestnajst parafinske vgrajeni želodca zavira raka tkiva, skupaj s pripadajočimi sosednjih blokov tkiva (sosednja tkiva smo vzorčili vsaj 5 cm stran od primarnih tumorjev) so bili zbrani in Shanghai biochip družba deponira. Tkiva so deljiva in naključno pripravljeni na 3 mikro polj diapozitive. V starosti bolnikov je bilo 32-84 let (srednja starost 65) z uprizoritvijo iz 1A-4 glede na Skupni odbor ameriškega raka (AJCC) smernice ver.7. Vsi primeri so diagnosticirali z dvema visokih patologi z izkušeno specializacijo želodca patologiji raka. Drsniki inkubiramo pri blokiranju seruma za 20 minut, nato pokrijemo s 100 ml anti-humana kadherina-17 afiniteto očistimo monoklonsko Ab, miš IgG (R &D MAB1032 1:2000 v TBS /T) pri 4 ° C preko noči. Diapozitivi so zajeti v 100 ml DAKO predstavljate + /HRP, Rabbit /Mouse, potem ko je temeljito speremo z TBS. Sto mikrolitrov za substrat-kromogena raztopine (DAB) so bili uporabljeni za diapozitive in inkubiramo pri sobni temperaturi 10 minut. Obarvajo diapozitivi so mikroskopsko pregledati dva imunohistokemija strokovnjaki. Normalna IgG miši smo uporabili kot negativno kontrolo. Obarvanje je štelo, da je negativen, ko ni bilo mogoče pozitivno celične membrane barvanja identificirati in pozitivno, če je več kot 10% tumorskih celic je pokazala celične membrane pozitivnih imunskim barvanjem.

TR stabilne celične linije

pLenti6 /TR vektor (Invitrogen, kat. št V48020) in pLenti3.3 /TR vektor (Invitrogen, kat. št A11114), so bili uporabljeni za generiranje stabilne celične linije, ki konstitutivno izražajo visoke nivoje Tet represorju. Ti ekspresijski plazmidi vsebovati elemente, ki omogočajo pakiranje konstrukta v virione in blasticidin ali geneticin odpornostjo marker za izbor stabilno transduciranih celičnih linij. Na kratko, 293FT pakiranje celice (Invitrogen, Kat. Št R700-07) smo transfektirali z pLenti6 /TR ali pLenti3 /TR in ViraPower ^{TM Pakiranje Mix (Invitrogen, kat. Št K4975-00) za proizvodnjo lentivirusni delci. Lentivirusni bili uporabljeni za transducira AGS celice ali MGC-803 in blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, kat. Št R210-01) ali geneticin (200 ug /ml, Invitrogen, kat. Št 10.131-027) je bila uporablja se za izbiro za stabilne AGS celic-TR izražanje poimenovali TR-AGS stabilne celične linije ali TR-izražajo MGC-803 celic, imenovano TR-MGC-803 stabilne celične linije. Te TR izražanje celičnih linij so bile uporabljene kot gostitelji za izraz konstrukti, ki omogočajo Tet-regulirano ekspresijo CDH17 shRNA (kratek Ostra RNA) ali CDH17 gena oz.}

Stabilni AGS celice z Tet-urejeno izraz shRNA od CDH17 gena

Štiri Mirna oligonukleotidi, usmerjeni CDH17 gen ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) je bilo zasnovano s sistemom internet aplikacij (Invitrogen). Ti dvojno DNA smo ligirali v ™ -GW /EmGFP-miR izraz sistema na pcDNA6.2 (Invitrogen, kat. Št K4936-00), ki so bili nato prehodno transficirane v AGS celice s standardnimi postopki Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat Ne. 11668-027). Po realnem času analize PCR, sekvenco 90-2 (Forward primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; Reverse premaz: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') miRNAs pokazala največjo učinkovitost in je bil izbran na obliko BP rekombinacijo pridobiti pENTR-Mirna. Ta vnos je vektor je bil nato uporabljen v LR rekombinacijo z pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, Kat. Št K4920-00), da dobimo pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirusni uporabo Gateway® tehnologije (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirusni so bili uporabljeni za transducira TR-AGS stabilnih celic in 200 mg /ml zeocin (Invitrogen, Kat. Št R250-05) je bil uporabljen za selekcijo stabilne Tet reguliranih izraz celic CDH17 shRNA poimenovali TR-AGS-CDH17_KD stabilen celic vrstica.

Stabilni MGC-803 celice z Tet urejene prekomerno CDH17 genov

na kratko, je CDH17 zaporedje dopolnjena z PMD-18T-CDH17 plazmida (kitajsko biološki Inc.) in subkloniramo v dav- kom IRES -EGFP vektor da dobimo CDH17-IRES-EGFP z primerji: Forward premaz: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Obrnjenimi primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Ta konstrukt uporabimo za izvedbo BP rekombinacijo pridobiti pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Potem vnos vektor in pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Kat. Št V370-06) vektor so bili uporabljeni v LR rekombinacijo pridobiti pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Nato sta bila lentivirusni proizveden transducira TR-MGC-803 stabilnih celic in 4 mg /ml blasticidin je bil uporabljen za selekcijo stabilne Tet reguliranih CDH17 izražanja genov celic imenovanih TR-MGC-803-CDH17_Over stabilne celične linije.

Cell širjenje test

Za siRNA prehodna transfekcijskih testih smo celice zasejali v 10 cm posodo z gostoto 5 x 10 ^{6 celic /posodo in transfekciji s 20 nM siCDH17 ali Scramble siRNA. Po 48 urah inkubacije, so bile celice ločiti in prenesemo v ploščo s 96 vdolbinami pri gostoti 3000 celic /jamico, nato inkubirali drug 72 ur. preživetja Celica analiziramo z CCK-8 kit (Donjindo, Japonska). Za TR-inducibilnih AGS-CDH17_KD stabilnih celic, smo celice zasejali v 60 mm x 15 mm posode in obdelamo z ali brez Tet (0, 2,5 in 5,0 mg /ml) za želeni čas. Celice smo zbrali po 2, 3, 4, 5 in 6 dni in število celic preštejemo s ScepterTM Ročni avtomatizirano celic števca (Millipore). Za jedrskega orožja reševanje testa, so TR-inducibilni AGS-CDH17_KD stabilne celice zasejali v 60 mm x 15 mm posodo in kultiviramo 10 dni, z ali brez 5,0 pg /ml Tet. Za reševanje skupino smo gojišče vsebuje TET zamenja s svežim medij na dan 4, in celice še vedno gojimo na dan 10. celice v vsaki skupini požanjemo o za številke celično štetje dan 2, 4, 6, 8 in 10 in Western blot analizo.}

Cell migracije vsebnosti

TR-AGS-CDH17_KD stabilne celice smo zasejali v 10 cm posodo in obdelamo z ali brez Tet (5 mg /ml). Po 120 urah kulture, smo celice zbrali in prešteti. 0.1 ml celične suspenzije (1, 2, 3 x 10 ^{4 celic /ml) dodamo k zgornji predelek komore. 0,6 ml 10% FBS medij dodamo k spodnji predelek kot kemo atraktant. Po 24 urah inkubacije pri 37 ° C, smo celice določen z 90% EtOH pri 4 ° C 30 minut in nato obarvamo z 0,1% kristal vijoličnim 15 minut. Celice, ki niso migranti so bili odstranjeni iz zgornje ploskve transwell membrane z bombažno krpico. Obarvane celice so nato fotografirali in šteje pod svetlobnim mikroskopom.}

Cell oprijem test

TR-AGS-CDH17_KD stabilne celice smo zasejali v 10 cm posodo in obdelamo z ali brez Tet (5 g /ml). Predhodno Prevleka 96 vdolbinami smo izvedli z inkubacijo vdolbinic s 25 ug /ml fibronektina pri 4 ° C preko noči. Za zmanjšanje nespecifične vezave, je 1% govejega serumskega albumina (BSA), dodamo v vsako vdolbino in inkubiramo 60 minut pri 37 ° C smo BSA sprali dva krat s sterilnim PBS. 120 ur po razgradljiv CDH17 s Tet, smo celice zbrali in zasejali v vnaprej obloženih 96 vdolbinami s 4 x 10 ^{4 celic /jamico. 2 h kasneje so ne-adherentne celice odstranimo s spiranjem s sterilnim PBS za dvakrat. Sprijete celice smo testirali s kompletom CCK-8.}

kolonija tvorba vsebnosti

Najprej smo 6-jamicami pripravimo s spodnjim agar plastjo (0,6% gelu). Potem TR-AGS-CDH17_KD celice ali siCDH17 transfektiramo celice (kot test proliferacije) smo suspendirali v popolnem mediju, ki vsebuje 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in zasejali v pripravimo 6 vdolbinicami ter kultivirali 7 ali 14 dni. Celice smo obarvali z tiazolila modro tetracolij bromid (MTT) za 2 uri. preštejemo število kolonij celic.

Cell ciklusu

TR-AGS-CDH17_KD stabilne celice smo posejali v šestih vdolbinicami na 1,0 x 10 ^{5 celic /dobro in obdelan s 5 ug /ml Tet. 120 ur kasneje celice požanjemo s tripsinom in pritrjena z EtOH pri 4 ° C 3 ure. Nato smo celice centrifugiramo pri 1500 g 5 minut in speremo s PBS. Ponovno suspendiramo celice v RNaze /PBS raztopin (20 ug /ml) inkubiramo pri 37 ° C za 15 minut, nato dodamo PI /PBS raztopine (20 mg /ml) in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut, so pregledali obarvane celice z BD FACS Calibur in analizirali podatke z BD Cellquest Pro programske opreme.}

Apoptoza analiza

TR-AGS-CDH17_KD stabilne celice smo posejali v šestih vdolbinicami na 1,0 x 10 ^{5 celic /jamico in obdelamo s 5 ug /ml Tet. 120 ur kasneje celice požanjemo s tripsinom in izperemo s predhodno ohlajenim PBS enkrat. Celice so bile ponovno suspendiramo v 500 ul 1 × zavezujoč pufer in 5 ul PI in so bile dodane 5 ul AnnexinV (BD). Po inkubaciji v temi (sobni temperaturi) za 10 minut, so bile barvanimi celicami pregledane z BD FACS Calibur. Zbrani podatki so bili analizirani z BD Cellquest Pro programske opreme.}

Western blot analiza

Celice smo lizirali s RIPA buffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoksiholat in 10 mM Hepes (pH 7.4)], ki vsebuje koktajl inhibitor proteaze (Roche Molecular Biochemicals). Koncentracije proteina smo količinsko metodi bicinchoninic kislina (BCA) (Pierce). Trideset mikrogramov proteina na vzorec smo kuhali v pufru in elektroforezo v 8-12% gradient SDS poliakrilamidnih gelov (Invitrogen) in prenesli na nitrocelulozne membrane. Membrane smo skeniran s protitelesi (CDH17, integrin β1, integrina β4, integrin β5, p-p53, p53, p21 bilo iz R &D Raf, p-MEK, MEK so p-ERK, ERK iz celice signalizacijo, in K-Ras je od Santa Cruz) in sledi peroksidaze konjugirano imunoglobulina. Western blots smo prikazali z izboljšano kemiluminescenca (ECL) komplet (GE, Healthcare)

protiteles nizi test

Tri vrste nizi protiteles so bili pridobljeni iz R &. D Systems, Inc. na protitelesa nizi test. Human fosfo-kinaze Array Kit (kat. Št ARY003) vsebuje 43 različnih kinaz. Human topen Receptor Array Komplet Non-krvotvornih Panel (kat. Št ARY012) vsebuje 119 različnih topnih receptorjev. Human Apoptoza Array Kit (kat. Št ARY009) vsebuje 35 različnih apoptoze protitelesa. Več izčrpne informacije o teh polj je mogoče najti v povezavi z R & D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabilne celice požanjemo po 120 urah, zdravljenih z ali brez Tet (5 ug /ml) in proteine ​​smo lizirali z liznega pufra z zaviralci proteaze so celične ekstrakte razredčimo in inkubiramo s tremi vrstami nizi protiteles čez noč . So nizi speremo, da odstranimo nevezane proteine, nato pa inkubacijo s koktajlom biotiniliranega protiteles odkrivanja. Vsi postopki so v skladu z navodili kompleta. Blots smo analizirali z denzitometrijo, in izražanje proteina je normalizirana na pozitivno kontrolo, ki je bila zastopana v vsaki membrano.

Merjenje in vivo aktivnosti

TR-MGC803-CDH17_Over celice (1 x 10 ^{7 celice v 0,2 ml PBS) smo injicirali v levo pazduho od 5~6 tednov BALB /c nu /nu atimične ženski miške (kitajsko-britanski SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Kitajska). Volumen tumorja (mm 3) je bila izmerjena z čeljusti in izračunana kot (W 2 x L) /2, kjer je W širina in L je dolžina. Ko doseže volumen tumorja ~100 mm 3, miši smo naključno razdelili v dve skupini (9 miši v vsaki skupini). Tetracylcine indukcijo (Invitrogen, 0,2 mg /ml, na voljo v sterilizirane s pitno vodo, ki vsebuje 2,5% saharoze) je bil inicializiran na združevanja dan. Sterilizirajo s pitno vodo, ki vsebuje 2,5% saharoze je bila dobavljena na miših v ne-inducirane skupine. obseg tumorja so zabeležili na vsake 3 dni, dokler so žrtvovali živali. Po 35 dneh indukciji, so ksenotransplantskih tumor tkiva zbirajo in se na Western blot analizo za relativno izražanje proteinov.}

Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot sredstvo ± Š.D. in statistično podvržen Studentovim brez para t-testom. Raven P < 0,05 štela za pomembne

Rezultati

Izražanje profil CDH17 želodčnega raka

Raven izraz CDH17 proteinov v 30 celičnih linijah bila kategorizirana. v 4 skupine, ki temeljijo na podatkih iz analize optične gostote proti beta-aktina. AGS celična linija je bila uporabljena kot interni standard za izogibanje neskladje med geli. Več kot 66% GC celičnih linij (20/30) so bili CDH17 pozitivni (slika 1A).

Izraz in lokalizacija CDH17 v osnovnem poglavju tkivo parafinsko bil odkrit z imunohistokemijo na tkivnih mikromrež. V primerjavi s kontrolnimi diapozitivi, ki jih normalno miš IgG, je CDH17 mAb obarvanje dokazano jasno celične membrane lokalizacije (slika 1B) obarvajo. Med 216 primeri s potrjeno poročilo patologija diagnozo, 73,6% rakastih tkiv (159/216) gojila pozitivno CDH17 madež z točkovanja od + do +++, medtem ko je 37% pozitiven CDH17 madež v posameznih sosednjih normalnih tkivih (tabela 1). V CDH17 pozitivnih primerov, stopnja izraz CDH17 ima pozitivno korelacijo z bezgavkah metastaze. Vendar je nivo izražanja obratno povezana z želodčno stene invazijo, tumorske metastaze daljno in tumor TNM fazah. Naš je bil, v skladu s prejšnjimi poročil o kliničnih [20] - [22]. Med CDH17 pozitivnih primerov, rakastih tkiv razstavljene močnejše barvanje CDH17 (32,1% kot točkovanja +, 25,2% pa zadetka ++ in 42,8% kot zadetka +++), kot da sosednjih normalnih tkiv (62,5% kot zadetka +, 21,3% pa točkovanje ++ in 16,3% v točkovanja +++). Niso opazili pomembno razmerje med madež točkovanja in klinični fazi. Ob vsem tem dokazuje skupaj, lahko CDH17 je diagnostični marker za raka želodca v zgodnji fazi v kitajskih prebivalstva.

RNAi posredovano podreti CDH17 na GC celičnih linijah pokazala zatiranje celično proliferacijo in nastanek kolonij in vitro

na podlagi rezultatov CDH17 izražanja profila v plošči GC celičnih linij (slika 1A), AGS (višja CDH17), BGC-823 (nižji CDH17) in HGC-27 (brez CDH17) celične linije so bile izbrane za nadaljnjo vitro celičnem funkcionalne ocene s RNAi posredovano CDH17 utišanja. Western blot je pokazala, da je imel AGS celice visoko raven CDH17 beljakovin in izraz CDH17 smo podrli skoraj popolnoma s siCDH17. BGC823 celice imeli nizek nivo CDH17 beljakovin in HGC-27 ni imel CDH17 beljakovin (slika 2A). V primerjavi s kontrolnimi scramble celic, CDH17 podreti le malo vpliva na proliferativno sposobnost BGC823 in HGC27 celic, medtem ko je imel velik vpliv na AGS (s 60% na 72 ur, slika 2b). Mehki agar test je pokazal, da je bila sposobnost, da tvorijo kolonijo zaviral AGS celicah, če je CDH17 podreti (s 66% na 14 d), vendar v BGC823 celic in HGC27 celic, CDH17 podreti le malo vpliva na sposobnost tvorjenja kolonij (Slika 2C). Ni bilo očitna razlika med BGC823 celic (nizka stopnja CDH17) in HGC-27cells (non-CDH17) v inhibicijo orožja in tvorbe kolonij s siRNA CDH17 rasklapanje inducirane.

Stabilni celične linije, ki opravljajo TR inducibilne rasklapanje za CDH17 v letnem pregledu rasti celic in čezmernim CDH17 v MGC-803 celic

Cilj zaporedje v exon13 (90-2) prinesel predvsem znižanje 90% na ravni mRNA (slika 3A). Potem smo uporabili pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirusni za transducira TR-AGS stabilnih celic in dobil stabilno Tet-urejeno izraz shRNA od CDH17 genskih celic (TR-AGS-CDH17_KD), ki se je zmanjšala stopnja CDH17 protein okoli 90% po inducirane s 5 ug /ml Tet (slika 3B). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirusni je bila uporabljena za transducira TR-MGC-803 stabilnih celic in izbrane blasticidin, da bi dobili stabilno Tet-regulirano ekspresijo CDH17 genov celice (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Prevelike količine CDH17 v tem stabilno celici je bila potrjena na ravni proteina, ki ga Western blot analiza (slika 4A).

rasklapanje od CDH17 inducirane inhibicije v celično proliferacijo, migracijo, oprijem, nastanek kolonij in uvajanja v ustavitev celičnega cikla in apoptoza

TR-AGS celice (kontrolne celice) in TR-AGS-CDH17_KD celic so bili uporabljeni za oceno možnih celične funkcionalne učinke shRNA posredovano CDH17 rasklapanje v AGS celicah. TR-AGS-CDH17_KD celice, zdravljenih s 5 g /ml Tet pokazala zmanjšanje celične proliferacije (s 75,8% na 5 dni), celične migracije sposobnosti (s 68,1% na 16 ur), oprijem celic sposobnosti (s 46,8% na 30 minut ), in sposobnost tvorjenja kolonij (s 92,7% na 7 dni) v primerjavi s Tet prostem (slika 3C). V študiji reševanje jedrskega orožja, lahko CDH17 rasklapanje v TR-AGS-CDH17_KD celic, Tet induciranih se rešili z odstranitvijo TET. Po odstranitvi TET na 4. dan, so opazili ponovno izraz CDH17 na dan 8. in 10. kulture v CDH17 shRNA rasklapanje AGS celic. Re-izražanje CDH17 lahko rešili sposobnost širjenja orožja za TR-AGS-CDH17_KD celic (slika 3D). V primerjavi s Tet prostih TR-AGS-CDH17_KD celic, Tet na celicah pokazali znatno povečala odstotek celic v G0 /G1 in G2 /M fazi in dramatično umrlo odstotek celic v S fazi (Slika 3E). V tem času smo tudi ugotovili, da je število apoptotskih celic (s 52,2% na 5 dni) se je povečala za down-regulacijo CDH17 v TR-AGS-CDH17_KD celic (Slika 3F). Ni pomembna razlika je bila najdena v TR-AGS stabilne celične linije z ali brez Tet inkubacije.

Čezmerno CDH17 spodbuja rast tumorskih presadkov pri golih miškah

TR-MGC-803-CDH17_Over celic smo podkožno injicirali v boki BALB /c golih miši, da se tvori trden tumor. Izraz CDH17 je bil pod nadzorom Tet v pitno vodo. Rezultati so pokazali, da je po 35 dneh indukciji, Tet-inducirane skupino (volumen tumorja = 1849,08 ± 423.46m3) pokazal 2,27-krat višjo stopnjo rasti napredek v primerjavi s Tet brez skupini (volumen tumorja = 814.04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( slika 4B) in inducirane CDH17 izražanje v tumorskih tkiv lahko analiziramo z Western blot analiza (slika 4C). Navedla je, da ima CDH17 pomembno vlogo pri karcinogenosti rakom želodca. Uporabili smo tudi TR-AGS-CDH17_KD celice opazovati, ali se lahko za dušenje zvoka od CDK17 vplivajo na pojav tumorjev pri golih miših. Na žalost je tumor da stopnja te celične linije je bila zelo nizka in ni zanesljivih rezultati in vivo so opazili pri celični liniji TR-AGS-CDH17_KD.

Določanje s tem povezane vsebnosti beljakovin po rasklapanje CDH17 ga protiteles nizi testom

v skladu s tumorogenih učinkov (inhibicijo celične proliferacije, nastanek družin, in rast tumorja in vivo) in metastatskih učinkov (inhibicije migracije celic in oprijem) z CDH17 rasklapanje, smo izbrali tri protiteles zaporedja (iz R & sisteme D ) testiranje relativne spremembe beljakovin, in upajo, da bodo našli močan CDH17 regulirane povezanih proteinov. V apoptozo matrike, fosfo-p53 (S15, S46 in S392) in p21 /CIP1 /CDNK1A ekspresija poveča približno dva krat po 5 ug /ml zdravljenje Tet 5 dni v primerjavi z nezdravljenimi celicami (slika 5A (a) in 5B). V fosfo-kinaza matrike, fosfo-p53 (S15, S46 in S392) ekspresija poveča tudi po zdravljenju Tet in hkrati, izraz fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) zmanjšalo (slika 5A (b) in 5B). V matriki topnega receptorja, lahko razgradljiv od CDH17 v AGS celicah znatno zmanjša ekspresijo integrina β1, β4, β5, medtem ko ni vplivala na ekspresijo EGFR (slika 5A (c) in 5b). Razmerja spreminjanja zainteresiranih proteinov med Tet-on in Tet brez AGS celice so povzeti na sliki 5B.

rasklapanje od CDH17 v letnem pregledu rasti navzdol reguliranih beta-integrini in Ras /Raf /MEK /ERK signalne poti

spremembe beljakovin iz diod protitelesa testom smo potrdili z Western blot analizo. Rezultati so pokazali znatno zmanjšanje integrinskih β1, β4, β5 in fosfo-ERK v CDH17 rasklapanje AGS celice, ne pa tudi pomembne spremembe v skupni ERK (slika 5C). Nato smo ovrednotili vključevanje drugih signalnih poti komponent Ras /Raf /MEK /ERK. Rasklapanje za CDH17 povzročilo zmanjšanjem števila Raf, fosfo-MEK in fosfo-ERK proteinov (slika 5C). Od TR-MGC-803-CDH17_Over študije in vivo, smo opazili prevelike količine CDH17 povečala integrin β1, β4, β5 izražanja in ERK aktivacijo (slika 4C) in je v skladu z zgornjimi ugotovitvami. Raziskati, ali je učinek CDH17 na integrinov ali Ras proteina neposredno interakcijo ali ne, co-imuno na CDH17 z integrinskih β1, integrinskih β4, integrinskih β5, integrinskih a2, in Ras je bila izvedena v želodčnih rakavih AGS celic, oz. Od pričakovanj, v nasprotju z rezultatom Bartolome je [11], ni bilo nobene neposredne povezave med CDH17 in eden od teh integrinov ali Ras proteina (podatki niso prikazani).

Pogovor

To je velik izziv, da zdravniki in osnovnih znanstveniki ugotoviti molekularnih markerjev, povezanih z napredovanjem in prognozo raka povezanih. V jetrih in želodca raka, se domneva, da je visoka ekspresija CDH17 povezana s slabim preživetja, tumorja ponovitve, tumorske invazije, metastaze in fazo naprednih tumorja [23] - [25]. V sedanji raziskavi med 30 plošče celične linije GC, več kot 66% naših testiranih celičnih linij (20/30) so CDH17 pozitivna, in skoraj polovica teh celičnih linijah imajo višjo CDH17 izraz. V našem patologijo poročilu diagnozo, 73,6% kitajski GC rakastih tkiv (159/216) gojila pozitivno CDH17 madež. V CDH17 pozitivnih primerov, stopnja izraz CDH17 ima pozitivno korelacijo z bezgavkah metastaze. Vendar je nivo izražanja obratno povezana stene želodca invazija, tumorskih metastaz razdalje in tumorja TNM faze. Naš je bil, v skladu s prejšnjimi poročil o kliničnih [20] - [22]. Ob vsem tem dokazuje skupaj, lahko CDH17 je diagnostični marker za zgodnji stadij raka želodca kitajskega prebivalstva.

Če želite identificirati učinke CDH17 želodčnega tumorigensis raka in metastatskega potenciala, tako oligo siRNA in TR inducibilni pLentiviral vektorji z specifična miRNA (exton13) proti CDH17 so bili uporabljeni za knock-down CDH17 izražanja v želodcu raka celičnih linijah. CDH17 dušenje zvoka, ki ga oligo siRNA lahko zavira proliferacijo celic in nastanek kolonij v vrsticah GC celic z visoko CDH17 izražanja. Zaviralni učinek je bil dramatičen AGS, ki ima višjo CDH17 izraz, vendar ne na BGC823 in HGC27 celice, ki imajo zelo malo ali ni izraz CDH17 proteina (slika 2). Navedla je, da lahko CDH17 izraz prispevajo k raku celično proliferacijo in tvorbe kolonij sposobnosti v AGS celicah. Poleg tega so opazili tudi podobne rezultate v tet-inducirane shRNA posredovano CDH17 rasklapanje v AGS celic, kar je povzročilo inhibicijo celične proliferacije, migracije, oprijem, nastanek kolonij in indukcijo apoptoze in celičnega ciklusa aretaciji in vitro. Re-izražanje CDH17 lahko rešili sposobnost širjenja orožja za TR-AGS-CDH17_KD celic (slika 3). Poleg tega Tet inducira prekomerno ekspresijo CDH17 v TR-MGC803-CDH17_Over celic lahko spodbujajo rast tumorskih presadkov in vivo (slika 4). Ob vsem tem dokazuje skupaj, lahko sklepamo, da obstaja pomembna povezava med CDH17 izražanja in tumorogenih in metastatskih sposobnosti karcinoma želodca in CDH17 lahko služi kot potencialnega terapevtskega cilja za nadaljnje raziskave.

Čeprav več prejšnja študije so poročali, da lahko dušenje zvoka iz CDH17 zavira proliferacijo celic v GC celicah mehanizem signalizacija CDH17 ostaja nejasno. Ugotovljeno je bilo razvidno, da je CDH17 posredovana onkogeni signalizacijo v HCC, povezanih z NT signalne poti [5]. Vendar pa so nekatere razlike med našimi rezultati in rezultati, ki jih Liu poročali v HCC. Naši rezultati so pokazali nobenih sprememb v fosforiliranega obliki glikogen sintaza kinaza 3P (GSK-3P in obdržanja z beta-catenin v jedru po utišati CDH17 (podatki niso prikazani). Ta razlika je mogoče razložiti z uporabo drugačne vrste rakavih celic in

• Plos ONE: MicroRNA 135a zavira limfnih vozlov Metastasis z Downovim-uredbo ROCK1 v zgodnjih želodca Cancer
• Plos ONE: Klinični izidi za Rak želodca naslednje adjuvantno Chemoradiation Uporaben Intenzivnost modulacijo primerjavi tridimenzionalne Conformal Radiotherapy