Extracto
cadherina-17 (CDH17), un miembro de la superfamilia 7D-cadherina, se sobreexpresa en el cáncer gástrico (CG) y se asoció con una pobre supervivencia, recurrencia tumoral, metástasis y estadio tumoral avanzado. Hasta ahora, la función celular y la señalización mecanismo de CDH17 en GC sigue siendo poco clara. En este estudio, hemos demostrado que más del 66% de las líneas celulares GC (20/30) fueron CDH17 positivo. microarrays de tejidos (TMA) de ensayo mostró que el 73,6% de GC tejidos chinos (159/216) fueron CDH17 positivo, mientras que el 37% respectivos tejidos normales adyacentes fueron CDH17 positivo. Desmontables de CDH17 inhibió la formación de la proliferación celular, la migración, la adhesión y la colonia, y también induce una detención del ciclo celular y la apoptosis en células de GC humana AGS. Por otro lado, la sobreexpresión de CDH17 facilitó el crecimiento del tumor GC MGC-803 en ratones desnudos. matriz de anticuerpos y el ensayo de transferencia de Western demostraron que desmontables de CDH17 en células AGS integrina β proteínas de la serie las reguladas, más inactivan la vía Ras /Raf /MEK /ERK y condujeron a p53 y la acumulación de p21, lo que resultó en la inhibición de la proliferación, ciclo celular la detención y la inducción de apoptosis. En conjunto, nuestros datos demuestran en primer lugar la capacidad de CDH17 para regular la actividad de la vía Ras /Raf /MEK /ERK para la proliferación celular en GC, y sugieren que CDH17 puede servir como una diana terapéutica atractiva para la investigación futura.
cita: Lin Z, C Zhang, Zhang M, D Xu, fang Y, Zhou Z, et al. (2014) Orientación de cadherina-17 inactiva Ras /Raf /MEK /ERK señalización e inhibe la proliferación celular en el cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10.1371 /journal.pone.0085296
Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francia |
Recibido: 10 Junio, 2013; Aceptado: November 26, 2013; Publicado: 20 de enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses: Todos los autores son empleados o ex empleados de Roche R & D Center (china), excepto Yanfen fang, quien es empleado de East china normal University, Shanghai, china.. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
El cáncer gástrico (CG) se sitúa como la segunda causa de mortalidad por cáncer a nivel mundial y el cuarto tipo de cáncer más común en todo el mundo [1], [2]. La mediana de supervivencia de pacientes con cáncer gástrico es 7~10 meses. La mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se presentan con enfermedad en etapa tardía con una supervivencia global a 5 años de aproximadamente 20% y tasas de respuesta objetiva a la gama de regímenes quimioterapéuticos convencionales pueden mejorarse de 20% a 40% [1], [3]. En la actualidad, la terapia basada en cisplatino sigue siendo ampliamente utilizado en la práctica clínica para GC avanzado y metastásico. Además, para que sobreexpresan HER2-neu adenocarcinomas gástricos, trastuzumab (Herceptin) en combinación con quimioterapia prolonga la supervivencia global media de 11,1 meses (quimioterapia sola) a 13,8 meses [4]. Teniendo en cuenta la alta tasa de mortalidad de GC, aún hay gran necesidad médica no satisfecha de encontrar el biomarcador sensible y fiable para el diagnóstico precoz de GC y objetivo terapéutico potente para el tratamiento de GC.
CDH17, un miembro de 7D-cadherina superfamilia, presenta en el hígado fetal y el tracto gastrointestinal durante la embriogénesis, por tanto, también se nombra como el hígado cadherina-intestinal (LI cadherina). CDH17 se sobreexpresa en el carcinoma hepatocelular, [6], cáncer gástrico [7], cáncer pancreático ductal [5] [8] y el cáncer colorrectal [9] - [11]. Como se informó, CDH17 era principalmente presente en la membrana celular y ausente en los tejidos gástricos normales y la tasa positiva era casi 78,4% [12]. El nivel de expresión de CDH17 era característico del carcinoma gástrico avanzado que se asocia con un mal pronóstico [13]; y también se asoció significativamente con la metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer gástrico [14]. Desmontables CDH17 con miARN mediada por lentivirus inhibió la proliferación, la adhesión, el crecimiento tumoral y la metástasis de BGC823 células humanas de cáncer gástrico, tanto in vitro como in vivo [15] - [17]. CDH17 se ha propuesto como un oncogén y un marcador útil para el diagnóstico de los cánceres gástricos [18]. Se ha evidenciado que mediada CDH17 señalización oncogénica en HCC se relaciona con vía de señalización Wnt [5]. Recientemente, se informó de que CDH17 induce la tumorigénesis y la metástasis linfática en GC a través de la activación de NFkB vía [19] de señalización. CDH17 regulado α2β1 integrina de señalización para inducir la quinasa de adhesión focal específico y la activación de Ras, lo que condujo al aumento de la adhesión y proliferación celular en las células de cáncer de colon [11]. Sin embargo, el papel y la señalización principal mecanismo de CDH17 en GC sigue sin estar clara. En este estudio, para validar CDH17 como una posible diana terapéutica para la CG y para investigar el mecanismo de señalización de CDH17 en GC, se caracterizó la expresión de CDH17 en líneas de células y tejidos humanos GC GC chinos, comprobó la influencia de CDH17 caída o exceso expresión de efecto tumorigénico y metastásico de líneas celulares de GC, y exploró las posibles cascadas de señales relacionadas con CDH17. Se ha observado una expresión de alto CDH17 en líneas celulares y tejidos humanos GC GC chinos, y una clara inhibición de la proliferación celular, la migración, la adhesión, la formación de colonias, la inducción de la apoptosis y la detención del ciclo celular después de silenciamiento de CDH17 en líneas celulares humanas GC. Además, nuestros resultados demuestran en primer lugar la capacidad de CDH17 para regular la actividad de la integrina-Ras vía /Raf /MEK /ERK para la proliferación celular en GC, y sugieren que CDH17 puede servir como una diana terapéutica atractiva para la investigación futura.
Materiales y Métodos
Ética declaración
el uso y cuidado de los animales de experimentación fue aprobado por el Comité Institucional de animales cuidado y uso (IACUC), Roche R & D Center (República Popular china). Los bloques de tejido GC humanos con bloques de tejido adyacentes correspondientes se obtuvieron de Shanghai biochip Company, una empresa de servicios CRO. Todos los tejidos humanos fueron recogidos con el consentimiento por escrito de los pacientes de origen. Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC, EE.UU., Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación, y Shanghai Institutos de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias.
Todas las líneas celulares a partir de la Colección Americana de la célula típica (ATCC), Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación, y Shanghai Institutos de Bioquímica y Biología celular, Academia de Ciencias de china se mantuvieron en medio de crecimiento respectiva que fueron recomendados por los fabricantes. PMD-18T-CDH17 plásmido fue de Sino Biológica Inc. tetraciclina (Tet) fue de Sigma, Cell Counting Kit-8 era de Dojindo Molecular Tech. El plasma humano fibronectina era de I +; D systems. Transwell cámara era de Corning (diámetro, 8-micras de tamaño de poro 6,5 mm). CDH17 oligo siRNA era de Genepharma Co. con la secuencia 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Scram control de ARN (Allstar®) era de QIAGEN.
Doscientos dieciséis incluidas en parafina bloques de tejido de cáncer gástrico, junto con los correspondientes bloques de tejido adyacente (tejido adyacente se tomaron muestras de al menos 5 cm de distancia de los tumores primarios) fueron recogidos y depositados por Shanghai biochip Company. Los tejidos se seccionaron y prepararon de forma aleatoria en 3 diapositivas micro matriz. Las edades de los pacientes fueron 32-84 años (media de 65 años) con puesta en escena de 1A-4 de acuerdo con la American Joint Committee on Cáncer (AJCC) Ver.7 directrices. Todos los casos fueron diagnosticados por dos patólogos de alto nivel con la especialidad con experiencia en patología de cáncer gástrico. Los portaobjetos se incubaron en suero de bloqueo durante 20 min, luego se cubre con 100 l anti-humano Cadherina-17 afinidad monoclonal purificado AB, IgG de ratón (amp I +; D MAB1032 1:2000 en TBS /T) a 4 ° C durante la noche. Las diapositivas fueron cubiertos por 100 l Dako Envision + /HRP, conejo /ratón después de ser lavado a fondo con TBS. Cien microlitros de solución de sustrato-cromógeno (DAB) se aplicaron a los portaobjetos y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Los cortes teñidos se examinaron microscópicamente por dos expertos de inmunohistoquímica. La IgG de ratón normal se utilizó como control negativo. La tinción se considera que es negativo cuando no tinción de membrana de células positivas se pudo identificar y positiva cuando más de 10% de las células tumorales mostraba inmunotinción de células positivas a la membrana.
El pLenti6 /TR vector (Invitrogen, Cat. No. V48020) y pLenti3.3 /TR vector (Invitrogen, Cat. No. A11114) se utilizaron para generar líneas celulares estables que expresan constitutivamente altos niveles del represor Tet. Estos plásmidos de expresión contienen elementos que permiten el embalaje de la construcción en viriones y la blasticidina o marcador de resistencia a geneticina para la selección de líneas celulares establemente transducidas. Brevemente, células de empaquetamiento 293FT (Invitrogen, Cat. No. R700-07) se transfectaron con el pLenti6 /TR o pLenti3 /TR y la ViraPower Mix TM Packaging (Invitrogen, Cat. No. K4975-00) para producir lentiviral partículas. El lentivirus se utilizaron para transducir células AGS o MGC-803 y de la blasticidina (8 g /ml, Invitrogen, Cat. No. R210-01) o geneticina (200 mg /ml, Invitrogen, Cat. No. 10131-027) era se utiliza para seleccionar de una estable células AGS TR-expresión citada TR-AGS línea celular estable o TR-que expresan las células MGC-803 citada TR-MGC-803 línea celular estable. Estas líneas celulares que expresan TR se utilizaron como huéspedes para construcciones de expresión que faciliten la expresión regulada-Tet de CDH17 shRNA (ARN corto horquilla) o el gen CDH17, respectivamente. Cuatro oligonucleótidos dirigidos miARN gen CDH17 ([Homo sapiens] gene ID: 1015) fueron diseñados utilizando un sistema de aplicación de Internet (Invitrogen). Estos ADN de doble cadena se ligó en el pcDNA6.2 ™ sistema de expresión -GW /EmGFP-MIR (Invitrogen, Cat. No. K4936-00) que luego se transfectaron transitoriamente en células AGS por los procedimientos estándar Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat . No. 11668-027). De acuerdo con el análisis de PCR en tiempo real, la secuencia de 90-2 (Cebador directo: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 '; cebador inverso: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') de miRNAs mostró la mayor eficiencia y se eligió a por forma de recombinación BP para obtener pENTR-miARN. Este vector de entrada se utilizó en LR recombinación con pLenti4 /A /V5 (Invitrogen, Cat. Nº K4920-00) para obtener pLenti4 /A /V5-lentivirus miARN utilizando la tecnología de Gateway (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). El lentivirus se utilizaron para transducir células estables TR-AGS y 200 mg /ml de zeocina (Invitrogen, Cat. No. R250-05) se utilizó para seleccionar para un establo células de expresión CDH17 shRNA regulados-Tet nombrados celular estable TR-AGS-CDH17_KD la línea. Estable MGC-803 células con sobreexpresión regulada-Tet de CDH17 gen en pocas palabras, la secuencia CDH17 se amplificó a partir PMD-18T-CDH17 plásmido (Sino Biológica Inc.) y subclonado en IRES vector EGFP para obtener CDH17-IRES-EGFP mediante el uso de cebadores: cebador directo: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Cebador inverso: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Este constructo se utilizó para realizar la recombinación BP para obtener pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Entonces el vector de entrada y pLenti6.3 /A /V5 (Invitrogen V370-06 Nº Cat.) Vectores se utilizaron en la recombinación LR para obtener pLenti6.3 /A /V5-CDH17-IRES-EGFP. A continuación, el lentivirus fueron producidos para la transducción de MGC-803 TR-células estables y 4 mg /ml blasticidina se utilizó para seleccionar las células estables durante la expresión de genes regulados-Tet CDH17 citada TR-MGC-803-CDH17_Over línea celular estable. proliferación de las células de ensayo Para siRNA ensayos de transfección transitoria, las células se sembraron en placa de 10 cm con una densidad de 5 × 10 6 células /placa y se transfectaron con 20 nM siCDH17 o scramble siRNA. Después de 48 h de incubación, se disociaron las células y se transfirieron a placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células /pocillo, luego se incubaron durante otras 72 h. La viabilidad celular se ensayó con CCK-8 kit (Donjindo, Japón). Para las células estables AGS-CDH17_KD TR-inducible, las células fueron sembradas en 60 mm × 15 mm plato y se tratan con o sin Tet (0, 2,5 y 5,0 mg /ml) para diferentes tiempo. Las células se recogieron después de 2, 3, 4, 5 y 6 días y el número de células se contaron por ScepterTM de mano Automated Cell contador (Millipore). Para el ensayo de rescate de la proliferación, las células estables AGS-CDH17_KD TR-inducibles se sembraron en 60 mm × 15 mm plato y se cultivaron durante 10 días con o sin 5,0 mg /ml Tet. Para el grupo de rescate, el medio de cultivo que contiene Tet fue sustituido por medio fresco en días 4, y se continuó células a ser cultivadas a día 10. Las células de cada grupo se recogieron el día 2, 4, 6, 8 y 10 para el recuento del número de células y análisis de transferencia de Western. la migración de células de ensayo TR-AGS-CDH17_KD células estables se sembraron en placa de 10 cm y se trataron con o sin Tet (5 mg /ml). Después de 120 h de cultivo, se recogieron y contaron las células. Se añadieron 0,1 ml de suspensión de células (1, 2, 3 × 10 4 células /ml) al compartimento superior de la cámara. 0,6 ml 10% de medio FBS fue añadido al compartimento inferior como un atrayente quimioterapia. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células fueron fijadas con 90% EtOH a 4 ° C durante 30 min y después se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 15 minutos. Las células no migrantes fueron retirados de la cara superior de la membrana Transwell con un hisopo de algodón. Las células teñidas se fotografiaron y se contaron posteriormente bajo el microscopio óptico. células estables TR-AGS-CDH17_KD se sembraron en placa de 10 cm y se trata con o sin Tet (5 mg /ml). Pre-recubrimiento de placas de 96 pocillos se llevó a cabo por los pozos de incubación con 25 mg de fibronectina /ml a 4 ° C durante la noche. Para reducir la unión no específica, se añadió 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a cada pocillo y se incubó durante 60 min a 37 ° C, BSA se lavó dos veces con PBS estéril. 120 h después de la caída CDH17 con Tet, se recogieron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos pre-recubierto con 4 × 10 4 células /pocillo. 2 h después, las células no adherentes se eliminaron por lavado con PBS estéril para dos veces. Las células adherentes fueron analizadas con el kit de CCK-8. En primer lugar, placas de 6 pocillos se prepararon con capa de agar inferior (0,6% de gel). Luego, las células TR-AGS-CDH17_KD o siCDH17 transfectaron células (como ensayo de proliferación) se suspendieron en medio completo que contiene 0,3% -0,4% Noble agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se sembraron en preparado placa de 6 pocillos y cultivaron durante 7 o 14 días. Las células se tiñeron con bromuro de tiazolilo azul tetrazolio (MTT) durante 2 h. Se contó el número de colonias de células. Análisis del ciclo celular análisis de apoptosis Las células se lisaron mediante tampón RIPA [NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,25% de desoxicolato y Hepes 10 mM (pH 7.4)] que contiene un cóctel inhibidor de proteasa (Roche Molecular Biochemicals). Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce). Treinta microgramos de proteína por muestra se hirvió en tampón de carga y a electroforesis en gradiente de 8-12% geles de poliacrilamida SDS (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondaron con anticuerpos (CDH17, integrina beta 1, β4 integrina β5 integrina, p-p53, p53, p21 eran de I +; D, Raf, p-MEK, MEK, p-ERK, ERK eran de la señalización celular, y K-Ras era de Santa Cruz) y seguido por una inmunoglobulina conjugada con peroxidasa. Las transferencias Western se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) Kit (GE, Healthcare) Los arrays de anticuerpos ensayo Hay tres tipos de arrays de anticuerpos se obtuvieron de R &. D Systems, Inc. para el anticuerpo ensayo de arrays. Fosfo-quinasa humana Kit Array (Cat. No. ARY003) contiene 43 diferentes quinasas. Receptor soluble humana Kit Panel Array no hematopoyéticas (Cat. No. ARY012) contiene 119 diferentes receptores solubles. Kit humana matriz de apoptosis (Cat. No. ARY009) contiene 35 diferentes anticuerpos apoptosis. Más información exhaustiva sobre estas matrices se puede encontrar en el enlace de I +; D Systems: http://www.rndsystems.com/. se recogieron las células estables TR-AGS-CDH17_KD después de 120 h tratados con o sin Tet (5 mg /ml) y las proteínas se lisaron mediante tampón de lisis con los inhibidores de la proteasa, los extractos de células se diluyeron y se incubaron con los tres tipos de arrays de anticuerpos durante la noche . Los arrays se lavaron para eliminar las proteínas no unidas, seguido de incubación con un cóctel de anticuerpos de detección biotinilados. Todos los procedimientos son de acuerdo a las instrucciones del kit. Las transferencias se analizaron mediante densitometría, y la expresión de proteínas se normalizó a un control positivo que fue representado en cada membrana. células TR-MGC803-CDH17_Over (1 × 10 7 células en 0,2 ml de PBS) se inyectaron en la axila izquierda de 5~6 semanas BALB /c nu /nu atímicos hembra de ratón (SIPPR china y Gran Bretaña /BK Lab. Animal Ltd, china). El volumen del tumor (mm 3) se midió con calibres y calculado como (W 2 × L) /2, donde W es la anchura y L es la longitud. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm 3, los ratones fueron asignados al azar en dos grupos (9 ratones en cada grupo). inducción Tetracylcine (Invitrogen, 0,2 mg /ml, suministrado en el agua potable esterilizada que contiene 2,5% de sacarosa) se inicializa en el día agrupación. Se suministró agua potable esterilizada que contiene 2,5% de sacarosa a los ratones en el grupo no inducida. Los volúmenes tumorales se registraron cada 3 días hasta que los animales fueron sacrificados. Después de 35 días de inducción, se recogieron los tejidos tumorales de xenoinjertos y se sometieron a análisis de Western blot para la expresión de la proteína relativa. Los datos se expresaron como media ± S. D. y estadísticamente se somete a la prueba t de Student para datos independientes. Un nivel de P < 0,05 se consideró significativo Resultados perfil de expresión de CDH17 en el cáncer gástrico El nivel de expresión de proteínas CDH17 en 30 líneas celulares se clasifican. en 4 grupos en base a los datos de análisis de la densidad óptica contra beta-actina. línea de células AGS se utilizó como estándar interno para evitar la discrepancia entre los geles. Más del 66% de las líneas celulares GC (20/30) fueron CDH17 positivo (Figura 1A). La expresión y localización de CDH17 en la sección de parafina tejido primario se detectó mediante inmunohistoquímica en microarrays de tejidos. En comparación con los portaobjetos de control manchados por IgG de ratón normal, CDH17 mAb tinción se demostró la localización de membrana de células claras (Figura 1B). Entre 216 casos con informe de diagnóstico anatomopatológico confirmó, el 73,6% (159/216 tejidos cancerosos) albergaban tinción positiva CDH17 con puntuación de + a +++, mientras que el 37% tinción positiva en CDH17 respectivos tejidos normales adyacentes (Tabla 1). En los casos CDH17 positivas, el nivel de expresión de CDH17 tiene correlación positiva con metástasis en los ganglios linfáticos. Sin embargo, el nivel de expresión se asocia inversamente con la invasión gástrica pared, metástasis a distancia del tumor y estadios TNM del tumor. Nuestra observación es consistente con informes anteriores clínicos [20] - [22]. Entre los casos positivos CDH17, tejidos cancerosos mostraron tinción fuerte de CDH17 (32,1% como puntuación +, 25,2% como puntuación ++ y 42,8% como puntuación +++) que la de los tejidos normales adyacentes (62.5% como puntuación +, 21,3% como anotando ++ y el 16,3% de puntuación como +++). Si bien no se observó ninguna relación significativa entre la puntuación de la mancha y estadio clínico. Teniendo todo esto evidencia juntos, CDH17 puede ser un marcador de diagnóstico para el cáncer de estómago en estadio temprano en la población china. a partir de los resultados del perfil de expresión CDH17 en un panel de líneas de células GC (figura 1A), AGS (mayor CDH17), BGC-823 (inferior CDH17) y HGC-27 fueron seleccionados (ninguno CDH17) líneas de células para su posterior en la evaluación funcional celular in vitro con el silenciamiento CDH17 mediada por ARNi. Western Blot mostró que las células AGS tenían nivel de proteína de alta CDH17 y expresión de CDH17 fue derribado casi totalmente por siCDH17. células BGC823 tenido bajo nivel de proteínas CDH17 y HGC-27 tenía ninguna proteína CDH17 (Figura 2A). En comparación con las células de control scramble, CDH17 derribando tenido poco efecto sobre la capacidad proliferativa de las células BGC823 y HGC27, mientras que tuvo un efecto dramático en AGS (en un 60% a las 72 h, Figura 2B). ensayo de agar blando mostró que la capacidad de formar colonias fue inhibida en las células AGS si CDH17 era tumbar (en un 66% a los 14 días), pero en BGC823 células y HGC27 células, CDH17 derribando tuvo poco efecto sobre la capacidad de formación de colonias (Figura 2C). No hubo diferencia obvia entre BGC823 células (bajo nivel) y CDH17 HGC-27cells (no CDH17) en la inhibición de la proliferación y la formación de colonias inducida por ARNsi CDH17 caída. La secuencia diana en exon13 (90-2) dio por encima de 90% de reducción en el nivel de mRNA (Figura 3A). A continuación, utiliza pLenti4 /A /V5-miARN-90-2 lentivirus CDH17 para la transducción de células estables TR-AGS y conseguimos una expresión estable regulado por tet shRNA de células de genes CDH17 (TR-AGS-CDH17_KD), que se redujo el nivel de proteínas CDH17 aproximadamente el 90% después de inducir con 5 mg /ml Tet (Figura 3B). El pLenti6.3 /A /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus se utilizó para transducir TR-MGC-803 células estables y selecciona con blasticidina para obtener una expresión regulada-Tet estable células de genes CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) . La sobreexpresión de CDH17 en este celular estable se confirmó a nivel de proteínas por Western Blot (Figura 4A). se utilizaron las células TR-AGS (células de control) y células TR-AGS-CDH17_KD para evaluar los posibles efectos funcionales celulares de la caída CDH17 shRNA mediada en células AGS. células TR-AGS-CDH17_KD tratados con 5 mg /ml Tet mostró una reducción en la proliferación celular (por 75,8% a los 5 días), la capacidad de migración de células (por 68,1% a 16 h), la capacidad de adhesión de células (por 46,8% a los 30 minutos ), y la colonia de capacidad (por el 92,7% a los 7 días de formación) en comparación con Tet libre (Figura 3C). En el estudio de rescate proliferación, CDH17 caída en células TR-AGS-CDH17_KD inducidos por Tet puede ser rescatado mediante la eliminación de Tet. Después de la eliminación de Tet en el día 4, se observó re-expresión de CDH17 en el día 8 y 10 de la cultura en las células AGS desmontables CDH17 shRNA. Re-expresión de CDH17 podría rescatar la capacidad de proliferación de las células TR-AGS-CDH17_KD (Figura 3D). En comparación con las células TR-AGS-CDH17_KD libres Tet, Tet en las células demostró un aumento significativo del porcentaje de células en G0 /G1 y G2 /M fase y un porcentaje fallecido dramáticamente de células en fase S (Figura 3E). Mientras tanto, también se observó que el número de células apoptóticas (un 52,2% a los 5 días) se incrementó en baja regulación de CDH17 en las células TR-AGS-CDH17_KD (Figura 3F). No se encontraron diferencias significativas en el TR-AGS línea celular estable con o sin Tet incubación. células TR-MGC-803-CDH17_Over se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones BALB /c ratones desnudos para formar tumor sólido. La expresión de CDH17 estaba bajo el control de Tet en el agua potable. Los resultados mostraron que después de 35 días de inducción, Tet-inducida grupo (volumen del tumor = 1849,08 ± 423.46m3) mostraron un pliegue 2.27 de mayor tasa de crecimiento progreso frente al grupo-Tet libre (volumen del tumor = 814,04 ± 234.69m3) (p < 0,05) ( la Figura 4B), y la expresión CDH17 inducida en los tejidos tumorales pueden ser analizados por Western Blot (Figura 4C). Se indicó que CDH17 juega un papel importante en la carcinogénesis del cáncer gástrico. También usamos las células TR-AGS-CDH17_KD para observar si el silenciamiento de CDK17 puede afectar a la tumorigenicidad en ratones desnudos. Por desgracia, el tumor se tome razón de esta línea celular fue muy bajo y no fiable en vivo los resultados fueron observados con la línea de células TR-AGS-CDH17_KD. Según los efectos tumorigénicos (inhibición de la proliferación celular, la formación de colonias, y el crecimiento tumoral in vivo) y los efectos metastásico (inhibición de la migración celular y la adhesión) de CDH17 desmontables, elegimos tres arrays de anticuerpos (de R & D systems ) para poner a prueba los cambios en las proteínas relativos y la esperanza de encontrar una potente CDH17 proteínas relacionadas regulados. En la matriz de la apoptosis, fosfo-p53 (S15, S46 y S392) y la expresión /CDNK1A p21 /CIP1 aumentó aproximadamente dos veces después de tratamiento /Tet ml 5 mg durante 5 días en comparación con las células no tratadas (Figura 5A (a) y 5B). En la matriz de fosfo-quinasa, fosfo-p53 (S15, S46 y S392) expresión también aumentó después del tratamiento Tet y, al mismo tiempo, la expresión de fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) disminuyó (Figura 5A (b) y 5B). En la matriz de receptor soluble, desmontables de CDH17 en células AGS podría disminuir significativamente la expresión de la integrina β1, β4, β5, mientras no afectar la expresión de EGFR (Figura 5A (c) y 5B). Los ratios de alteración de las proteínas interesadas entre Tet-On y Tet células AGS-libre se resumen en la figura 5B. Los cambios en las proteínas de ensayo de matriz de anticuerpos fueron confirmados por análisis de transferencia de Western. Los resultados indicaron una reducción significativa de integrina β1, β4, β5 y fosfo-ERK en CDH17 desmontables células AGS, pero ningún cambio significativo en la ERK total (Figura 5C). A continuación, se evaluó la participación de otros componentes de la vía de señalización Ras /Raf /MEK /ERK. Desmontables de CDH17 dio lugar a baja regulación de la Raf, fosfo-MEK y ERK proteínas fosfo-(Figura 5C). De TR-MGC-803-CDH17_Over estudio in vivo, se observó la sobreexpresión de CDH17 mejoró la integrina β1, β4, β5 expresión y la activación de ERK (Figura 4C) y es consistente con los hallazgos anteriores. Para investigar si el efecto de CDH17 en integrinas o las proteínas Ras es la interacción directa o no, un co-inmunoprecipitación de CDH17 con la integrina β1, la integrina β4, β5 integrina, la integrina α2, y Ras se llevó a cabo en las células AGS de cáncer gástrico, respectivamente. Fuera de lo esperado, en contraste con el resultado de Bartolomé [11], no hubo asociación directa entre CDH17 y cualquiera de estas integrinas o las proteínas Ras (datos no mostrados). Es un gran reto para los clínicos y científicos básicos para determinar los marcadores moleculares asociados con la progresión y pronóstico de cánceres relacionados. En el hígado y cánceres gástricos, se cree que la alta expresión de CDH17 se asoció con una pobre supervivencia, recurrencia tumoral, invasión tumoral, metástasis y el estadio tumoral avanzado [23] - [25]. En el estudio actual, entre los 30 paneles de líneas celulares de GC, más del 66% de nuestras líneas celulares ensayadas (20/30) son CDH17 positiva, y casi la mitad de estas líneas celulares tienen una mayor expresión CDH17. En nuestro informe de diagnóstico de la patología, el 73,6% de GC china tejidos cancerosos (159/216) albergaban mancha CDH17 positivo. En los casos CDH17 positivas, el nivel de expresión de CDH17 tiene correlación positiva con metástasis en los ganglios linfáticos. Sin embargo, el nivel de expresión se asocia inversamente invasión de la pared gástrica, metástasis a distancia del tumor y estadios TNM del tumor. Nuestra observación es consistente con informes anteriores clínicos [20] - [22]. Teniendo todo esto en evidencia juntos, CDH17 puede ser un marcador de diagnóstico para el cáncer de estómago en estadio temprano en la población china. Para identificar el efecto de CDH17 en tumorigensis cáncer gástrico y el potencial metastásico, tanto oligo siRNA y TR inducibles vectores con pLentiviral miARN específico (exton13) contra CDH17 se utilizaron para derribo expresión CDH17 en líneas celulares de cáncer gástrico. CDH17 silenciamiento por oligo siRNA podría inhibir la proliferación celular y la formación de colonias en líneas celulares de GC con alta expresión CDH17. El efecto inhibidor fue dramático en AGS, que tiene una expresión CDH17 más alto, pero no en las células BGC823 y HGC27 que tienen muy baja o ninguna expresión de la proteína CDH17 (Figura 2). Se indicó que la expresión CDH17 puede contribuir a la proliferación de células cancerosas y la capacidad de formación de colonias en las células AGS. Además, los resultados similares se observaron también en caída CDH17 mediada por shRNA inducida por tet en células AGS que resultó en la inhibición de la proliferación celular, la migración, la adhesión, la formación de colonias y la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular in vitro. Re-expresión de CDH17 podría rescatar la capacidad de proliferación de las células TR-AGS-CDH17_KD (Figura 3). Además, Tet indujo la sobreexpresión de CDH17 en células TR-MGC803-CDH17_Over podría promover el crecimiento de xenoinjertos de tumores in vivo (Figura 4). Tomando todo esto pone en evidencia en conjunto, podemos concluir que existe una correlación significativa entre la expresión CDH17 y las habilidades tumorigénicas y metastásicas de carcinoma gástrico, y CDH17 puede servir como una posible diana terapéutica para la investigación futura A pesar de que varios anteriores estudios habían informado del hecho de que el silenciamiento de CDH17 podría inhibir la proliferación celular en las células de GC, el mecanismo de señalización de CDH17 sigue siendo poco clara. Se ha evidenciado que mediada CDH17 señalización oncogénica en HCC se relaciona con vía de señalización Wnt [5]. Sin embargo, hubo algunas diferencias entre nuestros resultados y los resultados reportados por Liu en el CHC. Nuestros resultados no mostraron cambio en la forma fosforilada de la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β y la retención de β-catenina en el núcleo después de silenciar CDH17 (datos no mostrados). Esta discrepancia podría explicarse por la utilización de diferentes tipos de células de cáncer y
células AGS estables con expresión regulada-Tet shRNA del gen CDH17
La adhesión celular ensayo
Colonia ensayo de formación de
p>
p>
análisis de transferencia de Western
Medición de la actividad in vivo
El análisis estadístico
RNAi mediada derribar CDH17 en líneas celulares de GC mostró supresión de la proliferación celular y la formación de colonias in vitro
Las líneas celulares estables que llevan TR caída inducible de CDH17 en AGS células y la sobreexpresión de CDH17 en MGC-803 células
Desmontables de la inhibición inducida CDH17 en la proliferación celular, la migración, la adhesión, la formación de colonias y la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis
La sobreexpresión de CDH17 promovió el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos
Determinación de los niveles de proteínas relacionadas después de caída CDH17 mediante el ensayo de arrays de anticuerpos
Desmontables de CDH17 en AGS downregulated ß-integrinas y Ras Raf /MEK /señalización /ERK vía
Discusión
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