PLoS ONE: Targeting kadheriinin-17 inaktivoi Ras /Raf /MEK /ERK Merkinanto ja estää Cell Proliferation mahasyövän

tiivistelmä

kadheriinin-17 (CDH17), yksi jäsen 7D-kadheriinin superperheen, yliekspressoitui mahasyövän (GC) ja oli yhteydessä huonoon säilymiseen, kasvaimen uusiutumisen, etäpesäke, ja kehittynyt kasvain vaiheessa. Toistaiseksi solujen toiminnan ja signalointi mekanismi CDH17 GC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yli 66% GC solulinjojen (20/30) oli CDH17 positiivisia. Tissue mikrosiru (TMA) määritys osoitti, että 73,6% Kiinan GC kudokset (159/216) oli CDH17 positiivisia, kun taas 37% vastaavan viereisen normaaleissa kudoksissa olivat CDH17 positiivisia. Knockdovvn CDH17 inhiboi solujen lisääntymistä, muuttoliike, tarttuvuus ja pesäkkeiden muodostumista, ja myös aiheutti solukierron pysähtymisen ja apoptoosin AGS ihmisen GC soluja. Toisaalta, yliekspressio CDH17 helpottaa MGC-803 GC kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Vasta-aine array ja Western blotting määrityksessä osoitti, että knockdovvn CDH17 vuonna AGS soluissa alassäädetty integriinin β-sarja proteiineja, edelleen inaktivoitu Ras /Raf /MEK /ERK-reitin ja johti p53 ja p21 kertymistä, mikä johti leviämisen estäminen, solusyklin pidätys ja apoptoosin induktio. Yhdessä meidän data ensiksi osoittaa kapasiteetin CDH17 säännellä toimintaa Ras /Raf /MEK /ERK koulutusjakson soluproliferaation GC, ja viittaavat siihen, että CDH17 voi toimia houkutteleva terapeuttinen kohde tulevalle tutkimukselle.

Citation: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Targeting kadheriinin-17 inaktivoi Ras /Raf /MEK /ERK Merkinanto ja estää Cell Proliferation mahasyövän. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, France

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 26 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä tai entisten työntekijöiden Roche R &D Center (Kiina) paitsi Yanfen Fang, joka on työntekijä Itä-Kiinan Normal University, Shanghai, Kiina. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on rankattu toiseksi suurin syy globaalin syöpään kuolleisuus ja neljänneksi yleisin syöpä maailmassa [1], [2]. Keskimääräinen elinaika oli GC potilaista on 7~10 kuukautta. Useimmat potilaat, joilla GC esiintyy myöhäisvaiheen tauti kokonaispituudeltaan 5 vuoden pysyvyys on noin 20% ja objektiivisen hoitovasteen perinteisiin solunsalpaajahoitojen alue voidaan parantaa 20%: sta 40% [1], [3]. Tällä hetkellä sisplatiini-pohjainen hoito on edelleen laajalti käytetty kliinisissä pitkälle ja metastaattisen GC. Lisäksi HER2-neu yliekspressoivia mahalaukun adenokarsinoomat trastutsumabi (Herceptin) yhdistettynä kemoterapiaan pidentää mediaani kokonaiselinaika 11,1 kk (pelkkää kemoterapiaa) ja 13,8 kuukautta [4]. Kun otetaan huomioon korkea kuolleisuus GC, on vielä valtava lääketieteellinen tarve löytää herkkiä ja luotettavia biomarkkeri varhainen diagnosointi GC ja voimakas terapeuttinen kohde hoidettaessa GC.

CDH17, yksi jäsen 7D-kadheriinin superperheen, esittelee sikiön maksassa ja ruoansulatuskanavassa alkionkehityksen aikana, mikä on myös nimetty maksa-suolikanavan kadheriinin (LI kadheriinin). CDH17 on yli-ilmentynyt maksasolukarsinoomassa [5], [6], mahasyöpä [7], ductal haimasyöpä [8] ja peräsuolen syövän [9] - [11]. Kuten raportoitu, CDH17 pääosin läsnä solukalvon ja poissa normaalilta mahan kudoksissa ja positiivisten määrä oli lähes 78,4% [12]. Ilmentymisen taso CDH17 oli ominaista pitkälle mahalaukun karsinooma, joka on yhteydessä huonoon ennusteeseen [13]; ja se myös merkittävästi liittyvän imusolmuke etäpesäke mahasyövän [14]. Pudotus CDH17 kanssa lentivirus-välitteisen miRNA inhiboivat, sitoutuminen, kasvaimen kasvu ja etäpesäke BGC823 ihmisen mahasyövän sekä in vitro ja in vivo [15] - [17]. CDH17 on ehdotettu onkogeenin ja käyttökelpoinen markkeri diagnoosia varten syöpien [18]. On todistettu, että CDH17 välittämä onkogeeninen signalointia HCC liittyy Wnt-signalointireitin [5]. Äskettäin on raportoitu, että CDH17 indusoi kasvaimen kehittymisen ja imusuonten etäpesäkkeiden GC aktivaation kautta NFKB-signalointireitin [19]. CDH17 säännelty α2β1 integriinin signalointia aiheuttaa tietyn polttovälin adheesiokinaasi ja Ras aktivointi, joka johti kasvuun soluadheesiota ja lisääntymistä koolonkarsinoomasoluissa [11]. Kuitenkin tärkein rooli ja signalointi mekanismi CDH17 GC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa vahvistaa CDH17 mahdollisena terapeuttisena kohteena GC ja tutkia signalointi mekanismi CDH17 GC, olemme tunnettu ilmaus CDH17 ihmisen GC solulinjoissa ja Kiinan GC kudoksissa, tarkastetaan vaikutuksen CDH17 knockdown tai yli- ilme tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen vaikutus GC solulinjojen, ja tutki mahdollinen signaali kaskadeista liittyviä CDH17. Havaitsimme suuren CDH17 ilmentymistä ihmisen GC solulinjoissa ja Kiinan GC kudoksiin, ja selkeä esto solujen lisääntymisen, migraation, pito, pesäkkeiden muodostumista, apoptoosin induktio ja solusyklin pysähtymisen jälkeen hiljentäminen of CDH17 ihmisen GC solulinjoissa. Lisäksi tuloksemme ensinnäkin osoittavat kapasiteettia CDH17 säännellä toimintaa integriini-Ras /Raf /MEK /ERK koulutusjakson soluproliferaation GC, ja viittaavat siihen, että CDH17 voi toimia houkutteleva terapeuttinen kohde tulevalle tutkimukselle.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

käyttö ja hoito koe-eläinten hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), Roche R &D Center (Kiina). Ihmisen GC kudosblokeista vastaavien viereisten kudosten korttelin saatiin Shanghai Biochip Company, CRO palveluyritys. Kaikki ihmisen kudokset kerättiin kirjallisen suostumuksen lähteestä potilaista. Kaikki solulinjat hankittiin ATCC, USA, Japani Collection of Research Bioresources, ja Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia.

Solulinjat ja reagenssit

Kaikki solulinjat American Tyypillinen Cell Collection (ATCC), japani Collection of Research Bioresources, ja Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Kiinan tiedeakatemian pidettiin vastaavissa kasvualustaan ​​jotka suosittelemia myyjät. PMD-18T-CDH17 plasmidi oli peräisin Kiinan Biological Inc. tetrasykliiniä (Tet) oli sigma, Cell Counting Kit-8 oli peräisin Dojindo Molecular Tech. Ihmisen plasman fibronektiini oli R &D Systems. TranswellTM kammio oli Corning (6,5 mm halkaisijaltaan, 8 um huokoskoko). CDH17 oligo siRNA oli peräisin Genepharma Co., jonka sekvenssi 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Pikasulun RNA ohjaus (Allstar®) oli QIAGEN.

Tissue mikro array immunohistokemia

Kaksi satakuusitoista parafiiniin mahasyövän kudosblokeista yhdessä vastaavien viereisten kudosten lohkojen (vieruskudos otettiin näyte ainakin 5 cm: n etäisyydelle primaarikasvainten) kerättiin ja talletettu Shanghai Biochip Company. Leikeltiin ja satunnaisesti valmistettu päälle 3 mikro array dioja. Vuotiaita potilaita oli 32-84 vuotta (mediaani-ikä 65), jossa lavastus 1A-4 mukaan American sekakomitean Cancer (AJCC) ohjeet ver.7. Kaikki tapaukset diagnosoitiin kahdella vanhempi patologit kokeneiden erikoisuus mahasyövän patologian. Levyjä inkuboitiin estää seerumissa 20 minuuttia, sitten piiriin 100 ui anti-ihmis-kadheriini-17 affiniteettipuhdistettiin monoklonaalinen Ab, hiiren IgG: tä (R &D MAB1032 1:2000 TBS /T) 4 ° C: ssa yön yli. Levyjä kattaa 100 ui DAKO Kuvitella + /HRP, Kani /Hiiri pesun jälkeen huolellisesti TBS. Sata mikrolitraa substraattia-kromogeeniliuoksen (DAB) levitettiin objektilaseille ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Stained Objektilasit tutkittiin mikroskoopilla kaksi immunohistokemiallisesti asiantuntijaa. Normaalin hiiren lgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Värjäys katsottiin olevan negatiivinen, kun mitään positiivista solukalvon värjäytyminen voitiin tunnistaa ja positiivinen, kun enemmän kuin 10% kasvainsolujen solukalvon-positiivisia immunovärjäyksellä.

TR stabiilien solulinjojen

pLenti6 /TR (Invitrogen, Cat. No. V48020) ja pLenti3.3 /TR (Invitrogen, kat. nro A11114) käytettiin tuottamaan stabiileja solulinjoja, jotka ekspressoivat konstitutiivisesti korkeita tasoja Tet-repressorin. Nämä ekspressioplasmidit sisältävät elementtejä, jotka mahdollistavat pakkaus- konstruktin virioneihin ja blastisidiinia tai genetisiini resistenssimarkkeria valintaa varten stabiilisti transdusoitujen solulinjoissa. Lyhyesti, 293FT pakkaus soluja (Invitrogen, Cat. No. R700-07) transfektoitiin pLenti6 /TR tai pLenti3 /TR ja ViraPower ^{TM Pakkaus Mix (Invitrogen, kat. Nro K4975-00) tuottaa lentivirus hiukkasia. Lentivirus käytettiin transdusoimaan AGS soluja tai MGC-803 ja blastisidiinia (8 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. R210-01) tai genetisiini (200 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. 10131-027) oli valitaan vakaan TR-ilmentävien AGS solujen nimeltään TR-AGS stabiili solulinja tai TR-ilmentäviä MGC-803-solut nimeltä TR-MGC-803 vakaa solulinjasta. Nämä TR ilmentäviä solulinjoja käytettiin isäntinä ekspressiorakenteita, jotka helpottavat Tet-säädellään ilmentymisen CDH17 shRNA (lyhyt hiusneula-RNA) tai CDH17 geenin, vastaavasti.}

Stable AGS solujen Tet säädeltävä ekspres- shRNA ja CDH17 geenin

neljä miRNA oligonukleotidien kohdistaminen CDH17 geeni ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) suunniteltiin käyttäen internet-hakujärjestelmä (Invitrogen). Nämä kaksijuosteiset DNA ligoitiin pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP-miR ilmentymisen järjestelmä (Invitrogen, kat. Nro K4936-00), joka sitten transfektoitiin väliaikaisesti AGS soluihin Lipofectamine 2000 vakiomenettelyjä (Invitrogen, Cat . No. 11668-027). Mukaan reaaliaikainen PCR-analyysi, sekvenssi 90-2 (forward-aluke: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; käänteinen aluke: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') miRNA osoitti korkeimman tehokkuuden ja valittiin per muotoon BP rekombinaatio saamiseksi pENTR-miRNA. Tämä merkintä vektoria käytettiin sitten LR rekombinaatiolla pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Nro K4920-00), jolloin saatiin pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus käyttäen Gateway® tekniikkaa (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus käytettiin transdusoimaan TR-AGS stabiileja soluja ja 200 ug /ml tseosiinia (Invitrogen, Cat. No. R250-05) käytettiin valita vakaan Tet-säädellään CDH17 shRNA ekspressiosoluja nimeltä TR-AGS-CDH17_KD vakaa solun line.

Stable MGC-803-solujen Tet-säädellään yliekspressio CDH17 geenin

Lyhyesti, CDH17 sekvenssi monistettiin PMD-18T-CDH17 plasmidi (Kiinan Biological Inc.) ja subkloonattiin IRES -EGFP vektori saamiseksi CDH17-IRES-EGFP käyttäen alukkeita: Forward-aluke: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Reverse-aluke: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Tätä konstruktia käytettiin suorittamaan BP rekombinaation saada pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Sitten merkintä vektorin ja pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) vektori käytettiin LR rekombinaatioon saada pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP. Sitten lentivirus tuotettu transdusoida TR-MGC-803 stabiileja soluja ja 4 ug /ml blastisidiinia käytettiin valita vakaan Tet-säädellään CDH17 geenin ilmentymistä soluissa nimeltä TR-MGC-803-CDH17_Over stabiili solulinja.

Soluproliferaatiomääritys

siRNA ohimenevän transfektion määrityksissä soluja ympättiin 10 cm: n maljalla, jonka tiheys on 5 x 10 ^{6 solua /malja ja transfektoitu 20 nM siCDH17 tai scramble siRNA. 48 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut erottaa toisistaan, ja siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 3000 solua /kuoppa, inkuboitiin sitten vielä 72 tuntia. Solujen elävyys määritettiin CCK-8 kit (Donjindo, Japani). TR-indusoituva AGS-CDH17_KD vakaa soluja, ympättiin 60 mm x 15 mm malja ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (0, 2,5 ja 5,0 ug /ml) eri aikaan. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 2, 3, 4, 5 ja 6 päivää, ja solujen määrä laskettiin ScepterTM Handheld Automated Cell Counter (Millipore). Proliferaatioon pelastus määrityksessä, TR-indusoituva AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin 60 mm x 15 mm malja ja niitä viljeltiin 10 päivää tai ilman 5,0 ug /ml Tet. Pelastus Ryhmä viljelyväliaine, joka sisälsi Tet korvattiin tuoreella alustalla päivänä 4, ja solut edelleen viljellä päivä 10. solut kussakin ryhmässä kerättiin päivänä 2, 4, 6, 8 ja 10 solujen määrä laskentaa ja Western blotting -analyysi.}

Cell migraatiokokeessa

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja ympättiin 10 cm: n maljalla ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (5 ug /ml). Sen jälkeen 120 tunnin viljelyn jälkeen solut kerättiin ja laskettiin. 0,1 ml solususpensiota (1, 2, 3 x 10 ^{4 solua /ml) lisättiin ylempään osastoon kammion. 0,6 ml 10% FBS: ia lisättiin alempaan osastoon kuin Chemo houkutinta. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, solut kiinnitettiin 90%: ssa EtOH: a 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten värjättiin 0,1% kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Ei-muuttajan solut poistettiin yläpinnasta Transvvell- kalvon pumpulipuikolla. Värjätyt solut myöhemmin valokuvattiin ja laskettiin valomikroskoopilla.}

Soluadheesioanalyysi

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja ympättiin 10 cm: n maljalla ja käsiteltiin kanssa tai ilman Tet (5 ug /ml). Pre-pinnoite 96-kuoppaisille levyille suoritettiin inkuboimalla kaivoja 25 ug /ml fibronektiiniä 4 ° C: ssa yön yli. Vähentää ei-spesifisen sitoutumisen, 1% naudan seerumin albumiinia (BSA), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 60 min ajan 37 ° C: ssa, BSA pestiin kaksi kertaa steriilillä PBS: llä. 120 h kuluttua pudotus CDH17 kanssa Tet, solut kerättiin ja ympättiin esipäällystetty 96-kuoppalevyillä 4 x 10 ^{4 solua /kuoppa. 2 tuntia myöhemmin, tarttumattomat solut poistettiin pesemällä steriilillä PBS: llä kaksi kertaa. Tarttuneet solut määritettiin CCK-8 kit.}

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Ensinnäkin, 6-kuoppaisia ​​levyjä, jotka on valmistettu pohja-agarkerroksen (0,6% geeli). Sitten, TR-AGS-CDH17_KD soluja tai siCDH17 transfektoidut solut (kuten proliferaatiomäärityksessä) suspendoitiin täydelliseen alustaan, joka sisälsi 0,3% -0,4% Noble-agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja ympättiin valmistettiin 6-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin 7 tai 14 päivää. Solut värjättiin tiatsolyyli blue liumbromidi (MTT) 2 tuntia. Määrä solujen pesäkkeiden laskettiin.

Solusyklianalyysiä

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin kuusi kuoppalevylle 1,0 × 10 ^{5 solua /kuoppa ja käsiteltiin 5 ug /ml Tet. 120 tuntia myöhemmin, solut kerättiin trypsiinillä ja kiinnitetään EtOH 4 ° C: ssa 3 h. Sitten soluja sentrifugoitiin 1500 g: ssä 5 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä. Suspendoitiin uudelleen solujen RNaasi /PBS liuokset (20 ug /ml), inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, sitten lisättiin PI /PBS liuokset (20 ug /ml) ja inkuboitiin RT: ssä 30 min, tarkastetaan värjätyistä soluista BD FACS Calibur ja analysoi tietoja BD CellQuest Pro -ohjelmisto.}

Apoptosis analyysi

TR-AGS-CDH17_KD stabiileja soluja siirrostettiin kuusi kuoppalevylle 1,0 × 10 ^{5 solua /kuoppa ja käsiteltiin 5 ug /ml Tet. 120 tuntia myöhemmin, solut kerättiin trypsiinillä ja pestiin esijäähdytettyyn PBS kerran. Solut suspensoitiin uudelleen 500 ul: ssa 1 x sitovaa puskuria ja 5 ui PI ja 5 ui anneksiiniV (BD) lisättiin. Inkuboidaan pimeässä (huoneen lämpötila) 10 minuutin ajan, värjätään solut tarkastettiin BD FACS Calibur. Saatu aineisto analysoitiin BD CellQuest Pro -ohjelmisto.}

Western blotting -analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla [150 mM NaCI, 1% NP40, 0,25% deoksikolaattia ja 10 mM Hepes (pH 7,4)], joka sisältää proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Proteiinikonsentraatiot mittaamaan bikinkoniini- happoa (BCA) menetelmä (Pierce). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia per näyte keitettiin latauspuskuria ja elektroforeesi 8-12% kaltevuus SDS-polyakryyliamidigeeleillä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Kalvot vasta-aineilla (CDH17, integriini-β1, Integriini β4, Integriini β5, p-p53, p53, p21 olivat R &D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK olivat Soluviestintä, ja K-Ras oli Santa Cruz), ja sitten peroksidaasiin konjugoitua immunoglobuliini. Western blotit näkyviksi tehostetun kemiluminesenssin (ECL) Kit (GE Healthcare).

Vasta paneelit määritys

kolmenlaista vasta-paneelit hankittiin R &D Systems, Inc. vasta-aineen taulukot määritys. Ihmisen Fosfo-Kinase Array Kit (Cat. No. ARY003) sisältää 43 eri kinaasien. Ihmisen liukoisen reseptorin Array Kit Non-Hematopoieettinen Panel (Cat. No. ARY012) sisältää 119 erilaista liukoiset reseptorit. Ihmisen Apoptosis Array Kit (Cat. No. ARY009) sisältää 35 erilaista apoptoosin vasta-aineita. Kattavampi tietoa näistä paneelit löytyy linkin R &D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabiileja solut kerättiin sen jälkeen, kun 120 h käsitelty tai ilman Tet (5 ug /ml), ja proteiinit hajotettiin hajotuspuskuria kanssa proteaasi-inhibiittorit, solu-uutteet laimennettiin ja inkuboitiin kolme vasta-aineen matriisia yön yli . Taulukot pestiin sitoutumattomien proteiinien poistamiseksi, jonka jälkeen inkuboitiin cocktail biotinyloitua havaitsemisen vasta-aineita. Kaikki menettelyt ovat ohjeen mukaan kitin. Blotit analysoitiin densitometrisesti ja proteiinin ilmentyminen normalisoitiin positiiviseen kontrolliin, joka oli edustettuna kunkin kalvon.

mittaus in vivo

TR-MGC803-CDH17_Over soluja (1 x 10 ^{7 solua 0,2 ml PBS) ruiskutettiin jäljellä kainaloon 5~6 viikon BALB /c nu /nu atyymisissä naaras hiiret (Kiinan ja Britannian SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Kiina). Kasvaimen tilavuus (mm 3) mitattiin jarrusatulat ja lasketaan (W 2 x L) /2, jossa W on leveys ja L on pituus. Kun kasvaimen tilavuus saavutti -100 mm 3, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (9 hiirtä kussakin ryhmässä). Tetracylcine induktio (Invitrogen, 0,2 mg /ml, syötetään steriloitu juomavettä, joka sisälsi 2,5% sakkaroosia) on alustettu ryhmittymän päivä. Steriloitu juomavettä, joka sisälsi 2,5% sakkaroosia syötettiin hiirille ei-indusoidun ryhmä. Tuumoritilavuudet rekisteröitiin joka 3 päivä, kunnes eläimet lopetettiin. 35 päivän jälkeen induktio, ksenografti kasvainten kudokset kerättiin ja alistettiin Western blot-analyysi suhteellisen proteiinin ilmentymisen.}

Tilastollinen

Data ilmaistiin keskiarvoina ± S.D. ja tilastollisesti altistettiin Studentin pariton t-testi. Taso P < 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression profiilia CDH17 mahasyövän

Ilmaisu taso CDH17 proteiinien 30 solulinjoissa luokiteltiin 4 ryhmään perustuu tietoihin optinen tiheys analyysi vastaan ​​beeta-aktiini. AGS solulinjaa käytettiin sisäisenä standardina välttää välistä ristiriitaa geelejä. Yli 66% GC solulinjojen (20/30) oli CDH17 positiivisia (kuvio 1A).

Ilmaisu ja lokalisaation CDH17 perusterveydenhuollossa kudoksessa parafiiniin jaksossa havaittiin immunohistokemia kudossiruina. Verrattuna kontrolli dioja värjätään normaalin hiiren IgG, CDH17 mAb värjäys osoitettiin selvä solukalvon lokalisointi (kuvio 1 B). Niistä 216 tapauksissa vahvistettu patologian diagnoosi raportti, 73,6% syöpäkudokset (159/216) kanna positiivinen CDH17 tahra pisteytys symbolista + +++, kun taas 37% positiivisia CDH17 tahra vastaavan viereisen normaaleissa kudoksissa (taulukko 1). Vuonna CDH17 tautitapauksia, ekspressiotaso CDH17 on positiivinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke. Ilmaisulla taso on käänteisesti liittyy mahalaukun seinämän invaasio, kasvaimen etäpesäkkeiden ja kasvaimen TNM vaiheissa. Havaintomme oli yhdenmukainen aiempien kliinisten raporttien [20] - [22]. Niistä CDH17 positiivinen tapauksissa syöpäkudokset näytteillä vahvempaa värjäytymistä CDH17 (32,1% kun pisteytys +, 25,2% kun pisteytys ++ ja 42,8% kun pisteytys +++) kuin viereisten normaaleissa kudoksissa (62,5% kun pisteytys +, 21,3% kun pisteytys ++ ja 16,3% kun pisteytys +++). Vaikka mitään merkittäviä suhde havaittiin tahra pisteytys ja kliiniseen vaiheeseen. Kun kaikki tämä todistaa yhdessä, CDH17 voi olla diagnostinen markkeri alkuvaiheen mahasyöpä Kiinan väestö.

RNAi-välitteinen kaataa CDH17 GC solulinjoissa osoitti solujen proliferaatio ja pesäkkeiden muodostumista in vitro

tulosten perusteella on CDH17 mentymisprofiili paneelissa GC solulinjojen (kuvio 1A), AGS (korkeampi CDH17), BGC-823 (alempi CDH17) ja HGC-27 (ei mitään CDH17) solulinjat valittiin edelleen in vitro solujen toimintakyvyn arvio, jossa RNAi-välitteinen CDH17 hiljentäminen. Western blotting osoitti, että AGS solut oli korkea CDH17 proteiinin tason ja ilmentymistä CDH17 pudotettiin lähes täysin mukaan siCDH17. BGC823 soluilla oli matala CDH17 proteiinin tason ja HGC-27 ei ollut CDH17 proteiinia (kuvio 2A). Verrattuna ryntäily ohjaus solut, CDH17 kaatamalla oli vain vähän vaikutusta proliferatiivinen kyky BGC823 ja HGC27 soluja, kun taas oli dramaattinen vaikutus AGS (60% 72 h, kuva 2B). Pehmeä agar määritys osoitti, että kyky muodostaa pesäkkeitä estyi AGS soluissa jos CDH17 oli kaataa (66% 14 d), mutta BGC823 soluissa ja HGC27 soluja, CDH17 kaatamalla oli vähän vaikutusta pesäkemuodostuksen kyky (kuva 2C). Ei ollut selvää eroa BGC823 solujen (alhainen CDH17 taso) ja HGC-27cells (ei-CDH17) on proliferaation esto ja pesäkkeiden muodostuminen indusoitiin siRNA CDH17 pudotus.

Stable solulinjoja kuljettavat TR indusoitavissa knockdovvn CDH17 in AGS soluissa ja yli-ilmentyminen CDH17 in MGC-803 solut

kohdesekvenssin exon13 (90-2) tuotti yli 90% pienempi mRNA tasolla (kuvio 3A). Sitten käytimme pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus transdusoida TR-AGS vakaa solujen ja sai vakaan Tet-säänneltyjen ilmentymisen shRNA of CDH17 geenin solujen (TR-AGS-CDH17_KD) jossa CDH17 proteiini taso aleni noin 90%, kun indusoitiin 5 ug /ml Tet (kuvio 3B). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus käytettiin transdusoimaan TR-MGC-803 vakaa solut ja valittu blastisidiinia saada vakaa Tet-säänneltyjen ilmentymisen CDH17 geeni soluihin (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Yli-ilmentyminen CDH17 tässä stabiili solussa vahvistettiin proteiinin tason Western blottauksella (kuvio 4A).

knockdovvn CDH17 inhiboivan solujen lisääntymisen, migraation, tarttuvuus, pesäkkeiden muodostumisen ja induktio solusyklin pidätyksen ja apoptoosin

TR-AGS solut (kontrolli solut) ja TR-AGS-CDH17_KD soluja käytettiin arvioimaan mahdollisten solujen funktionaalisia vaikutuksia shRNA välittämää CDH17 knockdovvn sisään AGS soluissa. TR-AGS-CDH17_KD soluja käsiteltiin 5 ug /ml Tet vähensi solujen proliferaation (75,8%: iin 5 päivää), solumigraation kyky (mukaan 68,1% 16 h), soluadheesiota kyky (46,8% 30 minuuttia ), ja pesäkkeenmuodostuskyvyn (by 92,7% 7 päivää) verrattuna Tet ilmainen (kuvio 3C). Vuonna leviämisen pelastus tutkimuksessa CDH17 knockdown TR-AGS-CDH17_KD solujen aiheuttama Tet voidaan pelastaa poistamalla Tet. Poistamisen jälkeen Tet päivänä 4 uudelleen ilmentäminen CDH17 havaittiin päivänä 8 ja 10 kulttuurin CDH17 shRNA knockdownin AGS soluja. Re-ilmentymä CDH17 voisi pelastaa leviämisen kyky TR-AGS-CDH17_KD soluissa (kuvio 3D). Verrattuna Tet free TR-AGS-CDH17_KD soluja, Tet-solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt prosenttiosuus solujen G0 /G1 ja G2 /M-faasin ja dramaattisesti kuolleen solujen prosenttiosuutta S-vaiheessa (kuvio 3E). Tällä välin myös havaittu, että määrä apoptoottisten solujen (52,2% 5 päivää) korotettiin alas-säätely CDH17 TR-AGS-CDH17_KD soluissa (kuvio 3F). Mitään merkittävää eroa ei havaittu TR-AGS vakaa solulinjasta tai ilman Tet inkubointia.

yli-ilmentäminen CDH17 edisti kasvua kasvaimen nude-hiirissä

TR-MGC-803-CDH17_Over soluissa injektoitiin ihonalaisesti kylkiin BALB /c-nude-hiirten muodostamiseksi kiinteän kasvaimen. Ilmaus CDH17 oli valvonnassa Tet juomavedessä. Tulokset osoittivat, että 35 päivän jälkeen induktion, Tet aiheuttama ryhmä (kasvaimen tilavuus = 1849,08 ± 423.46m3) osoitti 2,27-kertainen kasvu etenemisen versus Tet-vapaa ryhmä (kasvaimen tilavuus = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( kuvio 4B), ja indusoitiin CDH17 ilmentymistä tuumorikudoksessa voidaan analysoitiin Western blottauksella (kuvio 4C). Se osoitti, että CDH17 tärkeä rooli syövän synnyn mahasyövän. Käytimme myös TR-AGS-CDH17_KD solujen tarkkailla, onko hiljentäminen of CDK17 voi vaikuttaa tuumorigeenisyyden nude-hiirissä. Valitettavasti kasvaimen ottaa nopeudella tästä solulinjasta oli erittäin alhainen eikä luotettavaa in vivo tuloksia havaittiin TR-AGS-CDH17_KD solulinjassa.

määrittäminen siihen liittyvän proteiinin tasot jälkeen pudotus CDH17 by Vasta paneelit määrityksen

mukaan kasvaimia vaikutukset (soluproliferaation inhibointi, pesäkkeiden muodostumista, ja kasvaimen kasvua in vivo) ja metastaattinen vaikutukset (esto solu- migraation ja adheesion) ja CDH17 knockdown, me valitsemme kolme vasta-paneelit (R &D Systems ) testata suhteellinen proteiini muutoksia ja toivoa löytää voimakkaita CDH17 säännelty liittyviä proteiineja. Vuonna apoptoosin array, fosfo-p53 (S15, S46 ja S392) ja p21 /CIP1 /CDNK1A ilmentyminen kasvoi noin kaksinkertaiseksi sen jälkeen, kun 5 ug /ml Tet hoito 5 päivää käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 5A (a) ja 5B). Vuonna fosfo-kinaasi array, fosfo-p53 (S15, S46 ja S392) ilmentyminen lisääntyi jälkeen Tet hoidon ja, samaan aikaan, ilmentymä fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) väheni (kuvio 5A (b) ja 5B). In liukoista reseptoria array, pudotus ja CDH17 in AGS solut voitaisiin merkittävästi vähentää ilmentymistä integriini β1, β4, β5, mutta ei vaikuttanut ekspressioon EGFR (kuvio 5A (c) ja 5B). Muutos suhteet kiinnostunut proteiinien välillä Tet-on ja Tet-vapaa AGS solut yhteenvetona kuviossa 5B.

knockdovvn CDH17 vuonna AGS vaimentua β-integriinien ja Ras /Raf /MEK /ERK signalointireitille

proteiini muuttuu vasta-array määritys varmistettiin Western blotting-analyysi. Tulokset osoittivat merkittävä väheneminen integriinin β1, β4, β5 ja fosfo-ERK in CDH17 pudotus AGS soluja, mutta ei merkittävää muutosta koko ERK (kuvio 5C). Sitten arvioitiin osallistumista muiden Ras /Raf /MEK /ERK signalointireitille komponentteja. Knockdovvn CDH17 johti alas-sääntelyn Raf, fosfo-MEK, ja fosfori-ERK proteiineja (kuvio 5C). TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo tutkimuksessa havaitsimme yliekspressio CDH17 tehosti integriini β1, β4, β5 ilme ja ERK aktivointi (kuvio 4C), ja se on yhdenmukainen edellä esitetyistä tuloksista. Sen tutkimiseksi, vaikutuksen CDH17 on integriinien tai Ras-proteiini on suora vuorovaikutus vai ei, samanaikainen immunosaostus ja CDH17 kanssa integriini β1, integriinin β4, integriinin β5, integriinin α2, ja Ras tehtiin mahasyövän AGS soluja, tässä järjestyksessä. Out odotuksia, toisin kuin Bartolome tulokseen [11], ei ollut suoraa yhteyttä välillä CDH17 ja jokin näistä integriinien tai Ras proteiinia (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

On suuri haaste kliinikoille ja perus tutkijat määrittää molekyylimarkkereiden liittyy etenemisen ja ennusteen liittyvien syöpien. Maksan ja syöpien, uskotaan, että korkea ilmentyminen CDH17 oli yhteydessä huonoon säilymiseen, kasvaimen uusiutumisen, kasvaimen invaasio, etäpesäke ja kehittynyt kasvain vaiheessa [23] - [25]. Nykyisissä tutkimuksessa niistä 30 paneelit GC solulinjoissa, yli 66% meidän testattujen solulinjojen (20/30) ovat CDH17 positiivisia, ja lähes puolet näistä solulinjoista ovat korkeammat CDH17 ilme. Meidän patologian diagnoosi raportti, 73,6% Kiinan GC syöpäkudokset (159/216) kanna positiivinen CDH17 tahra. Vuonna CDH17 tautitapauksia, ekspressiotaso CDH17 on positiivinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke. Ilmaisulla taso on käänteisesti liittyvän maha- seinä invaasio, kasvaimen etäpesäkkeiden ja kasvaimen TNM vaiheissa. Havaintomme oli yhdenmukainen aiempien kliinisten raporttien [20] - [22]. Kun kaikki tämä todistaa yhdessä, CDH17 voi olla diagnostinen markkeri alkuvaiheen mahasyöpä Kiinan väestö.

Tunnistaa vaikutuksen CDH17 mahasyövän tumorigensis ja metastaattinen potentiaali, sekä oligo siRNA ja TR indusoitavissa pLentiviral vektorien erityiset miRNA (exton13) vastaan ​​CDH17 käytettiin knock-down CDH17 ilmentymistä mahasyövässä solulinjoissa. CDH17 hiljentäminen oligo siRNA voi estää solujen lisääntymisen ja pesäkkeenmuodostusta GC solulinjoissa korkea CDH17 ilme. Inhibitorinen vaikutus oli dramaattinen on AGS, jolla on korkeampi CDH17 ilmaisu, mutta ei BGC823 ja HGC27 soluja, jotka ovat hyvin vähän tai ei lainkaan ekspressiota CDH17 proteiinia (kuvio 2). Se osoitti, että CDH17 ilmentyminen voi myötävaikuttaa syöpäsolujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kyky AGS soluissa. Lisäksi vastaavia tuloksia havaittiin myös tet aiheuttama shRNA välittämää CDH17 knockdovvn in AGS soluissa, jotka johtivat soluproliferaation inhibointi, muuttoliike, tarttuvuus, pesäkkeiden muodostumisen ja apoptoosin induktio ja solusyklin pysähtymisen in vitro. Re-ilmentyminen CDH17 voisi pelastaa leviämisen kyky TR-AGS-CDH17_KD soluissa (kuvio 3). Lisäksi, Tet indusoi yli-ilmentyminen CDH17 TR-MGC803-CDH17_Over solut voitaisiin edistää kasvua tuumoriksenograftien in vivo (kuvio 4). Kun kaikki tämä todistaa yhdessä, voimme päätellä, että on olemassa merkittävä korrelaatio CDH17 ilmaisun ja kasvaimia ja metastaattisen kyvyt mahalaukun syöpä, ja CDH17 voi toimia mahdollisena terapeuttisena kohteena tulevaa tutkimusta.

Vaikka useita aiempia tutkimuksissa oli raportoitu, että hiljentäminen on CDH17 voi estää soluproliferaatiota GC soluissa, signalointi mekanismi CDH17 jää epäselväksi. On todistettu, että CDH17 välittämä onkogeeninen signalointia HCC liittyy Wnt-signalointireitin [5]. Oli kuitenkin joitakin eroja tuloksemme ja raportoimat tulokset Liu HCC. Tulokset osoittavat ei muutu fosforyloitua muodossa glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK-3β säilyttämisen kannalta β-kateniinin tumassa sen jälkeen, kun hiljentäminen CDH17 (tuloksia ei ole esitetty). Tämä ero voidaan selittää käyttöä erilaisten syöpäsolujen tyyppi ja

• PLoS ONE: MicroRNA 135 vaimentaa imusolmukemääritysmenetelmä Etäpesäke kautta Down-asetus ROCK1 Varhaisen Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Kliiniset tulokset mahasyövän seuraavista Adjuvantti chemoradiation Hyödyntämällä intensiteettimoduloitua versus Kolmiulotteinen Conformal Radiotherapy