Povzetek
Ozadje
Izločeni beljakovin kisla in bogata cistein (SPARC) je glikoprotein, ki deluje tako, da inhibira angiogenezo, proliferacijo in invazijo v različnih vrstah raka. Sposobnost SPARC za moduliranje neovaskularizacijo Domneva se, da bodo deloma posredovana z njegovo sposobnost za moduliranje ekspresije vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGF) in matriksnih metaloproteinaz (MMP). V tej študiji smo želeli ugotoviti vpliv SPARC izražanja v želodcu rakavih celic na proliferacijo in angiogenezo in vitro smo ocenili izražanje SPARC v sedmih človeških želodčnih raka celičnih linijah. Potem smo vzpostaviti stabilno transfektirali SPARC prekomerno celične linije (BGC-SP) in stalni transfekcirajo SPARC knock-down celične linije (HGC-sh). Učinek SPARC prekomerno in SPARC zamolčati smo preučevali s pregledom nastanek kapilarni HUVECs in vitro endogeni SPARC čezmernim inhibira ekspresijo VEGF in MMP-7, kakor tudi angiogenezo s BGC-SP celicami inducirane. Ustrezno SPARC utišanje povečala ekspresijo VEGF in MMP-7, kakor tudi angiogenezo s HGC-sh celicami inducirane. Zvišane angiogenezo s SPARC utišati v HGC-sh celic, povzročena je zmanjšala, ko je VEGF nevtraliziran s protitelesi, in MMP-7 je bil porušen vitro SPARC zavira angiogenezo raka želodca, ki ga navzdol regulacijo ekspresije VEGF in MMP-7 Navedba. Zhang JL, Chen GW, Liu YC Wang PY Wang X Wan il, et al. (2012) Izločeni Protein Kisla in Rich v cistein (SPARC) Zavira angiogenezo, tako Down urejanju Podajanje VEGF in MMP-7 želodčnega raka. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 Urednik: Rajesh Mohanraj, ZAE University, Združeni arabski emirati Prejeto: 9. junij, 2012; Sprejeto: 6. avgust 2012; Objavljeno: 5. september 2012 Copyright: © Zhang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo Financiranje:. To delo je sofinanciran s strani National Natural Science Foundation Kitajske (št 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi Uvod Med smrti zaradi raka, želodčnega raka na drugem mestu na svetu po pljučnega raka; Skoraj se pojavita dve tretjini primerov v državah v razvoju, vključno s 42% iz Kitajske [1]. Angiogenezo je kritičen proces pri raku želodca; Zato, regulativnih in signalne molekule, ki uravnavajo angiogenezo postajajo v središču sedanje raziskave. Angiogenezo ni aktiven proces sam po sebi; je pod nadzorom nekaterih angiogenskih faktorjev in nekaterih zaviralcev angiogenezo. Izločeni protein kisla in bogata cistein (SPARC), znan tudi kot Osteonectin ali BM-40, je večplasten secernirana glikoprotein, ki je izrazil veliko različnih vrst celic in je povezano s tvorbo kosti, fibrozo in popravilo tkiva. Nedavne študije kažejo, da SPARC modulira proliferacije, apoptozo, invazijo in angiogenezo pri različnih vrstah rakavih celic, vendar pa vlogo SPARC v tumourigenesis je zapleteno in se zdi celični tip specifično zaradi njene različne funkcije v danem mikro okolje [2]. SPARC deluje kot supresorski tumorja v dojkah, nevroblastom, trebušne slinavke, jajčnikov in pljučnega raka [3]. Jajčnikov raka na SPARC-null miši divjega tipa živali rasla bistveno večji od tistega, s Povečana raven žilnega endotelija rastni faktor (VEGF) in metaloproteinaz matriksa (MMP) [4]. Z ukinitvijo tumorja prekrvavljenost skozi zatiranje VEGF izražanja in izločanja, SPARC zaviral gliom rasti [5]. SPARC veže na VEGF, tako zavira VEGFR fosforilacijsko, mitogenom aktivirana protein kinaz (MAPK) aktiviranje in-VEGF inducirano sintezo DNK [6]. Vendar vloga SPARC v angiogenezo tudi celični tip specifično, ki spreminja signalov dogodkov v odgovor na edinstvene celične okoljih [7]. VEGF pospešuje angiogenezo, in je najbolj pomemben signal protein jo proizvaja celice [8]. MMP igrajo pomembno vlogo pri razvoju tumorjev, ne le pri oviranju zunajcelični matriks, ampak tudi pri reguliranju angiogenezo. MMP-7, ki je najmanjša molekulska masa vseh družinske člane MMP, se je pokazalo, da pospeši proliferacijo človeških endotelijskih celic umbilikalnih venskih (HUVECs) v način, odvisen od odmerka vitro Glavna funkcija SPARC v angiogenezo želodca raka celičnih linij ostaja nejasna. Zato je v tej študiji, smo predpostavili, da bi SPARC modulirajo proliferacijo in angiogenezo z uravnavanjem VEGF in MMP-7 izraze v želodčnih rakavih celic. Za testiranje te hipoteze, smo testirali izražanje SPARC v sedmih želodčnih raka celičnih linijah. Potem, da se oceni vpliv spremenjene SPARC na želodčnih rakavih celic, smo ugotovili, BGC-SP klon s katero prekomerno SPARC in HGC-sh klon, v katerem se je endogeni SPARC podrli. izražanje SPARC v kulturi želodca raka celic smo ovrednotili izražanje SPARC v številnih človeških želodčnih raka celičnih linijah. Western blot pokazala, da je SPARC nezaznavno v AGS, MKN45, NKI-N87 in BGC-823 celičnih linijah, pa SGC-7901 celična linija izrazil nizko raven SPARC in HGC-27, MGC-803 celične linije izrazil visoko raven SPARC ( Slika 1A). Čezmerno in zavira endogenega SPARC v želodcu rakave celične linije Western blot dokazale, da je bil 43 kDa bend, ki ustreza SPARC beljakovine v BGC-SP znatno povečal (BGC celice ekspresirajočih celic SPARC cDNA), v primerjavi s starševskim (BGC-P) in kontrolnih celicah, transfektiranih s praznim vektorjem (BGC-EV) (P < 0,05); Sparc je zaviral za skoraj dve tretjini v HGC-sh celic (HGC celic, ki izražajo SPARC-shRNA) v primerjavi s celicami HGC-P in HGC-EV (P < 0,05, slika 1B). RT-PCR je pokazala, da je bila SPARC mRNA izraz v BGC-SP celicah povečana v primerjavi s BGC-P in BGC-EV celic (P < 0,05); Sparc mRNA izraz v HGC-sh zmanjšala za skoraj 80% v primerjavi s HGC-P in HGC-EV celic (P < 0,05, slika 1B). SPARC Čezmerno zmanjša proliferacijo iz želodca rakave celične linije Če želite ugotoviti, ali spremenjeni SPARC izraz vpliva na širjenje želodca raka celičnih linij, rast transfekciji celic smo primerjali s tistimi starševskih in praznih vektorskih kontrol. Podatki so pokazali, da je bila rast BGC-SP celic inhibira v primerjavi s celicami BGC-P in BGC-EV po 8 dneh kulture (P < 0,05); rast HGC-sh celic je bilo nekoliko v primerjavi s HGC-P in HGC-EV celic povečal (P < 0,05, slika 1C). SPARC Čezmerno želodčnega rakave celične linije Zmanjša Angiogeneza in vitro Da bi razumeli vpliv spremenjenega SPARC izražanja na angiogenezo v želodcu raka celičnih linijah, so HUVECs inkubirali v pogojenih medijih. BGC-SP Supernatant inducirani HUVECs diferencirajo v kapilarnih podobnih struktur v roku 36 ur (2564,5 ± 553,1 um, P < 0,05), v manjši meri kot supernatanta iz BGC-EV celic (5002,4 ± 665,7 um) in BGC-P celic (5417,3 ± 784,25 um, slika 2A). HGC-sh Supernatant inducirani HUVECs diferencirajo v kapilarnih podobnih struktur v 36 urah (7024,9 ± 923,1 um, P < 0,05) v močnejši meri kot supernatanta iz HGC-EV celic (4456,2 ± 554,2 um) in HGC-P celic (4023,4 ± 665,2 um, slika 2A). Količinsko povprečno dolžino cevi navedeno, da je dolžina cevi za HUVECs v pripravljenih mediju od BGC-SP v primerjavi s kontrolnimi celicami zmanjšala za približno 52,7%; Dolžina cev HUVECs v pripravljenih nosilcev iz HGC-sh klonov se je povečala 74,6% v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 2A). model Okno hrbtni pokazala, da je BGC-SP celice za 40,4% znižanje tumorjem inducirano microvessels v primerjavi s kontrolnimi celicami (P < 0,05). HGC-sh celice v hrbtni kože-kratnega komoro je povzročila 73,2% v microvessels-tumorskih povzročene z večjim številom drobnih krvavitev madežev v primerjavi s kontrolnimi celicami (P < 0,05 Slika 2B). Ti rezultati so jasno pokazali, da SPARC prekomerno raka želodca inhibira angiogenezo in vitro Za določitev vpliva SPARC prekomerno na MMP-7 in VEGF, kvantitativno PCR v realnem času in western-blot analizi so bile izvedene. Rezultati so pokazali, da je bil MMP-7 in VEGF ekspresijo negativno ureja SPARC izražanja. V BGC-SP celice so nivoji MMP-7 mRNA, MMP-7 proteina, VEGF mRNA in VEGF proteina inhibira 87,2%, 68,9%, 48,4% in 58,6% v primerjavi s praznimi vektorsko transfektirana celic. V HGC-sh celic je MMP-7 ravni mRNA povečala 11,6-krat, raven MMP-7 protein poveča 8,1-krat, nivo VEGF mRNA povečala 8,8-krat in nivo VEGF protein povečala 3,2-krat v primerjavi s praznim vektorski celice (slika 3A, B). Da bi ugotovili, ali je bil MAPK signalizacijo pot ureja SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 in p-38 vrednosti so bile ocenjene z western blot. Rezultati so pokazali, da so bile ravni p-ERK1 /2 bistveno zmanjšal v BGC-SP celic in povišano HGC-sh celic v primerjavi s svojimi kontrolnimi celicami (slika 3c). da bi potrdili, da so pro-angiogenih učinki z zmanjšano SPARC izraz so zaradi povečanega MMP-7 in VEGF izražanja in ne na ravni SPARC sama, so HUVECs inkubirali v pogojene medijih pridelanega iz HGC-sh celice z eksogeno dodana rekombinantni človeški SPARC (rhSPARC, 0,3 mg /ml). Naši podatki kažejo, da dodajanje eksogeno SPARC ni zaviral kapilarnih podobne strukture HUVECs primerjavi z HGC-sh (slika 4), za razliko od antiangiogensko odzivnosti na zdravljenje z endogenim izražanje SPARC v BGC823 celicah (slika 2). za nadaljnjo opredelitev vloge VEGF in MMP-7 v SPARC posredovano angiogenezo modulacije, MMP-7-shRNA in 1, g /ml nevtralizacijskih VEGF protitelesa (Chemicon, Temacula, CA, ZDA) so bili uporabljeni za HGC-sh klonov nasprotuje funkcije MMP-7 in VEGF. Preverili smo sposobnost MMP-7 izražanja v HGC-sh celic modulira angiogenezo in vitro za določitev funkcijo povišani VEGF izražanja SPARC utišanje inducirane, VEGF v klimatiziranem medijih HGC-sh in HGC-sh + MMP7-sh celice smo nevtralizirali z VEGF protitelesa (1 mg /ml). Rezultati so pokazali, da je bilo oblikovanje kapilarno od HUVECs v HGC-sh supernatanta, ki vsebuje VEGF nevtralizacijskih protiteles znatno zmanjšal v primerjavi z supernatanta iz samih HGC-sh celic (HGC-sh + anti-VEGF vs serumu brez pogojene mediji obrane od HGC-p, HGC-EV, HGC-sh z ali brez rhSPARC (0,3 mg /ml) in HGC-sh + MMP7-sh celice smo koncentrirali z ultrafiltracijo cevjo (Millipore, Bedford, MA , ZDA) pod enakimi pogoji. Western blot je pokazala, da je bila koncentracija SPARC v HGC-sh celic z 0,3 mikrogramov /ml rhSPARC inmedium enak tistemu iz HGC-P supernatant (slika 4A). Za oceno terapevtske učinkovitosti SPARC izražanja, BGC-p, BGC-EV, BGC-SP celic ali HGC-p, HGC-EV, HGC-sh celice so subkutano injicirali v golih miših. Ni bilo bistvene razlike v velikosti med BGC-P (n = 6; pomeni volumen tumorja = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6; pomeni volumen tumorja = 1856 ± 69 mm 3 ) ksenotransplantati. Znatno zmanjšanje (39,1%), v srednji volumen tumorja je bilo pri živalih vsajenih z BGC-SP presadkov (n = 6; povprečni volumen tumorja = 1130 ± 55 mm 3) v primerjavi z živalmi vsajenih z BGC-EV presadkov ( P < 0,05, slika 5). Ni bilo bistvene razlike v velikosti med HGC-P (n = 6; pomeni volumen tumorja = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; pomeni volumen tumorja = 1708 ± 82 mm 3 ) ksenotransplantati. Znatno povečanje (50,3%), v srednji volumen tumorja je bilo pri živalih vsajenih z HGC-sh presadkov (n = 6; povprečni volumen tumorja = 2412 ± 75 mm 3) v primerjavi z živalmi vsajenih z HGC-EV presadkov ( P <. 0.05, slika 5) Da bi ocenili, SPARC, VEGF, MMP-7 izrazi in vivo Pogovor Da bi raziskali vlogo SPARC pri raku želodca, smo najprej testirali izražanje SPARC v sedmih celičnih linijah raka želodca. Večina celične linije ni izrazil, ali pa samo izrazil nizko stopnjo SPARC. Za določitev vloge SPARC pri rasti in angiogenezo raka želodca, smo ugotovili, BGC-SP klon, ki je bil stalni transfekcirajo s SPARC cDNA vektorja in HGC-sh klonirati, ki je bil stalni transfekcirajo z shRNA vektor ciljanje SPARC mRNA. SPARC izraz v BGC-SP klona bistveno povečala in zmanjšala v HGC-sh klona v primerjavi s svojimi kontrolnimi klone, kot je določeno z zahodne blot in RT-PCR analize. Stopnja celično proliferacijo je bila nižja v BGC-SP klona, in je bila višja v HGC-sh klona kot v njihovih nadzornih klonov po metodi MTT. Prav tako smo ugotovili, da čezmernim SPARC zaviral tumor celic povzroča nastanek kapilarni HUVECs in vitro Krvne žile so bistvenega pomena za zagotavljanje hranil v tkiva . Zato neovaskularizacijo je nujno za razvoj trdnega tumorja. Predhodne študije so pokazale, da ima SPARC vlogo pri angiogenezo [7]. Naši rezultati so pokazali, da prekomerna SPARC zaviral angiogenezo in vitro smo še naprej izvajati študije raziskati vlogo VEGF in MMP-7 v SPARC-posredovane angiogenezo modulacije. Ko je bil rekombinantni humani SPARC protein dodamo kondicioniranega medija iz HGC-sh klona obnoviti koncentracijo SPARC, to pogojeno medij ni spremenila nastanek kapilarni HUVECs s in vitro VEGF igra ključno vlogo pri angiogenezo, in je potrebno za preživetje endotelijske celice [8]. V gliomom, SPARC inhibira rast tumorja, ki spremenijo njegovo mikro okolja in zatirati svoje angiogenezo z inhibicijo VEGF izražanja in izločanja [5]. Lahko obstaja negativna povezava med SPARC in VEGF izrazov, torej, več SPARC, manj VEGF ali obratno MMP-7 je sposoben poniževalno kleti membrane ali vezivnega tkiva okoli plovila. Prav tako stimulira sintezo DNA v kultiviranih vaskularnih endotelijskih celic, in inducira angiogenezo na mestu, kjer so rakave celice kolona vsadi v mišjem modelu [15]. VEGF in drugi angiogenski faktorji delujejo predvsem preko MAPK signalne poti, ki se zdijo pomembni transdukcije poti, ki sodelujejo v procesih neovaskularizacije pri tumorjih [8]. Naša nedavna študija je pokazala, da je bil MMP-7 izraz modulirane preko aktivacije MAPK signalne poti [16]. Številne študije so pokazale tudi, da SPARC negativno modulirane aktiviranje MAPK poti [17]. Zato lahko SPARC izraz spremeni angiogensko ravnovesje v tumorjih z down-, ki ureja vrsto neovaskularizacijo spodbujanje dejavnikov. Da bi raziskali funkcijo SPARC pri regulaciji rasti raka želodca in vivo SPARC izraža v normalnih želodčnih epitelijskih celic, želodčnih rakave celice, in stromalnih celic okoliške raka želodca na nižji ravni [21 ]. Študija imunohistokemija je pokazala, da SPARC izraža predvsem v stromalnih celicah, ki obdajajo tumor [22]. Te razlike ne moremo v celoti pojasniti. SPARC izraz je lahko odvisno od histološki tip tumorja, ali obratno Če povzamemo, zaviranje rasti raka želodca, ki ga SPARC zdi se, da posredujejo prek njegovih učinkov za preprečevanje na MMP-7 in VEGF izrazov, kar lahko zavirajo microvessel infiltracijo tumorjev. Sklepamo, da lahko navzdol ureditev SPARC povezujejo z napredkom raka želodca, in raziskovanje namenjena za urejanje SPARC izraz lahko postane smiseln pristop k izboljšanju zdravljenja raka želodca. Protitelesa in reagenti Protitelesa proti SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (Cell signalizacijo tehnologijo, Danvers, MA, ZDA), VEGF in CD31 (ABcam, Cambridge, MA, USA) so bili uporabljeni za Western blotting-om in imunohistokemijo. RhSPARC je dobavil R &D (Minneapolis, MN, USA). Reverzna transkripcija kit-PCR smo jih Promega (Madison, WI, ZDA). MMP-7-shRNA (KH00809P, Superarray Bioscience Corp Frederick, MD, ZDA) smo uporabili za dol-regulacijo MMP-7 v klonov celic. β-kazein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, ZDA) je bila uporabljena v beta kazein cimografijo. Vsi ostali reagenti so bili analitsko čisti ali boljša. Človekove želodca linije AGS rakava celica, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 so bili pridobljeni iz Cancer Institute kitajske akademije za medicinske vede. Vse celice gojimo v RPMI 1640 mediju, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS). BGC-EV (transficirane s praznim vektorjem) BGC-SP (prekomerno ekspresijo SPARC cDNA), HGC-EV (izražanje prazne vektor) in HGC-sh (izražanje SPARC shRNA) gojimo v popolnem RPMI 1640 z G418 (50 ug /ml) . Vse celice so se ohranili v enoslojne kulture pri 37 ° C v navlaženem zraku s 5% CO 2. Približno 150.000 BGC-823 celice zasadimo na vrtino v šestih vdolbinicami v RPMI 1640 z 10% FBS in pustimo, da se veže preko noči. Ekvimolarne količine pcDNA3.1 s polno dolžino SPARC cDNA vektorja ali nov vektor (Invitrogen, San Diego, CA, ZDA) inkubiramo z Lipofectamine-2000 transfekciji Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, ZDA). Potrjeni SureSilencing človeški SPARC shRNA in prazna nadzor nad prenašalci so bili pridobljeni iz Superarray biološke znanosti Corp. (Frederick, MD, ZDA). HGC-27 celice smo transfektirali kot prej [24] opisano. Na kratko smo celice transfektirali na stabilen način z uporabo Lipofectamine. Transficirane celice so bile izbrane G418 (100 ug /ml BGC-SP in HGC-sh klonov) za 14 dni pred izolacijo individualnih klonov. HGC-sh-MMP7-sh variante bila določena, kot je opisano zgoraj, smo HGC-sh klon celice transficirane z MMP-7-shRNA (KH00809P, Superarray Bioscience Corp. Frederick, MD, ZDA) z uporabo Lipofectamine. Nato smo transfektirane celice z puromicina (1 mg /ml) izbrana za 10 dni. Celica proliferacijo določimo s 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difeniltetrazolijevega bromida (MTT) test, kot je prej opisano [24]. Na kratko, je bilo 500 celice kultiviramo na vdolbino v 96-vdolbinami in inkubirali 8 dni, nato pa MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA) dodamo k celicam. Absorbcijske vrednosti pri 550 nm smo izmerili z bralnikom mikroploščnem. Rezultati so bili prikazani kot pomenilo absorpcijo pri 550 nm in sredstva (± sd) za določitev četverk iz šestih ločenih eksperimentih. Skupaj lizati celic smo pripravili in analizirali z Western blot kot je opisano predhodno [24]. Na kratko smo protitelesa proti SPARC, MMP-7 in VEGF (1:1000 redčenje) uporabljajo za odkrivanje SPARC, MMP-7 in VEGF, medtem ko so protitelesa proti (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 in (p) p-38 (1:800 razredčitev) smo uporabili za ugotavljanje aktivacije signalne poti MAPK. Vezane protitelesa smo prikazali s pomočjo ECL (Promega, Madison, WI, ZDA) na Image Station Kodak 4000 mm Pro sistema (Kodak, Rochester, NY, ZDA). Gostota pasov je količinsko s densitometrične analize z orodjem Image (različica 3.0) sistema. Total RNA smo izolirali iz stalni transfekciji tumorskih celic uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen, San Diego, CA, ZDA) in zdravijo 45 minut pri 37 ° C z RQ1 DNazo (Promega, Madison, WI, ZDA). RNA smo reverzno prepisana uporabo AMV reverzne transkriptaze (A3500, Promega, Madison, WI, ZDA). Kvantitativni PCR v realnem času je bila izvedena v sistemu ABI Prism7300 Sequence Detection (Applied Biosystems, Beverly, MA, ZDA) z uporabo GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, ZDA). Primerji, ki se uporabljajo za kvantitativno PCR v realnem času so bili, kot sledi: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(čut) in 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisense); in VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(čut) in 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisense). Primerji, uporabljeni za PCR so bili naslednji: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(čut) in 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisense); in gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(čut) in 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisense). β-kazein cimografijo funkcionalno aktivnost MMP-7 je bila ocenjena z β-kazeina cimografijo na 10% poliakrilamidnih gelih vgrajeni z 1 mg /ml p-kazein. smo elektroforezo enake količine iz seruma kondicioniranem mediju iz celic, gojenih za 24 ur. Po elektroforezi so bili geli sprali v 2,5% Triton X-100 za eno uro, da se odstranijo SDS. Geli so bili nato inkubirali 18 ur pri 37 ° C v 50 mM Tris /HCl, ki vsebuje 10 mM CaCl 2 in 0,02% NaN 3, obarvali s Coomassie Brillant modro in nato razbarvamo. Proteolitični dejavnosti latentno MMP-7 in vključeno MMP-7 so bili evidentirani kot pasov s molekulskih mas od 28 in 19 kDa, oz. Na, 2 × 10 5 celice HGC-P, BGC-P ali njihove ustrezne stabilno transficiranih klonov smo posejali in inkubirali v popolnem RPMI 1640 na 6 vdolbinami komornih stekelca in pustimo, da raste pri 24 h. Kasneje so bili zbrani pogojene medijev, označeni in shranjeni pri -80 ° C, za uporabo v prihodnosti. Da bi preučili vpliv SPARC na v In vitro Hrbtna Skin-krat zbornica Model Študije so bile izvedene v skladu s protokolom z odobrenim Nega živali in uporaba odbor Univerze Peking (etične odobritve aplikacija številka št J201155). in vivo ksenotransplantskih modeli in Imunohistokemija gole miši so bili randomizirani v različne skupine (n = 6 na skupino). Miši smo cepili subkutano v spodnjem zadnjem boku s človeško BGC-P, BGC-EV, BGC-SP ali HGC-EP, HGC-EV, HGC-sh celice (2 x 10 6 celic na miški). Rast tumorja smo kontrolirali s palpacijo na mestu cepljenja.
in in vivo
.
Način
in hrbtni kože-krat modela komorni in vivo
. Kvantitativni PCR v realnem času in western blot smo izvedli za ugotavljanje, ali so izrazi VEGF in MMP-7 prirediti SPARC izražanja. Za nadaljnje ugotavljanje učinka SPARC izražanja na angiogenezo in vivo
so ksenotransplantskih modeli sedež in gostota microvessel (MVD) različnih klonov so odkrile imunohistokemijo.
Rezultati
.
Zaključek
[9].
Rezultati
in in vivo
in in vivo
.
MAPKs signalizacija Pathway in Izražanje VEGF in MMP-7 se je zaviral s SPARC overexpression
Knock navzdol za SPARC izražanja v HGC-27 celice spodbuja angiogenezo preko Up urejene VEGF in MMP-7 izražanja
s stabilno transfekcijo MMP-7-shRNA v HGC-sh celice. Slika 4A kaže, da je bil izraz MMP-7 v HGC-sh + MMP7-sh celice navzdol ureja stabilno izraža MMP-7-sh-RNA na raven, primerljivo s tisto HGC-P in HGC-EV celic. Osvetliti vlogo MMP-7 v knock-down SPARC posredovano spodbujanje tumorsko angiogenezo-celično povzročena, smo izvedli analizo nastanek kapilar z pripravljenih medijev HGC-sh celic in HGC-sh + MMP7-sh celic. Kot je prikazano na sliki 4B, rezultati kažejo, da je zmanjšala MMP-7 izraza v HGC-sh + MMP7-sh celic, ki so privedli do bistveno zmanjšal tvorbo kapilar, ki jih HUVECs in vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P <. 0.05)
HGC-sh, P < 0,05 slika 4B). Tvorba kapilarno od HUVECs skoraj popolnoma inhibirani ko kultiviramo v pripravljenih medijih HGC-sh + MMP7-sh celic ter dodamo VEGF nevtralizacijska protitelesa ( vs
HGC-sh, P < 0,05 slika 4B).
Čezmerno SPARC v želodcu raka celice Zavira Tumourigenicity v Nude miši
, ksenotransplantskih sekcije smo obarvali z monoklonsko protitelo proti človeški SPARC, VEGF ali MMP-7 . Slika 5A kaže, da BGC-SP tumorji iztisne več SPARC kot BGC-P, BGC-EV tumorjev, pri čemer se sočasno VEGF so MMP-7 izrazi znižala (P < 0,05, slika 5A). Profili iz HGC-sh tumorjev izražajo manj SPARC kot HGC-P, HGC-EV tumorjev, medtem ko se sočasno VEGF so MMP-7 izrazi povečal (P < 0,05, slika 5A). CD31 se uporablja predvsem za dokazovanje prisotnosti žilnih endotelijskih celic v histoloških oddelkov tkiva, ki lahko pomagajo, da ocenijo stopnjo tumorja angiogenezo. Za oceno, ali spremenjeni SPARC izraz posreduje gostoto microvessel (MVD), smo analizirali angiogenezo v presadkov s histološko analizo CD-31. Ni bilo bistvene razlike v MVD med BGC-P (12,5 ± 2,3 microvessels /0,145 mm 2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 microvessels /0,145 mm 2) presadkov. MVD je v BGC-SP zmanjšala 54,8% (5,2 ± 2,1 microvessels na /mm 2) tumorjev v primerjavi z BGC-EV tumorjev (P < 0,05, slika 5). Ni bilo bistvene razlike v MVD med HGC-P (6,4 ± 2,1 microvessels /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 microvessels /0,145 mm 2) ksenotransplantati. MVD je v HGC-sh povišani 51,7% (10,5 ± 1,5 microvessels /0,145 mm 2) tumorjev v primerjavi z HGC-EV tumorjev (P < 0,05, slika 5)
in angiogenezo v hrbtnem oknu testu in vivo
. Po drugi strani, navzdol ureditev SPARC motnje mRNA spodbuja nastanek kapilar in vitro
in angiogenezo in vivo
.
in in vivo
v povezavi z zmanjšanjem MMP-7, VEGF in fosforiliranega ERK1 /2, medtem ko je navzdol ureditev SPARC spodbujati angiogenezo in vitro
in in vivo
v povezavi s povečanjem MMP-7, VEGF in fosforiliranega ERK1 /2.
test v primerjavi s tvorbo kapilaren HUVECs inkubirana v pogoj medij brez zunanjega rhSPARC. Nato smo uporabili MMP-7-shRNA do navzdol regulacijo MMP-7 ekspresijo v HGC-sh klona in /ali anti-VEGF protitelo nevtralizirati VEGF v pripravljenih mediju od HGC-sh klona. Tvorba kapilarno od HUVECs signifikantno inhibira ko so inkubirani v kondicioniranem mediju z nižjo MMP-7 in /ali blokiranem VEGF. Ti poskusi kažejo, da dol ureditev sama je SPARC zadošča za indukcijo neovaskularizacijo in druge dejavnike je treba vključiti v ta proces.
[13], [14].
, BGC-SP in celične klone HGC-sh smo primerjali s svojimi kontrolnimi klone za njihovo sposobnost, da se tvori tumorjev v podkožnem modelu. SPARC overexpression znatno zmanjša velikost ksenotransplantirali tumorja z zmanjšano MVD, navzdol ureditev SPARC ga RNA interference spodbuja rast ksenotransplantirali tumorja z večjim MVD. Zato je v želodčnih presadkov raka, SPARC izraz je negativno povezana z angiogenezo. Prejšnje študije so pokazale, da SPARC prispevala k ureditvi nastanka tumorjev, čeprav se zdi, da je celica tipa specifična njena vloga. V hepatoceličnih presadkov celično linijo raka, SPARC čezmernim znatno zamudo nastanek tumorjev, zmanjša velikost tumorja, in zmanjšala MVD v primerjavi s kontrolno presadkov [18]. V debelem črevesu rakavih tkiv, je SPARC izraz negativno povezana z VEGF izražanja in MVD [19]. V meduloblastom celicah, SPARC čezmernim inhibira angiogenezo vodi do zmanjšanja rasti tumorja [11]. V človeških mikrovaskularnih endotelijskih celic, SPARC zaviral sintezo DNA in vitro
[6]. V nevroblastoma presadkov, SPARC peptidi inhibirajo angiogenezo in rast tumorjev in vivo
[20]. Ti rezultati so potrdili SPARC kot zaviralec tumorsko angiogenezo vivo
.
. Nedavna študija imunohistokemija ugotovljeno, da je SPARC izraz negativno povezana z izražanjem VEGF in MVD v želodcu tkivih raka, in SPARC izraz se je v rakom želodca z višjo stopnjo malignosti [23].
Materiali in metode
Cell Culture
Vzpostavitev BGC-SP, HGC-sh klonov in HGC-sh-MMP7-sh klonov
Cell Proliferation Vsebnost
Western blot analiza
RT-PCR in Quantitative Real-time PCR
Pripravljena Media Collection za eksperimentiranje
endotelijskih celic kapilar, kot Tube Formation Vsebnost
angiogenezo, je test tvorba kapilarne izvedli. V tem testu smo Študiie odpipetiramo predhodno ohlajene 96-vdolbinami (75 ul Matrigel na vdolbino) in polimerizirani 30 minut pri 37 ° C. Da bi ugotovili, če bi spremenili SPARC izraz urejanje angiogenezo, HUVECs (5000 celic na vdolbino) inkubiramo v 100 ul pripravljenih medijev, pridelanega iz različnih vrst celic. Po 36 urah inkubacije smo fotografirali cevaste strukture. Vsak test pogoj je bila ocenjena v štirih izvodih določitev iz treh ločenih poskusih. Slike so bile posnete z Cannon vklop Shot A640 fotoaparat z Olympus invertni mikroskop s 100-kratni povečavi; dolžina cevi je količinsko, z uporabo IPP (različica 6.0, Media Kibernetika, Silver Spring, MD).
postopki so v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali iz National Institutes of Health. Gole miši (stari 6 tednov, ženska, 26-28 g, n = 3 na skupino) so redili in mora ostati v okolju kalčkov brez. Tehnika implantacija je bil prej [11] opisano. Letalski sac hrbtna je bila narejena na miših z vbrizgavanjem 10 ml zraka podkožno, potem ko je žival popolnoma anestezirali. Difuzije komore (Millipore, Bedford, MA, ZDA) smo pripravili z uskladitvijo 0,45 mm Millipore membran na obeh straneh rob obroča "O" s cementom. BGC-P, BGC-EV in BGC-SP; HGC-P HGC-EV ali HGC-sh celice (1 x 10 6) suspendiramo v PBS smo injicirali v komoro. 2 cm dolg rez je na vodoravno vzdolž roba zračnega vrečko hrbtne in komore so bili dani pod kožo. Miši smo usmrtili 10 dni kasneje. Živali so bile skrbno odrte okoli vsajenega komorah. Kožne gube, ki zajemajo zbornice so fotografirali pod vidno svetlobo. preštejemo število krvnih žil.
Omejeno črevesno vnetje pri COVID-19
Dobra novica za bolnike s črevesno črevesno boleznijo, saj raziskovalci ugotavljajo "črevesno srbenje"
Nova strategija bi lahko okrepila komunikacijo med črevesjem in možgani
COVID-19:Kako izgleda bolezen
Ljudje s simptomi IBS, ki imajo verjetno nizko raven vitamina D,
Kislinski pH poveča okužbo s SARS-CoV-2 z regulacijo receptorjev ACE2
Običajne glive na koži lahko povzročijo vnetne črevesne bolezni
Terapije, ki ciljajo na nekatere komenzalne glive, bi lahko zagotovile nov način zdravljenja vnetne črevesne bolezni (KVČB), po mnenju raziskovalcev LA. Ozadje | Shutterstock Za KVČB so z
Študija kaže na povezavo med uporabo probiotikov in "zamegljenostjo možganov"
Študija, opravljena na Medicinski fakulteti v Georgii na Univerzi Augusta, je pokazala, da lahko vnos probiotikov povzroči znatno kopičenje bakterij v tankem črevesju, kar vodi v zamegljenost možganov
Na novo odkriti veliki fagi zamegljujejo življenjsko/neživljenjsko mejo
Nova študija, objavljena v reviji Narava kaže, da obstaja dobesedno na stotine virusov, ki so dovolj veliki, da porabijo bakterije, in z lastnostmi, ki so značilne za živi organizem in ne za nežive