Plos ONE: Pretvorba mikromrež Podpis v Diagnostic Test: preskušanju meri 74 Gene Array za pojasnilo in Napoved Prognoza želodca Cancer

Povzetek

Ozadje

rak želodca (GC) je povezana z visoko stopnjo umrljivosti in neugodno prognozo na višjih stopnjah. Poleg tega, da ni učinkovite metode za diagnosticiranje raka želodca v zgodnji fazi ali za napoved izida za izbiro možnosti zdravljenja bolnika specifična. Zato je pomembno, da se razišče nove metode za GC diagnozo.

metodologija /glavnih ugotovitev

Da bi olajšali njeno uporabo v diagnostičnem okolju, je bila skupina 74 genov z diagnostično in prognostično informacij prevedena v meri mikromrež vsebuje zmanjšano niz 1.042 sond primernih za visoko predelavo prepustnost. V tem poročilu smo pokazati prvič, da se meri mini matrika se lahko uporablja kot zanesljivo diagnostično orodje raka želodca. Z AUC vrednostjo 0.565 (95% CI 0,305-0,825), kar kaže na popolno testa, občutljivost in specifičnost diagnoze s krivuljo ROC smo izračunali, da je 70% do 80% oz.

Sklepi /Pomen

Podatki jasno kažejo na ponovljivost in robustnost majhnega prilagojene mikromrež. Matrika je odlično orodje za klasifikacijo in napovedovanje izid bolezni pri bolnikih z rakom želodca

Navedba. Yin Y, Zhuo W, Zhao Y, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) Pretvorba mikromrež Podpis v diagnostičnim testom: preskušanju meri 74 Gene Array za pojasnilo in Napoved Prognoza želodca raka. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10,1371 /journal.pone.0081561

Urednik: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, Združene države Amerike

Prejeto: 25. junij 2013; Sprejeto: 14. oktober 2013; Objavljeno: 3. december 2013

Copyright: © 2013 Yin et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), National Temeljni raziskovalni program Kitajske (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je visoka pojavnost in je drugi najpogostejši vzrok smrtnosti zaradi raka [1,2]. Prognoza GC je močno odvisna od stopnje bolezni pri diagnozi in metodo zdravljenja [3]. Stopnja preživetja 5-letno pri bolnikih z napredovalim rakom želodca je približno 20%, medtem ko je v raka želodca v zgodnji fazi, da je več kot 60% [4-6]. Vendar pa ni bilo učinkovite in izvedljive metode za odkrivanje zgodnjega raka stopnji in za ugotavljanje morebitne napoved za zagotavljanje ustreznega zdravljenja za vsakega bolnika. Na Japonskem, čeprav bi lahko bolj učinkovito odkrivanje in zdravljenje zgodnjega raka želodca (EGC) z obsežnim pregledom, samo endoskopija bi se običajno uporabljajo za EGC odkrivanje. To je razlog, zakaj sta zgodnje odkrivanje in sposobnost za razlikovanje maligne in predrakave lezije pomembno [7]. Zato je pomembno, da razišče nove metode GC diagnostične ali prognostičnih napovedi za klinično prakso.

Nekatere genske spremembe lahko povezana z canceration in napredovanje GC [8-11]. Na primer, prejšnji podatki smo raziskovali predlagal, da bi bilo kolagena geni potencialni biomarker ločiti maligni iz predrakavih lezij v želodcu [12]. Ker je prišlo do napredovanja bolezni iz predrakavih pogoji za GC je dinamičen proces, [13-15], lahko odkrivanje genskih sprememb omogočajo identifikacijo genov povezano bolezni prej kot patoloških preiskav. Poleg tega je izražanje genov zagotavlja dodatne informacije o bolnikovega stanja [16]. Zato lahko analiza mikromrež pomemben in koristen način za diagnosticiranje in stratifikacije tveganja raka želodca.

Poleg tega uporaba prilagojenih mini nizi za klinično prakso, ne sme biti le cenejši, lahko pa zahtevajo tudi manj vnos RNA vzorca za označevanje in hibridizacija in čas za obdelavo podatkov, ki lahko občutno znižane v primerjavi z običajnimi mikromrež [17]. Meri mikromrež 70 genov za prognozo raka dojk, ki ga je odobrila uprava za hrano in zdravila (FDA), preveri izvedljivost meri mikromrež v klinični uporabi [18,19]. Čeprav je bilo več študij o nekaterih skupin genov za GC diagnoze, mikromrež tehnologija trenutno ne uporabljajo kot diagnostično orodje za raka želodca.

V tem prispevku bomo opisali prvič razvoju prilagojene diagnostičnega GC mini matriko in pokazati, da je mogoče po mini niz uporabili kot zanesljivo diagnostično in napovedovanje orodje rak želodca.

Rezultati

A custom mini niz skupino možnih genov, povezanih z GC canceration in napredka

V prejšnji raziskavi smo uporabili oligonukleotidnega mikromrež od 38.500 genov sistematično preučiti diferencialno izražanje genov med 33 vzorcev normalnega, predrakavih sprememb in malignih lezij v želodcu [12]. Frakcija 696 razlikuje-izražanja genov najdemo v formalne študije so bili oblikovani po meri mini paleto kot del raziskovalne baze. Poleg tega je za nekatere skupine, v kateri je bilo ugotovljeno, geni, ki so morda tesno povezana z GC se meri mini-matrika tudi 44 povezanih kolagenskih genov [20-22], 54 genov za spolne hormonskih receptorjev in poti, ki se nahajajo razlikujejo-izražanje genov v drugih študijah, in 915 normalizacija genov (podrobnejših podatkov v tabeli S1). V tej študiji je bila 1042-gen profil izraz uveljavil kot močan diagnozo in napovedovalec izid bolezni pri bolnikih z rakom želodca.

Primerjava Array Uspešnost 1042-Gene z originalnemu 25k mikromrež

Da bi ugotovili, ali se meri preskusna mini-matrika opravlja podobno prvotnih 25 k mikromrež [12], dveh vzorcev ( LYXT in LYXS) iz istih bolnikov, ki se uporabljajo v originalni seriji za razvoj 1042 diagnostiko klasifikator bila najdena. Izrazi za 696 genov, ki nastajajo s pomočjo diagnostične mini niz so bili zelo podobni (Pearson korelacija 0,957, p < 0,01). Originalnih objavljenih podatkov (slika 1)

Identifikacija genov različno izraženih v maligne predrakave želodca tkiva

Vsi podatki hibridizacije je bilo, v ozadju korigirati, normalizirati in analizirajo, da ugotovijo diferenciranih-izražanja genov v 40 vzorcih, ki predstavljajo maligne lezije in prekanceroze (n = 20 v vsaki skupini). Niz 371 genov je bilo ugotovljeno, da loči maligne lezije iz predrakavih lezij pomočjo hierarhično grozdenje in SVM pusti-en-out potrdilo, medtem ko so premaligni vzorec (MGF) razvrščeni v malignega skupino, in pet maligni vzorcev (XSHT, GJFT, CXCT , XYT in QLTT) so bile razvrščene v predrakave skupino. MGF in vzorec so bili zbrani od okoliškega tkiva raka na pečat obroča. Patološko poročilo pokazalo, da je bila XSHT vzorec zmerno diferencirani adenokarcinom, je GJFT vzorec zmerno dobro diferencirani adenokarcinom, medtem ko je bilo CXCT, XYT in QLTT vzorci dobro diferenciran adenokarcinom. Te diferencialno izraženih genov vključenih 199 up-reguliranih genov in 172 navzdol reguliranih genov v malignih lezij v primerjavi z predrakavih lezij (slika 2).

Razlikovanje prognozo želodčnega raka

nadzorovani, hierarhično grozdenje algoritem nam je omogočilo, da bi združil v maligne lezije 20 GC na podlagi njihove podobnosti merijo v pomembnih genov 371 različno izraženih genov med malignimi in predrakavih lezij. Predvsem v levem skupini so bili 4 od 10 občasnih bolnikov v zgodnji fazi GC in drugi predstavljene z visoko diferenciranih poškodb, medtem ko v pravo skupino, 2 10 sporadičnih bolnikov je bilo iz skupine, ki je razvila oddaljenih metastaz v roku 5 let ali z visoko stopnjo in slabo diferenciranih lezij. Tako, s pomočjo nenadzorovane povezovanje, lahko ločimo med "dobro prognozo" in "slabo prognozo" tumorjev do neke mere (slika 3). Poleg tega so bili vrsta in stopnja GC bolnikov povezana z podskupin slabo ali dobro prognozo (tabela 1 in podrobnejših podatkov v tabeli S2).
Skupina 1 (Good prognoza)
skupina 2 (slaba prognoza)
Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (moški /ženske) 7/38 /2Stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /4Pathological tip (Zmerno dobro diferenciranega adenokarcinomom /slabo diferenciranega adenokarcinomom /Signet karcinoma obroč celic /mucinozni adenokarcinom) 7/2/1/03/4/1 /2Metastasis s 5 years13Table 1. faza bolnikov z rakom želodca v dveh skupinah.
CSV Prenesi CSV

meri matrika z najmanjšim številom genov za GC diagnozo in napoved

Nenadzorovana dvodimenzionalna analiza skupek genov grozdenja in GC grozdenja smo izvedli samostojno uporabo agglomerative hierarhično grozdenje algoritem s 371 genov da bi se lahko ugotovilo maligni GC in predrakavih lezij. Koeficient korelacije izraza za vsak gen z izidom bolezni je bila izračunana in ugotovljeno je bilo 252 genov, ki se bistveno povezana z izidom bolezni (korelacijskim koeficientom < -0,3 ali > 0,3) (podrobni podatki v tabeli S1).

Ta 252 geni so navaden odredil na podlagi višine koeficienta korelacije. Število genov v "prognostično razvrščanje" je bila optimizirana z zaporednim dodajanjem dele 5 genov od vrha tega ranga naloži seznam in vrednotenje svojo moč za pravilno razvrščanje ob uporabi "pusti-en-out" način za navzkrižno validacijo. Razvrstitev je bila narejena na podlagi korelacije z izražanjem preostalih vzorcev iz dobrih in slabih bolnikov. Natančnost izboljšano dokler ni bila dosežena optimalna število markerskih genov. Zato je bilo 74 genov ugotovljeno, da je najmanjše število genov, ki se lahko uvrščajo med dvema podskupin različnih prognozo (slika 4). Z bila AUC vrednost 0.565 (95% CI 0.305-0.825), ki kaže odlično test, Občutljivost in specifičnost diagnoze iz krivulje ROC izračunan tako, da je 70% in 80%, v tem zaporedju (slika 5).

Glede na razvrstitev funkcije v Gene ontologijo (GO), funkcionalne pripis za genov, ki sodelujejo pri celičnega cikla, invazijo in metastaz, angiogenezo in signalov bistveno povečana pri slabe prognoze podpisu (označevanje genov, ki so navedeni v tabeli S1). Ti geni vključuje več skupin, za katere funkcija pripis zagotavlja vpogled v osnovni biološki mehanizem, ki vodi do ključnih funkcij, vključenih v tumorigeneze in napredovanje. Geni, ki sodelujejo v celičnem ciklusu, invaziji in metastaz, angiogenezo in signalov je bilo precej različno izražena med dvema podpisov (npr GKN1, INHBA, SPP1 in THBS4). Medtem, nenadzorovana analiza cluster razlikuje med različnimi prognostičnih tumorjev. Z vrednotenjem vseh 74 prognostičnih reporterske gene, več genov iz teh kategorij funkcij postalo jasno (na primer, GKN1, GKN2, GIF, PSCA in LIPF).

Bolniki v obeh skupinah razvrščene po 74 genov in na celi sonde so skoraj enaka, razen LCM vzorca, ki je bil razvrščen v dobrem prognoze skupine v celotnem sond mikromrežnem in v slabo prognozo skupine v klasifikacijo 74-gena. Vzorec LCM zberemo z maligno tkivo pacienta, mucinozni adenokarcinom v stadiju IV s krajšo življenjsko dobo kot druge paciente v formalnih skupinah. Zato lahko uvrstitev mikromrež 74-gen bolj zanesljiv.

Preverjanje 74 genov meri paleto in korelacije podatkov mikromrež s prognostično profila

Za bolnike, GC 11, vključenih v prejšnja študija [12], smo izračunali koeficient korelacije na ravni ekspresije 74 genov z določenega profila povprečnega teh genov v tumorjih pri bolnikih z dobro prognozo (CI). Bolnik s korelacijskim koeficientom več kot -0.007 (prag je povzročila 13-odstotno stopnjo lažnih negativnih rezultatov), ​​nato pa je bila dodeljena v skupino s podpisom dobre prognoze in vsi drugi bolniki so bili dodeljeni v skupino z revnimi -prognosis podpis (slika 6). Poleg tega je krivulja preživetje dveh skupin variira znatno (p 0.05) (slika 7). Tako je klasifikator pokazala primerljivo učinkovitost na potrditev 11 neodvisnih sporadičnih tumorjev in potrdil napovedno moč in robustnost klasifikacije prognoze za 74-gena meri paleto.

Obnovljivost prilagojene mini diod

Za potrditev podatkov o genskih izrazov iz podatkov mikromrež, smo izbrali diferencirana-izražanje gena, INHBA, in preučiti njegovo izražanje s kvantitativno analizo RT-PCR. Naši podatki so pokazali, da je gen bistveno spremenila izraz v malignih tkivih v primerjavi z predrakavih tkiva v 11-pair ujemanjem vzorcev, v skladu z rezultati, pridobljenimi z analizo mikromrež (slika 8).

A podskupini reprodukcijskih povezana genov z želodčno
raka

v 74-gena seznam meri mikromrež smo našli skupino genov z razvrščanjem GO reproduciranja (tabela 2), v kateri je 5 geni za sex hormonskih receptorjev in poti (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 in FOXL2), lahko ne le učinkovito ločeno maligni iz predrakavih vzorcev, ampak tudi razvrstiti slabo in dobro prognozo s hierarhično grozdenje in SVM (slika 9). Poleg tega je imel dva spolnih hormonov geni pomembno differentiated- izraz dobre napovedi za slabo prognozo GC (ESRRG 8.83, AR 0,37, p < 0,01).
Simbol
Zložite spremembo
Simbol
Zložite change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table 2. Geni s klasifikacijo GO reproduciranja v 74 genov mikromrež skupine.
CSV prenos CSV

Pogovor

V tej študiji smo poroča prvič, da bi se lahko meri mikromrež učinkovita metoda za diagnozo in napoved prognoze v PK klinično. Pomanjkanje kliničnih biomarkerjev za zgodnjega raka želodca brez posebnih zgodnjih simptomov vodi do zakasnele diagnoze in prispeva k visoki smrtnosti raka želodca [23]. V nekaterih primerih pride do sprememb le na ravni genov, brez patoloških sprememb. Spremembe v izražanju genov lahko pomaga pri zgodnjem diagnosticiranju, prognoze in smernice zdravljenja pooperativne obsevanja in kemoterapije. Razvoj mikromrež tehnologij omogoča študijo o možnostih patološke preobrata in vrednotenje in usmerjanje zdravljenja. Poleg tega lahko ustvarja ciljno mikromrež opremo, da tehnika bolj uporaben. Zaradi slabe specifičnosti in pomanjkanje zrelega skupne diagnoze, je po meri mikromrež ne uporabljajo v klinični uporabi za rakom želodca, še ni, čeprav obstajajo študije na genski diagnostiki.

uporabo analize mikromrež se pogosto uporablja tehnologijo za študij izražanja genov v svetovnem merilu. Več molekularne teste trenutno uporabljajo v kliničnem ocenjevanju raka izvira iz temeljijo na mikromrežnem genske ekspresije profiliranja. En primer testa, ki temelji na mikromrež je MammaPrint, po meri mikromrež 70 genov, povezanih z nevarnostjo zgodnjega razvoja oddaljenih metastaz pri mladih bolnikih z limfna vozlišča raka negativen dojke. MammaPrint je bil ratificiran s strani FDA. Sposobnost za uporabo tega profila v visokem pretovorne diagnostičnim nastavitev je lahko velika prednost v prognozo in zdravljenje raka dojke [17-19]. Vendar je tehnologija se trenutno ne uporablja kot rutinsko diagnostično orodje pri raku želodca, in ni bilo študija meri mikromrež, ki se uporabljajo v diagnostiki ali napovedi prognozo. V tem poročilu smo pokazati prvič, da se meri mini matrika se lahko uporablja kot zanesljivo diagnostično orodje raka želodca.

V tem prispevku bomo opisali razvoj prilagojene diagnostiko raka želodca mini niz in opiše zanesljivo uporabo v diagnostične okolju. Mnoge klinične študije so v korelaciji spremembe pri izražanju posameznih genov z rezultatom raka želodca, pogosto nasprotujočih si rezultatov. Primeri vključujejo CXCL1, HOXA10 in metiliranje PCDH10 [24-26]. Vendar pa ti geni niso bili vključeni v našem mini matriki. Možno je, da so druge raziskave več pozornosti na funkcije teh genov, medtem ko smo se osredotočili na izražanje mRNA. meri array 74-gen je lahko mogoče napovedno orodje za raka želodca. Podatki jasno kažejo, ponovljivost in robustnost majhnega prilagojene mikromrež. Uporaba meri mikromrež je mogoče zagotoviti več prednosti, kot so natančne informacije o tveganju ponovitve bolezni v primerjavi z običajnimi kliničnimi merili in s tem se bo izboljšala smernice za zahteve terapijo adjuvantno.

Medtem, zaradi 2-krat večjo incidenco pri moških kot pri ženskah z GC [1], več večje epidemiološke raziskave kažejo, da je spol pomemben neodvisen napovedni dejavnik za celokupno preživetje pri bolnikih GC [27,28 ] in moški prevladujejo rakom želodca povezana z 10-15 let zamude pri nastanku raka črevesne tipa želodca, pri ženskah v primerjavi z moškimi [29]. V tem profilu 74 genov meri mini nizov, so 5 geni različno izražena med malignih lezij in predrakavih lezij GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 in FOXL2). je bil prvič predlagan ta skupina spola, povezanih genov z možnimi vlogami v GC, in obstaja nekaj študij o tej skupini genov, povezanih z raka. Pomembno je omeniti, da najkasneje študija Matson in sodelavci poročajo pokazala morebitna pridružitev in pot do DMRT1, FOXL2 in hormona spolov [30]. DMRT1, DMRT3 in DMRTA1 so vsi vključeni v gruči genske družine, ki imajo cink prstom kot DNA veže motiv (DM domene) v skupni, ki je tudi ključni regulator moške razvoj muh in ogorčice. Poleg tega so glavne geni na tej poti vse vključene v naših podatkih. Podatke nam lahko posredujete smeri raziskav za spol, povezanih genov v GC in kažejo na možno pot in mehanizem GC canceration.

Zato bi array lahko odlično orodje za klasifikacijo in napovedovanje izid bolezni pri bolnikih z rakom želodca. Vendar pa obstajajo nekatere omejitve v našem profilu. Vzorce je treba razširiti, da se preveri klinično veljavnost in ponovljivost.

Materiali in metode

Bolniki in vzorci

Štirideset kirurško resekcija želodca z rakom osebki in sosednje non-tumor vzorci so bili pridobljen iz sira Run Run Shaw Hospital, School of Medicine Zhejiang University in so se v obdobju med junijem 2007 in majem 2011. Zbrali smo maligne in predrakavih tkiv iz različnih regij resekcija želodca od vsakega bolnika, ki je prestal operacijo. Štirideset združene vzorce tkiva iz dvajsetih bolnikih s primarnim rakom želodca, ki so bili operirani (dvajset malignih lezij, dvajset predrakave lezije) so bili izbrani za analizo oligonukleotid mikromrež (tabela 1 in podrobnejših podatkov v tabeli S2). Vse zbranih vzorcev so bile določene, vgrajeni, obarvanih s H & E, in z diagnozo Lauren je in WHO razvrščanje neodvisno trije poklicni patologi. Dvanajst parih vzorcev z malignimi in predrakavih lezij pri bolnikih, ki so operacijo so bili izbrani za kvantitativno reverzne transkripcije-PCR (kvantitativni RT-PCR). Rezultati kvantitativne RT-PCR smo primerjali s patološkimi zapisov iz plačnice institucije. Končno patološko analizo je bila določena s soglasjem in če je potrebno pregledati. "Maligni" se nanaša na različne vrste želodčnega raka. "Predrakave" označuje atrofični gastritis, intestinalno metaplazijo in /ali displazije. Osebki so bile takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C do nadaljnje obdelave. Pisna privolitev je bilo pridobljeno pred vzorčenjem, in protokol študija je bila odobrena s kliničnimi raziskavami Odbor za etiko za Sir Run Run Shaw bolnišnici.

Customized Mini-Array

originalni meri 8 * 15k mini-matrika vsebuje 1042 canceration in prognozo povezanih genov enake sond na prvotni niz [12]. Mini-matrika vključenih 696 diferencialno izraženih genov med malignih lezij in predrakavih lezij bolnikov GC, ki smo jih našli v preteklem 38, 500 genskih čipov, 44 povezanih kolagenskih genov, 54 genov za spolne hormonskih receptorjev in poti, in diferencirana-izražanje genov najdemo v druge študije, ki so bile opazila v treh izvodih. Vsak niz vključuje tudi 1042 sonde za hibridizacija in nadzor kakovosti tiskanja, kot tudi 915 normalizacije gene (podrobni podatki v tabeli S1). Osem enakih mini nizi so prisotni na enem 1 "x 3" slide, ki omogoča osem posameznih hibridizacije, ki se izvajajo hkrati (meri v Shanghai biochip Co Ltd, Agilent Technologies).

oligonukleotid mikromrež

Celotna RNA je bila vzeta in očistili z TRIzola Reagent (Invitrogen, ZDA) in RNeasy Mini Kit (Qiagen, Nemčija), s standardnimi postopki, ki jih proizvajalci priporočajo. Stopnje in kvalitete Črna so bile izmerjene z Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, ZDA) in kakovost RNA je bila nadzorovana s standardno 2100 Rin > = 7,0 in 28S /18S > = 0,7. Črna je razdrobljena z Gene Chip Vzorec čist modul (Affymetrix, ZDA) in označi z eno barvo z uporabo programa Agilent povečavo način zapisu. Hibridizacije, barvanje, pranje in skeniranje postopki so bili izvedeni, kot je opisano v Gene Chip Expression analize vgradnih (Affymetrix, ZDA).

Analiza oligonukleotid mikromrež podatkov

Rezultati mikromrež so bili skeniranih z Agilent skener. Podatki so normalizirani in pogovarjala po pridobitvi posnetkov in količinsko opredeliti genov, ki bistveno diferencialnih izrazi uporabljajo za kopiranje programske opreme. Open source razlagati računalniški jezik (R) je bil uporabljen za statistični izračun in grafiko [12]. Neobdelani podatki meri mikromrež je bila naložena na ArrayExpress kot število pristop A-MEXP-2338.

Študij dizajn

Uporabili smo metodo, ki temelji na profilov izražanja genov za razvrščanje želodčnih raka v prognostične in diagnostične kategorije. Metoda je vključevala naslednje korake: (1) oblikovanje po meri mini niz s skupino genov, morda povezani z GC canceration in napredka, ki temelji na predhodnih raziskavah, (2) izbor različno izražanje genov med malignimi in predrakavih lezij (raztegljiv sprememba > 2-krat in p < 0,05), (3), nenadzorovana dvodimenzionalna analiza skupek genov grozdov in GC povezovanjem opravlja samostojno uporabo agglomerative hierarhično grozdenje algoritem (4), izbor diskriminacijo kandidatke gene genov izbrali v 2. koraku po njihovi povezavi s kategorijo (dobro ali slabo prognozo) (5), določitev optimalnega nabora reporter genov z uporabo dopusta-one-out igro postopek potrjevanja (6), prognostične in diagnostične napoved temelji na izražanje genov za optimalno niz reporterskih genov [18,19], (7) GO zapis o reporterskih genov, in (8) analiza korelacije podatkov mikromrež z prognostičnega profila

Kvantitativne RT-PCR analizi

celotna RNA pridobljeni iz vzorcev je bila obratno prepisana na cDNA z glavno scenarij TM RT reagent kit (Takara, Japonska) pri 37 ° C 15 min in pri 85 ° C za 15 sekund. PCR reakcije z uporabo SYBR® premis EX Taq TM komplet smo opravili pri 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov pri 95 ° C 15 sekund, pri 60 ° C za 10 sekund in 72 ° C za 40 sekund s 7500 realnem PCR v realnem času sistem (Applied Biosystems, ZDA). Gospodinjstvo gena β-aktina služil kot notranje kontrole. Naprej primer zaporedje INHBA je GTGATGGCAAGGTCAACATCT, in obratno ena GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.

Statistična analiza

Uporabili smo sorazmerna nevarnosti, regresijska analiza, da se prilagodijo povezavo med koeficientom korelacije (CI) in metastazami za druge spremenljivke. V p-vrednosti, povezane z razmerjem obetov se izračunata po Fisherjev natančni test.

Podpora Informacije
Tabela S1.
informacije genov v korakih po metodah za oblikovanje mini niz in končnih 74 mini-nizov genov.
doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s001
(XLS)
tabeli S2.
podrobnosti o informacijah lezij za mikromrež.
doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s002
(DOC)

• Plos ONE: Mutacija na intronskih ponavlja v Ataksijo-telangiektazije mutiral (ATM), Gene in ATM Protein Izguba v primarnem Rak želodca z mikrosatelitska nestabilnost
• Plos ONE: RhoE Spodbuja metastaze želodčnega raka prek mehanizma Odvisno na povečano ekspresijo CXCR4