Abstract
cadherine-17 (CDH17), een lid van 7D-cadherine superfamilie, werd overexpressie bij maagkanker (GC) en werd in verband gebracht met een slechte overleving, tumor recidief, metastase, en geavanceerde tumor stadium. Tot dusver is de celfunctie en signaleringsmechanisme van CDH17 GC blijft onduidelijk. In deze studie hebben we aangetoond dat meer dan 66% van GC cellijnen (20/30) waren positief CDH17. Tissue microarray (TMA) test toonde aan dat 73,6% Chinese GC weefsels (159/216) waren CDH17 positief, terwijl 37% respectieve aangrenzende normale weefsels waren CDH17 positief. Knockdown van CDH17 geremd celdeling, migratie, adhesie en kolonievorming, en ook geïnduceerde een celcyclus en apoptose in AGS menselijke GC cellen. Aan de andere kant, overexpressie van CDH17 vergemakkelijkt MGC-803 GC tumorgroei in naakt muizen. Antilichaam array en Western blot analyse toonde dat knockdown van CDH17 in AGS cellen neerwaarts gereguleerd integrine β serie eiwitten, verder geïnactiveerd de Ras /Raf /MEK /ERK-route en leidde tot p53 en p21 accumulatie, waardoor proliferatie remmen, celcyclus arrestatie en apoptose inductie. Gezamenlijk tonen onze data eerst het vermogen van CDH17 om de activiteit van Ras /Raf /MEK /ERK route voor celproliferatie in GC reguleren, en suggereren dat CDH17 als een aantrekkelijk therapeutisch doelwit voor toekomstig onderzoek kan dienen.
Visum: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Targeting cadherine-17 inactiveert Ras /Raf /MEK /ERK Signalering en remt celproliferatie bij maagkanker. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10.1371 /journal.pone.0085296
Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrijk |
Ontvangen: 10 juni 2013; Aanvaard: 26 november 2013; Gepubliceerd: 20 januari 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd
Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden
Competing belangen: Alle auteurs zijn werknemers of voormalige werknemers van Roche R & D Center (China) met uitzondering van Yanfen Fang, die werknemer van Oost-China Normal University, Shanghai, China.. Dit betekent niet naleving van de auteurs te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen.
Maagkanker (GC) is gerangschikt als de tweede belangrijke oorzaak van de wereldwijde sterfte kanker en de vierde meest voorkomende vorm van kanker in de wereld [1], [2]. De mediane overlevingstijd van GC patiënten 7~10 maanden. De meeste patiënten met GC aanwezig met late stadia van de ziekte met een totale 5-jaars overleving van ongeveer 20% en objectieve respons op conventionele chemotherapeutische regimes bereik kan worden verbeterd van 20% tot 40% [1], [3]. Momenteel, is cisplatine gebaseerde therapie nog steeds veel gebruikt in klinische situaties voor gevorderde en metastatische GC. Bovendien, voor HER2-neu overexpressie maag adenocarcinomen, trastuzumab (Herceptin) in combinatie met chemotherapie verlengt de mediane overleving van 11,1 maanden (alleen chemotherapie) tot 13,8 maanden [4]. Gezien het hoge sterftecijfer van GC, er nog steeds grote medische behoefte aan gevoelige en betrouwbare biomarker voor de vroege diagnose van GC en krachtig therapeutisch doelwit voor de behandeling van GC voorbeeld.
CDH17, een lid van 7D-cadherine superfamilie, presenteert in foetale lever en maag-darmkanaal tijdens de embryogenese, dus wordt ook genoemd als lever-intestinale cadherine (LI cadherine). CDH17 overexpressie in hepatocellulaire carcinoma [5], [6], maagkanker [7], ductaal alvleesklierkanker [8] en colorectale kanker [9] - [11]. Zoals gemeld, was CDH17 voornamelijk aanwezig op het celmembraan en afwezig in normale gastrische weefsels en de positieve bedroeg bijna 78,4% [12]. Het expressieniveau van CDH17 was kenmerkend voor de gevorderde maagcarcinoom die is geassocieerd met een slechte prognose [13]; en het was ook significant geassocieerd met de lymfeknoop metastase bij maagkanker [14]. Knockdown CDH17 met lentivirus gemedieerde miRNA remde de proliferatie, hechting, tumorgroei en metastase van BGC823 menselijke maagkanker cellen zowel in vitro als in vivo [15] - [17]. CDH17 is voorgesteld als een oncogen en een bruikbare marker voor de diagnose van maagkanker [18]. Er is aangetoond dat CDH17 gemedieerde oncogene signalering in HCC houdt verband met Wnt signaling pathway [5]. Recentelijk werd gemeld dat CDH17 geïnduceerde tumorvorming en metastase in lymfatische GC door activatie van NFKB signaleringsroute [19]. CDH17 gereguleerd α2β1 integrine signalering specifieke focal adhesion kinase en Ras activatie, wat leidde tot de verhoging van celadhesie en proliferatie in darmkankercellen [11] induceren. Echter, de belangrijkste rol en de signalering mechanisme van CDH17 in GC blijft onduidelijk. In deze studie aan CDH17 valideren als een therapeutisch doelwit voor GC en de signaleringsmechanisme van CDH17 in GC onderzoeken kenmerk we de expressie van CDH17 in humane cellijnen GC en GC Chinese weefsels, controleerde de invloed van CDH17 knockdown of over- uitdrukking op tumorigene en metastatische effect van GC cellijnen, en onderzocht de mogelijke signaal cascades met betrekking tot CDH17. We zagen een hoge CDH17 expressie in menselijke GC cellijnen en Chinese GC weefsels, en een duidelijke remming in cel proliferatie, migratie, adhesie, vorming kolonie, inductie van apoptose en celcyclus na zwijgen van CDH17 in menselijke GC cellijnen. Bovendien tonen onze resultaten eerst het vermogen van CDH17 om de activiteit van integrine-Ras /Raf /MEK /ERK route voor celproliferatie in GC reguleren, en suggereren dat CDH17 als een aantrekkelijk therapeutisch doelwit voor toekomstig onderzoek kan dienen.
Materialen en methoden
Ethics statement
het gebruik en de verzorging van proefdieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), Roche R & D Center (China). De menselijke GC weefsel blokken met bijbehorende aangrenzend weefsel blokken werden verkregen van Shanghai Biochip Company, een CRO dienstverlenend bedrijf. Alle menselijke weefsels werden verzameld met schriftelijke toestemming van de bron patiënten. Alle cellijnen werden gekocht van ATCC, de VS, Japanse Collection of Research Bioresources en Shanghai Institutes of Biochemistry and Cell Biology, de Chinese Academie van Wetenschappen.
Alle cellijnen van de Amerikaanse Typische Cell Collection (ATCC), de Japanse Inzameling van Research Bioresources en Shanghai Institutes of Biochemistry and Cell Biology, werden de Chinese Academie van Wetenschappen in de respectievelijke groeimedium, die door de leveranciers werden aanbevolen gehandhaafd. PMD-18T-CDH17 plasmide van Sino Biological Inc. tetracycline (Tet) was van Sigma, Cell Counting Kit-8 was van DOJINDO Moleculaire Tech. Menselijk plasma fibronectine was van R &D Systems. Transwell kamer was van Corning (6,5-mm diameter, 8-um poriegrootte). CDH17 oligo siRNA was van Genepharma Co. met de sequentie 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Scram RNA control (Allstar®) was van QIAGEN.
Tweehonderd en zestien paraffine ingebedde maagkanker weefsel blokken samen met de bijbehorende aangrenzend weefsel blokken (aangrenzend weefsel werd ten minste bemonsterd 5 cm afstand van primaire tumoren) werden verzameld en afgezet door Shanghai Biochip Company. Weefsels werden doorgesneden en willekeurig voorbereid op 3 microarray dia's. De leeftijd van de patiënten waren 32-84 jaar (gemiddelde leeftijd 65) met staging van 1A-4 volgens de Amerikaanse Joint Committee on Cancer (AJCC) richtlijnen ver.7. Alle gevallen werden gediagnosticeerd door twee senior pathologen met ervaren specialiteit bij maagkanker pathologie. De schijfjes werden geïncubeerd in blokkerende serum gedurende 20 min, vervolgens bedekt met 100 pl anti-humaan-cadherine 17 affiniteit gezuiverde monoklonale Ab, muis IgG (R &D MAB1032 1:2000 in TBS /T) bij 4 ° C overnacht. De dia's werden gedekt door 100 ul DAKO Envision + /HRP, Konijn /Mouse nadat ze grondig met TBS gewassen. Honderd microliter van substraat-chromogeen oplossing (DAB) werden op de objectglaasjes en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Stained dia's werden microscopisch onderzocht door twee immunohistochemie experts. De normale muis IgG werd gebruikt als negatieve controle. Kleuring als negatief wanneer er geen positieve kleuring celmembraan kunnen worden geïdentificeerd en positief wanneer meer dan 10% van tumorcellen vertoonden celmembraan-positieve immunokleuring.
De pLenti6 /TR vector (Invitrogen, Cat. No. V48020) en pLenti3.3 /TR vector (Invitrogen, Cat. No. A11114) gebruikt om stabiele cellijnen die constitutief hoge niveaus van het Tet-repressor tot expressie te genereren. Deze expressieplasmiden bevatten elementen die het mogelijk maken het verpakken van het construct in virions en blasticidine of geneticine resistentie merker voor selectie van stabiel getransduceerde cellijnen. In het kort, 293FT verpakking cellen (Invitrogen, Cat nr. R700-07) werden met de pLenti6 /TR of pLenti3 /TR en de ViraPower TM Packaging Mix (Invitrogen, Cat. No. K4975-00) aan lentivirale produceren deeltjes. De lentivirus werden gebruikt om cellen of AGS MGC-803 en de blasticidine (8 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. R210-01) of geneticine transduceren (200 ug /ml, Invitrogen, Cat. No. 10.131-027) was gebruikt om te selecteren voor een stabiele-TR tot expressie AGS cellen genaamd TR-AGS stabiele cellijn of TR expressie MGC-803 cellen genaamd TR-MGC-803 stabiele cellijn. Deze TR tot expressie cellijnen werden gebruikt als gastheren voor expressie constructen die Tet-gereguleerde expressie van CDH17 shRNA (short hairpin RNA) of CDH17 gen te vergemakkelijken, respectievelijk. Vier miRNA oligonucleotiden gericht CDH17 gen ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) werden ontworpen met behulp van een internet-applicatie systeem (Invitrogen). Deze dubbelstrengs DNA werden geligeerd in de pcDNA6.2 ™ -GW /EmGFP miR-expressiesysteem (Invitrogen, Cat. No. K4936-00), die vervolgens tijdelijk in AGS-cellen werden getransfecteerd door standaardprocedures Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat nr. 11668-027). Volgens real-time PCR-analyse, de sequentie 90-2 (Voorwaartse primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 ', reverse primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') van miRNAs toonde de hoogste efficiëntie en is gekozen om per vorm BP recombinatie naar pENTR-miRNA te verkrijgen. Dit bericht vector werd vervolgens gebruikt in LR recombinatie met pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. K4920-00) naar pLenti4 /TO /V5-miRNA lentivirus met behulp van Gateway® technologie (Invitrogen, Cat.No.12535-019 verkrijgen ). De lentivirus werden gebruikt om TR-AGS stabiel cellen te transduceren en 200 pg /ml Zeocin (Invitrogen, Cat. No. R250-05) werd gebruikt om te selecteren op een stabiele Tet-gereguleerde CDH17 shRNA expressie cellen genaamd TR-AGS-CDH17_KD stable cell lijn. Stable MGC-803 cellen met Tet-gereguleerde overexpressie van CDH17 gen in het kort werd CDH17 sequentie geamplificeerd van PMD-18T-CDH17 plasmide (Sino Biological Inc.) en gesubkloneerd in IRES -EGFP vector te CDH17-IRES-EGFP verkrijgen via Primers: Voorwaartse primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Reverse primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Dit construct werd gebruikt voor recombinatie BP voeren om pENTR-CDH17-IRES-EGFP verkrijgen. Dan is de toegang vector en pLenti6.3 /TO /V5 (Invitrogen, Cat. No. V370-06) vector werden gebruikt bij LR recombinatie pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP te verkrijgen. Vervolgens werden de lentivirus geproduceerd om TR-MGC-803 stabiele cellen transduceren en 4 ug /ml blasticidine werd gebruikt om te selecteren voor een stabiele Tet-gereguleerde CDH17 genexpressie cellen genaamd TR-MGC-803-CDH17_Over stabiele cellijn. Cell proliferatie assay Voor siRNA tijdelijke transfectie assays werden de cellen uitgezaaid in 10 cm schotel met een dichtheid van 5 x 10 6 cellen /schaal en getransfecteerd met 20 nM siCDH17 of scramble siRNA. Na 48 uur incuberen werden de cellen gedissocieerd en overgebracht naar 96-well plaat aan de dichtheid van 3000 cellen /putje, vervolgens gedurende nog 72 uur. De levensvatbaarheid van de cellen werd geanalyseerd met CCK-8 kit (Donjindo, Japan). Voor TR-induceerbare AGS-CDH17_KD stabiele cellen, werden cellen gezaaid in 60 mm × 15 mm schaal en behandeld met of zonder Tet (0, 2,5 en 5,0 ug /ml) gedurende verschillende tijdstippen. Cellen werden geoogst na 2, 3, 4, 5 en 6 dagen en het aantal cellen werd geteld door ScepterTM Handheld geautomatiseerde celteller (Millipore). Proliferatie redding test werden TR-induceerbare AGS-CDH17_KD stabiele cellen gezaaid in 60 mm × 15 mm schaal en gedurende 10 dagen met of zonder 5,0 ug /ml Tet. Reddings- groep, het kweekmedium dat Tet werd vervangen door vers medium op dag 4, en de cellen werden verder gekweekt worden tot dag 10. De cellen in elke groep werden op dag 2, 4, 6, 8 en 10 voor het tellen van het aantal cellen geoogst en Western blotanalyse. Celmigratie assay TR-AGS-CDH17_KD stabiele cellen werden uitgezaaid in 10 cm schaal en behandeld met of zonder Tet (5 ug /ml). Na 120 uur kweken werden de cellen verzameld en geteld. 0,1 ml celsuspensie (1, 2, 3 x 10 4 cellen /ml) werd aan het bovenste compartiment van de kamer toegevoegd. 0,6 ml 10% FBS medium werd toegevoegd aan het onderste compartiment als chemo attractant toegevoegd. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C werden de cellen gefixeerd met 90% EtOH bij 4 ° C gedurende 30 min en vervolgens gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 15 min. De niet-migrerende cellen werden uit het bovenvlak van de transwell membraan met een wattenstaafje. De gekleurde cellen werden vervolgens gefotografeerd en geteld onder een lichtmicroscoop. TR-AGS-CDH17_KD stabiele cellen werden gezaaid in 10 cm schotel en behandeld met of zonder Tet (5 ug /ml). Pre-coating van 96-wells platen werd uitgevoerd door incubatie putjes met 25 ug /ml fibronectine bij 4 ° C overnacht. Om niet-specifieke binding te verminderen, werd 1% runderserumalbumine (BSA) aan elk putje toegevoegd en gedurende 60 minuten bij 37 ° C, werd BSA tweemaal gewassen met steriele PBS. 120 uur na knockdown CDH17 met Tet, werden cellen verzameld en uitgezet in pre-coated 96-well platen met 4 x 10 4 cellen /putje. 2 uur later, werden niet-hechtende cellen verwijderd door te wassen met steriele PBS twee keer. De hechtende cellen werden getest door de CCK-8 kit. Ten eerste, 6-well platen werden bereid met agar onderste laag (0,6% gel). Vervolgens TR-AGS-CDH17_KD siCDH17 cellen of getransfecteerde cellen (zoals proliferatie assay) in compleet medium bevattende 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) werden gesuspendeerd en uitgezet in bereide 6-well plaat en gekweekt gedurende 7 of 14 dagen. Cellen werden gekleurd met thiazolyl tetrazolium bromide (MTT) gedurende 2 uur. Het aantal cellen kolonies werd geteld. TR-AGS-CDH17_KD stabiele cellen werden gezaaid in een zes puts plaat bij 1,0 x 10 5 cellen /putje en behandeld met 5 ug /ml Tet. 120 h later werden de cellen geoogst met trypsine en met EtOH gedurende 3 uur gefixeerd bij 4 ° C. Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd bij 1500 g gedurende 5 minuten en gewassen met PBS. Geresuspendeerd cellen in RNase /PBS oplossing (20 ug /ml), geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 15 min, vervolgens PI /PBS oplossing toegevoegd (20 ug /ml) en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min, geïnspecteerd de gekleurde cellen met BD FACS Calibur en analyseerde de gegevens met BD CellQuest Pro software. Apoptosis analyse TR-AGS-CDH17_KD stabiele cellen werden gezaaid in een zes puts plaat bij 1,0 x 10 5 cellen /putje en behandeld met 5 ug /ml Tet. 120 h later werden de cellen geoogst met trypsine en gewassen met voorgekoelde PBS keer. Cellen werden geresuspendeerd in 500 gl 1 x bindingsbuffer en 5 pi PI en 5 gl AnnexinV (BD) toegevoegd. Na incubatie in het donker (kamertemperatuur) gedurende 10 minuten werden de gekleurde cellen geïnspecteerd met BD FACS Calibur. De verzamelde gegevens werden geanalyseerd met CellQuest BD Pro software. De cellen werden gelyseerd met RIPA-buffer [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholaat en 10 mM Hepes (pH 7,4)] met een proteaseremmer cocktail (Roche Molecular Biochemicals). Eiwit concentraties werden gekwantificeerd volgens de methode bicinchoninezuur (BCA) (Pierce). Dertig microgram eiwit per monster werd gekookt in loading buffer en geëlektroforeerd op 8-12% gradiënt SDS-polyacrylamide gels (Invitrogen) en overgebracht op nitrocellulose membranen. De membranen werden gehybridiseerd met antilichamen (CDH17, integrine β1, integrine β4, integrine β5, p-p53, p53, p21 waren van R &D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK waren van Celsignalisaties en K-Ras werd van Santa Cruz) gevolgd door een met peroxidase geconjugeerd immunoglobuline. Western blots werden gevisualiseerd met versterkte chemoluminescentie (ECL) kit (GE Healthcare) Antilichaam arrays assay Drie types antilichaam arrays werden verkregen van R &. D Systems, Inc. antilichaam arrays assay. Human Phospho-Kinase Array Kit (Cat. No. ARY003) bevat 43 verschillende kinases. Human oplosbare receptor Array Kit Non-Hematopoietische Panel (Cat. No. ARY012) bevat 119 verschillende oplosbare receptoren. Human Apoptose Array Kit (Cat. No. ARY009) bevat 35 verschillende apoptose antilichamen. Meer uitgebreide informatie over deze arrays kunnen worden gevonden in het verband van R & D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabiele cellen werden geoogst na 120 uur behandeld met of zonder Tet (5 ug /ml) en de eiwitten werden gelyseerd met lysisbuffer met proteaseremmers werden celextracten verdund en geïncubeerd met de drie typen antilichaam arrays nacht . De arrays werden gewassen om ongebonden eiwitten, gevolgd door incubatie met een cocktail van gebiotinyleerde detectie antilichamen te verwijderen. Alle procedures worden volgens de instructies van de kit. Blots werden geanalyseerd met densitometrie en eiwitexpressie werd genormaliseerd naar een positieve controle die werd voorgesteld in elk membraan. TR-MGC803 CDH17_Over-cellen (1 x 10 7-cellen in 0,2 ml PBS) werden geïnjecteerd in een linker oksel van 5~6-week BALB /c nu /nu athymische vrouwelijke muizen (Chinees-Britse SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, China). Tumor volume (mm 3) werd gemeten met schuifmaten en berekend als (W 2 x L) /2, waarbij W de breedte en L de lengte. Wanneer tumorvolume bereikte -100 mm 3, werden de muizen willekeurig in twee groepen (9 muizen in elke groep). Tetracylcine inductie (Invitrogen, 0,2 mg /ml in drinkwater gesteriliseerd met 2,5% sucrose geleverd) werd geïnitialiseerd op de combinatie dag. Gesteriliseerd drinkwater dat 2,5% sucrose werd aan de muizen in niet-geïnduceerde groep. Tumor volumina werden opgenomen na elke 3 dagen tot dieren opgeofferd. Na 35 dagen inductie werden xenograft tumorweefsels verzameld en onderworpen aan Western blot analyse voor relatieve eiwitexpressie. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± s.d. en statistisch onderworpen aan ongepaarde t-test van Student. Een niveau van P < 0,05 werd als significant beschouwd Resultaten Expression profiel van CDH17 bij maagkanker De expressie niveau van CDH17 eiwitten in 30 cellijnen werd gecategoriseerd. in 4 groepen op basis van de gegevens van optische dichtheid analyse tegen beta-actine. AGS cellijn werd gebruikt als interne standaard voor het vermijden van de discrepantie tussen gels. Meer dan 66% van de GC cellijnen (20/30) waren CDH17 positief (Figuur 1A). De expressie en lokalisatie van CDH17 in primaire weefsel paraffine sectie werd gedetecteerd door immunohistochemie op tissue microarrays. Vergeleken met de controle dia's gekleurd door normale muis IgG, CDH17 mAb kleuring werd aangetoond duidelijk celmembraan lokalisatie (Figuur 1B). Onder de 216 gevallen met bevestigde pathologie diagnose rapport, 73,6% kankerweefsel (159/216) koesterde positieve CDH17 vlek met het noteren van + tot +++, terwijl 37% positief CDH17 vlek in de respectievelijke aangrenzende normale weefsels (tabel 1). In CDH17 positieve gevallen, de expressie van CDH17 heeft positieve correlatie met lymfklier metastase. Echter, het expressieniveau omgekeerd geassocieerd met maagwand invasie, tumor- metastasen op afstand, en tumor TNM stadia. Onze waarneming was consistent met eerdere klinische rapporten [20] - [22]. Onder CDH17 positieve gevallen, kankerweefsel tentoongesteld sterkere kleuring van CDH17 (32,1% als scoring +, 25,2% als scoring ++ en 42,8% als scoring +++) dan die van de aangrenzende normale weefsels (62,5% als scoring +, 21,3% als scoren ++ en 16,3% als scoring +++). Terwijl er geen significante relatie waargenomen tussen de vlek scoren en klinische fase. Rekening houdend met al deze bewijst samen kunnen CDH17 een diagnostische marker voor vroeg stadium maagkanker in de Chinese bevolking. op basis van de resultaten van CDH17 expressieprofiel in een panel van GC cellijnen (figuur 1A), AGS (hogere CDH17), BGC-823 (onderste CDH17) en HGC-27 (geen CDH17) cellijnen werden geselecteerd voor verdere in vitro cellulaire functionele assessment met RNAi-gemedieerde CDH17 silencing. Western blotting toonde aan dat AGS cellen had hoge CDH17 eiwitgehalte en expressie van CDH17 werd neergehaald bijna volledig gevloerd door siCDH17. BGC823 cellen hadden lage CDH17 eiwitgehalte en HGC-27 had geen CDH17 eiwit (Figuur 2A). Vergeleken met de scramble controlecellen, CDH17 neerhalen had weinig effect op het proliferatieve vermogen van BGC823 en HGC27 cellen, terwijl dramatisch effect op AGS (at 72 h, figuur 2B met 60%) had. Zachte agar assay toonde aan dat het vermogen om kolonie werd geremd in AGS cellen als CDH17 was neerslaan (met 66% bij 14 d), maar BGC823 cellen en HGC27 cellen, CDH17 neerhalen had weinig effect op de kolonievorming vermogen (Fig 2C). Er was geen duidelijk verschil tussen BGC823 cellen (laag CDH17-niveau) en HGC-27cells (non-CDH17) in de remming van proliferatie en kolonievorming geïnduceerd door siRNA CDH17 knockdown. De doelsequentie in exon13 (90-2) leverde meer dan 90% reductie in mRNA-niveau (figuur 3A). Vervolgens gebruikten we pLenti4 /TO /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus om TR-AGS stabiele cellen transduceren en kreeg een stabiele Tet-gereguleerde expressie van shRNA CDH17 gen-cellen (TR-AGS-CDH17_KD), die de CDH17 eiwit niveau werd verlaagd ongeveer 90% na geïnduceerd met 5 ug /ml Tet (Figuur 3B). De pLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus werd gebruikt om de TR-MGC-803 stabiele cellen transduceren en geselecteerd met blasticidine om een stabiele Tet-gereguleerde expressie krijgen CDH17 gen-cellen (TR-MGC-803-CDH17_Over) . De overexpressie van CDH17 in deze stabiele cel werd bevestigd op eiwitniveau door Western blotting (Figuur 4A). de TR-AGS cellen (controlecellen) en TR-AGS-CDH17_KD cellen werden gebruikt om de mogelijke cellulaire functionele effecten van shRNA-gemedieerde knockdown CDH17 in AGS cellen te beoordelen. TR-AGS-CDH17_KD cellen behandeld met 5 ug /ml Tet bleken de celproliferatie (met 75,8% na 5 dagen), celmigratie vermogen (met 68,1% bij 16 uur), celhechting vermogen (met 46,8% op 30 minuten ) en kolonievormende vermogen (met 92,7% na 7 dagen) in vergelijking met Tet gratis (figuur 3C). In proliferatie redding studie, kan CDH17 knock-down in TR-AGS-CDH17_KD cellen geïnduceerd door Tet worden gered door het verwijderen van Tet. Na het verwijderen van Tet op dag 4, werd re-expressie van CDH17 waargenomen op dag 8 en 10 van de cultuur in CDH17 shRNA knockdown AGS cellen. Re-expressie van CDH17 kon de verspreiding vermogen van TR-AGS-CDH17_KD cellen (figuur 3D) te redden. Tegenover Tet vrije TR-AGS-CDH17_KD cellen, Tet op cellen toonde een significant verhoogd percentage cellen in G0 /G1 en G2 /M fase en een aanzienlijk overleden percentage cellen in S-fase (figuur 3E). In de tussentijd hebben we waargenomen dat het aantal apoptotische cellen (met 52,2% na 5 dagen) werd verhoogd met neerwaartse regulatie van CDH17 in TR-AGS-CDH17_KD cellen (Figuur 3F). Werd geen significant verschil gevonden in TR-AGS stabiele cellijn met of zonder Tet incubatie. TR-MGC-803-CDH17_Over cellen werden subcutaan geïnjecteerd in de flanken van BALB /c naakt muizen vaste tumor te vormen. De expressie van CDH17 was onder controle van Tet in drinkwater. De resultaten toonden aan dat na 35 dagen inductie, Tet-geïnduceerde groep (tumorvolume = 1849,08 ± 423.46m3) vertoonden een 2,27-maal hogere groei vooruitgang rate versus Tet-vrij groep (tumorvolume = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( figuur 4B), en CDH17 geïnduceerde expressie in tumorweefsels kunnen worden geanalyseerd door Western blotting (Figuur 4C). Aangegeven dat CDH17 speelt een belangrijke rol bij de carcinogenese van maagkanker. We gebruikten ook de TR-AGS-CDH17_KD cellen zien of silencing van CDK17 de tumorigeniciteit in naakt muizen kunnen beïnvloeden. Helaas is de tumor nemen tarief van deze cellijn erg laag was en er geen betrouwbare in vivo resultaten werden waargenomen met TR-AGS-CDH17_KD cellijn. Volgens de tumorigene effecten (remming van celproliferatie, kolonievorming en tumorgroei in vivo) en metastatische effect (remming van celmigratie en adhesie) van CDH17 knockdown kiezen we drie antilichaam arrays (van R &D Systems ) om de relatieve eiwit veranderingen te testen en hopen om krachtige CDH17 geregeld verwante eiwitten te vinden. In de apoptose array fosfo-p53 (S15, S46 en S392) en p21 /CIP1 /CDNK1A expressie verhoogd ongeveer tweevoudig na 5 ug /ml behandeling Tet gedurende 5 dagen in vergelijking met onbehandelde cellen (Figuur 5A (a) en 5B). In het fosfo-kinase array, fosfo-p53 (S15, S46 en S392) expressie toegenomen na Tet behandeling en, tegelijkertijd, expressie fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) daalde (Figuur 5A (b) en 5B). In de oplosbare receptor matrix kan knockdown van CDH17 in AGS cellen aanzienlijk verminderen de expressie van integrine β1, β4, β5, maar heeft geen invloed op de expressie van EGFR (Figuur 5A (c) en 5B). De verandering verhoudingen van geïnteresseerde eiwitten tussen Tet-on en Tet-vrij AGS cellen werden samengevat in figuur 5B. De eiwit verandert van antilichaam-array analyse werd bevestigd door Western blot analyse. De resultaten toonden een significante vermindering van integrine β1, β4, β5 en fosfo-ERK in CDH17 knockdown AGS cellen, maar geen significante verandering in de totale ERK (Figuur 5C). Vervolgens onderzochten we de betrokkenheid van andere Ras /Raf /MEK /ERK signaleringsroute componenten. Knockdown van CDH17 resulteerde in down-regulatie van de Raf, fosfo-MEK en fosfo-ERK-eiwitten (Figuur 5C). Van TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo studie, zagen we de overexpressie van CDH17 verbeterde de integrine β1, β4, β5 expressie en ERK activering (Figuur 4C) en het is in overeenstemming met bovenstaande bevindingen. Om te onderzoeken of het effect van CDH17 op integrinen of Ras-eiwit is direct interactie of niet, een co-immunoprecipitatie van CDH17 met integrine β1, integrine β4, integrine β5, integrine α2 en Ras werd uitgevoerd bij maagkanker AGS cellen. Van de verwachting, in tegenstelling tot het resultaat Bartolomé's [11], was er geen direct verband tussen CDH17 en elk van deze integrinen of Ras-eiwit (gegevens niet getoond). Het is een grote uitdaging voor clinici en fundamentele wetenschappers de moleculaire markers in verband met de progressie en prognose van gerelateerde kanker te bepalen. Lever en maagkankers, wordt aangenomen dat de hoge expressie van CDH17 was geassocieerd met slechte overleving, tumor recidief, tumorinvasie, metastase en geavanceerd stadium tumoren [23] - [25]. In de huidige studie, onder 30 panelen GC cellijnen, meer dan 66% van de geteste cellijnen (20/30) zijn CDH17 positief, en bijna de helft van deze cellijnen hebben een hogere CDH17 expressie. In onze pathologie diagnose rapport, 73,6% Chinese GC kankerweefsel (159/216) koesterde positieve CDH17 vlek. In CDH17 positieve gevallen, de expressie van CDH17 heeft positieve correlatie met lymfklier metastase. Echter, het expressieniveau omgekeerd geassocieerd maagwand invasie, tumor- metastasen op afstand, en tumor TNM stadia. Onze waarneming was consistent met eerdere klinische rapporten [20] - [22]. Met dit alles bewijst samen, CDH17 een diagnostische merker voor startende maagkanker in Chinese populaties. Om het effect van CDH17 identificeren maagkanker tumorigensis en metastatisch potentieel, zowel oligo siRNA en TR induceerbare vectoren met pLentiviral specifieke miRNA (exton13) tegen CDH17 werden gebruikt voor de knock-neer CDH17 expressie bij maagkanker cellijnen. CDH17 silencing door oligo siRNA kon celproliferatie en de vorming kolonie remmen in GC cellijnen met een hoge CDH17 expressie. Het remmende effect was dramatisch op AGS die een hogere CDH17 expressie, maar niet op BGC823 en HGC27 cellen die zeer lage of geen expressie van CDH17 eiwit (Figuur 2). Zij wees erop dat de CDH17 expressie kan bijdragen aan de verspreiding van kankercellen en kolonie vorming vermogen in AGS-cellen. Bovendien werden soortgelijke resultaten ook waargenomen in tet-geïnduceerde shRNA-gemedieerde knockdown CDH17 in AGS cellen waardoor remming van celproliferatie, migratie, adhesie, kolonievorming en inductie van apoptose en celcyclus arrestatie in vitro. Re-expressie van CDH17 kon proliferatievermogen van TR-AGS-CDH17_KD cellen (figuur 3) te redden. Bovendien, Tet geïnduceerde overexpressie van CDH17 in TR-MGC803-CDH17_Over cellen kunnen bevorderen de groei van tumor xenotransplantaten in vivo (figuur 4). Rekening houdend met al deze bewijst samen, kunnen we concluderen dat er een significante correlatie tussen CDH17 meningsuiting en het tumorigene en metastatische mogelijkheden van maagcarcinoom en CDH17 kan als een potentieel therapeutisch doel voor toekomstig onderzoek dienen. Hoewel verscheidene eerdere studies was dat silencing van CDH17 de celproliferatie in GC cellen kunnen remmen gemeld, het signaleringsmechanisme van CDH17 blijft onduidelijk. Er is aangetoond dat CDH17 gemedieerde oncogene signalering in HCC houdt verband met Wnt signaling pathway [5]. Echter, er waren enkele verschillen tussen onze resultaten en de resultaten van Liu gemeld in HCC. Onze resultaten toonden geen verandering in gefosforyleerde vorm van glycogeen synthase kinase 3β (GSK-3β en vasthouden van β-catenine in de kern na silencing CDH17 (gegevens niet getoond). Dit verschil kan worden verklaard door het gebruik van verschillende soorten kankercellen en
Stable AGS cellen met Tet-gereguleerde expressie van shRNA CDH17 gen
celadhesietest
kolonievorming assay
Cell cycle analysis
Western vlekanalyse
Meting van in vivo activiteit
Statistische analyse
-RNAi-gemedieerde knock down CDH17 op GC cellijnen toonde onderdrukking van celproliferatie en kolonievorming in vitro
Stabiele cellijnen uitvoeren TR induceerbare knock-down van CDH17 in AGS cellen en overexpressie van CDH17 in MGC-803 cellen
Knockdown van CDH17 geïnduceerde remming van celproliferatie, migratie, adhesie, kolonievorming en inductie van celcyclus arrestatie en apoptose
Overexpressie van CDH17 bevorderde de groei van de tumor xenotransplantaten in naakt muizen
Determination de bijbehorende eiwit niveaus na knockdown CDH17 door Antibody arrays assay
Knockdown van CDH17 in AGS gedownreguleerd β-integrinen en Ras /Raf /MEK /ERK signaleringsroute
Discussie
Onderzoek toont aan hoe darmmicroben maaggriep beïnvloeden
Rotavirusvaccinatie niet gekoppeld aan risico op diabetes mellitus type 1
Rotavirus speelt rol bij ontwikkeling van type 1 diabetes
Bacteriofagen kunnen E. coli behandelen zonder de darm te beschadigen,
Rauw voer voor huisdieren een risico voor mens en dier
Fecale transplantatie van bepaalde donoren beter dan andere
Genetica kan de samenstelling van het microbioom meer beïnvloeden dan omgevingsfactoren
Onderzoekers die muizen bestuderen aan het Technion-Israel Institute of Technology hebben ontdekt dat het microbioom veel meer wordt beïnvloed door genetica dan door de geboorteomgeving van de moeder.
SARS-CoV N-eiwit wekt de productie van IFN-β op door alomtegenwoordige RIG-I te veroorzaken,
vindt studie Veel leden van de familie Coronaviridae, zoals het ademhalingssyndroom van het Midden-Oosten (MERS), ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS), en het ernstige acute respiratoire syndroom
De helft van de gebruikte medicijnen beschadigt darmbacteriën,
zegt nieuwe studie Een verrassende presentatie op UEG Week 2019, in Barcelona, onthult dat het darmmicrobioom een hoog risico loopt op schade elke keer dat we een medicijn uit een of meer van de 18