abstraktné
Pozadie
sekrečnú proteín, kyslý a bohaté na cysteín (SPARC) je glykoproteín, ktorý funguje tak, že inhibujú angiogenézu, proliferáciu a inváziu v rôznych typoch rakoviny. Schopnosť modulovať SPARC neovaskularizácii sa predpokladá, že sú sprostredkované čiastočne svoju schopnosť modulovať expresiu vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF) a matrix metaloproteinázy (MMP). V tejto štúdii sme sa zamerali na zistenie účinku SPARC expresie v nádorových bunkách žalúdku na proliferáciu a angiogenézu in vitro stroje a in vivo Hodnotili sme expresiu SPARC v siedmich ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. Potom sme založili stabilne transfekovaná SPARC nadmerne vystavený bunkové línie (BGC-SP) a stabilne transfekované SPARC knock-down bunkové línie (HGC-sh). Účinok SPARC nadmernou expresiou a SPARC umlčanie bola študovaná skúmaním tvorby kapilárnej HUVEC in vitro stroje a chrbtovej kožnej riasy priestoru modelu in vivo endogénne SPARC nadmerná expresia inhibuje expresiu VEGF a MMP-7, ako aj na angiogenézu indukovanú BGC-SP buniek. Zodpovedajúcim spôsobom, SPARC tlmenie hluku zvyšuje expresiu VEGF a MMP-7, ako aj na angiogenézu indukovanú HGC-SH buniek. Zvýšená angiogenézy vyvolanej SPARC umlčanie v HGC-sh buniek bola znížená, keď bol VEGF neutralizovaná protilátkami, a MMP-7 bola zbúraná in vitro SPARC potláča angiogenézu rakoviny žalúdka tým, down-reguláciu expresie VEGF a MMP-7 Citácia :. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) sekrečné proteín, kyslé a bohaté na cysteín (SPARC) Potláča angiogenézy Down-reguláciu expresie VEGF a MMP-7 v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 Editor: Rajesh Mohanraj, UAE University, Spojené arabské emiráty Prijaté: 9. júna 2012; Prijaté: 06.08.2012; Uverejnené: 05.09.2012 Copyright: © Zhang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané Financovanie :. Toto dielo bol financovaný národné prírodné Science Foundation Číny (č 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú Úvod Medzi úmrtí súvisiacich s rakovinou, rakovina žalúdka na druhom mieste na svete po rakovine pľúc; Takmer nastať dve tretiny prípadov v rozvojových krajinách, vrátane 42% z Číny [1]. Angiogenézy je kritický proces v karcinómu žalúdka; Preto, regulačných a signalizačných molekúl, ktoré modulujú angiogenézy sa stávajú ohniskom súčasného výskumu. Angiogenézy nie je aktívny proces sám o sebe; je riadený niektorými angiogénnych faktorov a niektoré inhibítory angiogenézy. sekrečnú proteín, kyslé a bohatý na cysteín (SPARC), tiež známy ako osteonektin alebo BM-40, je mnohostranný secernovaný glykoproteín, ktorý je vyjadrený veľa rôznych typov buniek a je spojená s tvorbou kosti, fibrózou a obnovu tkanív. Nedávne štúdie ukazujú, že SPARC moduluje proliferáciu, apoptózu, invázie a angiogenézy u rôznych typov nádorových buniek, však úlohu v SPARC tumorogenézy je zložitá a zdá sa, že bunky špecifické pre typ vzhľadom k jeho rozmanitých funkcií, v danom mikro-prostredia, [2]. SPARC funguje ako nádorový supresor v prsníku, neuroblastómu, pankreasu, vaječníkov a rakoviny pľúc [3]. Ovariálny karcinóm v SPARC-null myšou vzrástla významne väčšie ako v divokého typu zvierat so zvýšenou úrovňou vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) a matrixom metaloproteinázy (MMP), [4]. Potlačením nádoru prekrvenie prostredníctvom potlačenie VEGF expresiu a sekréciu, SPARC inhibuje rast gliómu [5]. SPARC sa viaže na VEGF, čím dochádzalo k inhibícii VEGFR fosforylácie, mitogénom aktivované proteínové kinázy (MAPK), aktivácia a syntézu DNA vyvolanú VEGF [6]. Avšak role SPARC angiogenézy je tiež bunky špecifické pre typ, ktorý mení signál transdukcie udalosti v reakcii na jedinečných bunkových prostrediach [7]. VEGF stimuluje angiogenézu, a je najdôležitejšia signál proteín produkovaný bunkami [8]. MMP hrajú dôležitú úlohu vo vývoji nádoru, a to nielen v degradácii extracelulárnej matrix, ale aj v regulácii angiogenézy. MMP-7, čo je najmenší molekulová hmotnosť všetkých členov rodiny MMP, bolo preukázané, že urýchlenie proliferáciu ľudských endotelových buniek pupočníkovej žily (HUVEC) v spôsobom závislým od dávky in vitro primárnou funkciou SPARC angiogenézy žalúdočných nádorových bunkových línií zostáva nejasný. Preto sa v tejto štúdii sme predpokladali, že SPARC môže modulovať proliferáciu a angiogenézu prostredníctvom regulácie VEGF a MMP-7 výrazy buniek karcinómu žalúdka. Ako tieto hypotézy otestovať, sme testovali expresiu SPARC v siedmich žalúdočných nádorových bunkových línií. Potom, posúdiť účinok pozmenenej architektúre SPARC na rakovinových bunkách žalúdka, sme založili BGC-SP klon, ktorý nadmerne exprimované SPARC a HGC-sh klon, v ktorom bol endogénne SPARC zrazený k zemi. vyjadrenie SPARC v kultivovaných žalúdočnej nádorových buniek Hodnotili sme expresiu SPARC v niekoľkých ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. Westernový prenos ukázal, že SPARC bol undectable v bunkových líniách AGS, MKN45, NCI-N87 a BGC-823, ale SGC-7901 bunkové línie vyjadril nízku hladinu SPARC a HGC-27 MGC-803 bunkové línie vyjadril vysokú úroveň SPARC ( obrázok 1A). Nadmerná expresia a Inhibícia endogénneho SPARC v žalúdku nádorových bunkových línií Western blot ukázala, že 43 kDa prúžok zodpovedajúci proteínu SPARC bola významne zvýšená v BGC-SP (BGC buniek SPARC exprimujúcich cDNA buniek) v porovnaní s rodičovskými (BGC-P) a kontrolných buniek transfekciou prázdnym vektorom (BGC-EV) (P menšie ako 0,05); SPARC bola inhibovaná takmer dve tretiny v HGC-sh buniek (HGC buniek exprimujúcich SPARC-zhrnieme) v porovnaní s HGC-P a HGC-EV buniek (P menšia ako 0,05, obrázok 1B). RT-PCR ukázala, že SPARC mRNA expresie v BGC-SP buniek bola zvýšená v porovnaní s BGC-P a BGC-EV buniek (P menšia ako 0,05); výraz SPARC mRNA v HGC-SH sa znížil o takmer 80% v porovnaní s HGC-P a HGC-EV buniek (P menšia ako 0,05, obr 1B). SPARC Zvýšená expresia znižuje proliferáciu žalúdočných rakovinové bunkové línie na určenie, či zmeniť SPARC výraz vplyv na proliferáciu bunkových línií karcinómu žalúdka, rast transfekciou buniek boli porovnané s tými, rodičovských a prázdnych kontrol vektor. Dáta ukázali, že rast BGC-SP buniek bol inhibovaný v porovnaní s BGC-P a BGC-EV buniek po 8 dňoch kultivácie (P menšia ako 0,05); rast HGC-sh buniek sa mierne zvýšil v porovnaní s HGC-P a HGC-EV buniek (P menšia ako 0,05, Obrázok 1C). SPARC Nadmerná expresia v žalúdočnej nádorových bunkových línií Znižuje Angiogenézy in vitro Ak chcete pochopiť dopad zmenené SPARC prejavu na angiogenézu v žalúdku rakovinových bunkových línií, HUVEC boli inkubované v kondicionovaných médiách. BGC-SP supernatant indukovanej HUVEC diferencovať do kapilárnych štruktúr podobných do 36 hodín (2564,5 ± 553,1 um, P menšie ako 0,05), v menšej miere, než supernatantu z BGC-EV buniek (5002,4 ± 665,7 um) a bunky BGC-P (5417,3 ± 784,25 um, obrázok 2A). HGC-sh supernatant indukovanej HUVEC diferencovať do kapilárnych štruktúr podobných do 36 hodín (7024,9 ± 923,1 um, P menšie ako 0,05), aby silnejšie miere ako supernatantu z HGC-EV buniek (4456,2 ± 554,2 um) a bunky HGC-P (4023,4 ± 665,2 um, obrázok 2A). Kvantifikácia priemernej dĺžky trubice je uvedené, že dĺžka rúrky z HUVEC v upravenom médiu z BGC-SP bola znížená približne o 52,7% v porovnaní s kontrolnými bunkami; Dĺžka trubice HUVEC v upravenom médiu z HGC-SH klonov bola zvýšená 74,6% v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 2A). Model chrbtovej okno ukazuje, že BGC-SP bunky došlo k zníženiu 40,4% v tumour- vyvolané mikrocievkach v porovnaní s kontrolnými bunkami (P menšia ako 0,05). HGC-SH bunky v chrbtovej kožnej riasy komory malo za následok zvýšenie 73,2% v mikrocievkach vyvolanej nádorovým ochorením, s väčším počtom drobných krvácavých škvŕn v porovnaní s kontrolnými bunkami (P menšia ako 0,05 Obrázok 2B). Tieto výsledky jasne ukazujú, že SPARC nadmerná expresia pri rakovine žalúdka inhibuje angiogenézu in vitro stroje a in vivo Pre stanovenie účinku zvýšenej expresie SPARC na MMP-7 a VEGF, kvantitatívne real-time PCR a westernovým prenosom testy boli vykonané. Výsledky ukázali, že MMP-7 a expresie VEGF bola negatívne regulovaná SPARC výrazom. V BGC-SP buniek, hladiny MMP-7 mRNA, MMP-7 proteínu VEGF mRNA, a VEGF proteínu, boli inhibované o 87,2%, 68,9%, 48,4% a 58,6% v uvedenom poradí, v porovnaní s prázdnych vektorové transfekciou buniek. V HGC-sh bunky, hladina mRNA MMP-7 zvýšila 11,6-krát, hladina proteínu MMP-7 zvýšil 8,1 krát, hladina VEGF mRNA zvýšená 8,8-krát, a hladina VEGF proteín zvýšila 3,2 krát v porovnaní s prázdnou vektor bunky (obrázok 3A, B). Na určenie, či je MAPK signálnej dráhy bolo upravené SPARC, Šapka /JNK, ERK1 /2 a P-38 hladiny boli stanovené westernovým prenosom. Výsledky ukázali, že hladiny p-ERK1 /2 sa významne znížili v BGC-SP buniek a vyššia v HGC-SH buniek v porovnaní s ich kontrolnými bunkami (obrázok 3C). Ak chcete potvrdiť, že pre-angiogénny účinky pozorované u znížila SPARC vyjadrenia sú v dôsledku zvýšenej MMP-7 a expresiu VEGF a nie k úrovniam SPARC sám, HUVEC boli inkubované v kondicionovaných médiách získaných z HGC-SH buniek exogénne pridaný rekombinantný ľudský SPARC (rhSPARC, 0,3 ug /ml). Naše dáta ukázali, že pridanie exogénne SPARC neinhiboval kapilárnej štruktúry podobné k HUVEC v porovnaní s HGC-sh (obrázok 4), na rozdiel od anti-angiogénny odpovede pozorované s endogénne expresie SPARC v BGC823 bunkách (obrázok 2). pre ďalšiu charakterizáciu role VEGF a MMP-7 v SPARC-sprostredkované angiogenézy modulácie, MMP-7-zhrnie a 1 ug /ml neutralizačných VEGF protilátky (Chemicon, Temacula, CA, USA) boli použité pre HGC-SH klony znepriateliť funkcie MMP-7 a VEGF. skúmali sme schopnosť MMP-7 expresie v HGC-SH buniek modulovať angiogenézu in vitro Ak chcete zistiť funkciu zvýšenej expresii VEGF indukovanej SPARC umlčanie, VEGF v podmienenom médiách HGC-sh a HGC-SH + MMP7-sh bunky sa neutralizuje VEGF protilátky (1 ug /ml). Výsledky ukázali, že tvorba kapilárnej z HUVEC bol do HGC-sh supernatantu obsahujúceho VEGF neutralizujúcich protilátok významne znížil v porovnaní so supernatantom z HGC-SH bunkách samotných (HGC-sh + anti-VEGF vs bezsérovém kondiciovaného média zozbierané z HGC-P, HGC-EV, HGC-SH s alebo bez rhSPARC (0,3 ug /ml) a HGC-sh + MMP7-SH bunky boli koncentrované ultrafiltráciou rúrky (Millipore, Bedford, MA , USA) za rovnakých podmienok. Western blot ukazuje, že koncentrácia SPARC do HGC-SH buniek s 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium bola rovnaká ako u HGC-P supernatantu (obrázok 4A). Pre stanovenie terapeutickej účinnosti SPARC prejavu, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP buniek alebo HGC-P, HGC-EV, HGC-SH bunky boli injikované subkutánne do holých myší. Nebol zistený žiadny významný rozdiel vo veľkosti medzi BGC-P (n = 6; znamená objem nádoru = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6; znamená objem nádoru = 1856 ± 69 mm 3 ) xenoimplantáty. Významné zníženie (39,1%), v strednej objem nádoru bol nájdený u zvierat s implantovanými BGC-SP xenoimplantátů (n = 6; priemerný objem nádoru = 1130 ± 55 mm 3) v porovnaní so zvieratami s implantovanými BGC-EV xenoimplantátů ( P menšie ako 0,05, obrázok 5). Nebol zistený žiadny významný rozdiel vo veľkosti medzi HGC-P (n = 6; znamená objem nádoru = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; znamená objem nádoru = 1708 ± 82 mm 3 ) xenoimplantáty. Významné zvýšenie (50,3%), v strednej objem nádoru bol nájdený u zvierat s implantovanými HGC-SH xenoimplantátů (n = 6; priemerný objem nádoru = 2412 ± 75 mm 3) v porovnaní so zvieratami s implantovanými HGC-EV xenoimplantátů ( P <. 0,05, obrázok 5) Pre posúdenie SPARC, VEGF, MMP-7 výrazy in vivo Diskusia Za účelom skúmania role SPARC v rakoviny žalúdka, sme prvýkrát testovali expresiu SPARC v siedmich bunkových línií rakoviny žalúdka. Väčšina bunkové línie nevyjadril, alebo len vyjadril nízku hladinu SPARC. Pre určenie role SPARC v raste a angiogenézy rakoviny žalúdka, sme založili BGC-SP klon, ktorý sa stabilne transfekovaná SPARC cDNA vektora, a HGC-sh klon, ktorý sa stabilne transfekovaná zhrnie vektorom cielenie SPARC mRNA. SPARC expresie významne zvýšil v BGC-SP klonu a znížil HGC-sh klonu v porovnaní s ich príslušnými kontrolnými klonov, ako bolo stanovené Western blot a RT-PCR analýzy. Rýchlosť proliferácie buniek bola nižšia v BGC-SP klonu, a bola vyššia v HGC-sh klonu, než v ich príslušných kontrolných klonov metódou MTT. Tiež sme zistili, že nadmerná expresia SPARC inhibuje nádorových buniek indukovanú tvorbu kapilár v HUVEC in vitro stroje a angiogenézy v teste okna chrbtovej in vivo Cievy sú nevyhnutné dodať živiny do tkanív , Z tohto dôvodu, neovaskularizácie je nevyhnutný k rozvoju solídneho nádoru. Predchádzajúce štúdie preukázali, že SPARC hrá úlohu v angiogenéze [7]. Naše výsledky ukazujú, že nadmerná expresia SPARC inhibuje angiogenézu in vitro stroje a in vivo ďalej vykonávať štúdie s cieľom skúmať úlohu VEGF a MMP-7 v SPARC sprostredkovanej angiogenézy modulácie. Keď bol pridaný rekombinantný ľudský proteín SPARC do kondicionovaného média z HGC-sh klon obnoviť spojenie SPARC, toto upravené médium nezmenila tvorbu kapilár v HUVEC o in vitro VEGF hrá kľúčovú úlohu v angiogenézu, a je nevyhnutná pre prežitie endoteliálnych buniek [8]. V gliómu, SPARC inhibuje rast nádoru tým, že zmení svoje mikro-prostredia a potlačenie jeho angiogenézu prostredníctvom inhibície VEGF expresiu a sekréciu [5]. Môže existovať negatívny vzťah medzi SPARC a VEGF výrazov, tj, tým viac SPARC, tým menej VEGF alebo naopak MMP-7 je schopný degradujúce bazálnej membrány alebo spojivového tkaniva okolo nádoby. To tiež stimuluje DNA syntézu v kultivovaných bunkách cievneho endotelu, a indukuje angiogenézu v mieste, kde sa rakovinové bunky hrubého čreva implantovaných myšiam modelu [15]. VEGF a ďalších angiogénnych faktorov fungujú hlavne prostredníctvom MAPK signalizačnej dráhy, ktoré sú považované za dôležité transdukčných dráhy zapojené do procesu neovaskularizácie v nádore [8]. Naša nedávna štúdia ukázala, že MMP-7 expresie bola modulovaná prostredníctvom aktivácie MAPK signalizačnej dráhy [16]. Niekoľko štúdií tiež preukázali, že SPARC negatívne modulované aktiváciu MAPK [17]. V dôsledku toho, SPARC expresia môže zmeniť angiogénny rovnováhu v nádoroch down-reguláciu sériu neovaskularizácii podporujúce faktory. Pre zistenie funkcie SPARC v regulácii rastu rakoviny žalúdka in vivo SPARC vyjadruje v normálnej žalúdočnej epiteliálnych buniek, buniek karcinómu žalúdka, a bunky strómy okolitých karcinómu žalúdka na nižšej úrovni [21 ]. Štúdia ukázala, že imunohistochemické SPARC vyjadruje sa hlavne v stromálne bunky obklopujúce nádor [22]. Tieto nezrovnalosti nemôžu byť plne vysvetlené. SPARC expresie môže závisieť na histologickom type nádoru, alebo naopak V súhrne, inhibícia rastu žalúdočné rakoviny u SPARC sa zdá byť sprostredkovaný jeho potlačenie účinkov na MMP-7 a VEGF výrazy, ktoré môžu ďalej inhibovať mikrociev infiltráciu do nádorov. Došli sme k záveru, že down-regulácia SPARC môže asociovať s vývojom rakoviny žalúdka a prieskumná činnosť s cieľom regulovať SPARC výraz sa môže stať zmysluplným prístupom k zlepšeniu liečby rakoviny žalúdka. Protilátky a činidlá Protilátky proti SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) (p) Šapka /JNK, (p) ERK1 /2 (p) p-38, MMP-7 (Bunková signalizácia technológie, Danvers, MA, USA), VEGF, a CD31 (abca, Cambridge, MA, USA) boli použité pre western blot a imunohistochemicky. RhSPARC bol dodávaný R &D (Minneapolis, MN, USA). Reverzný transkripcie-PCR kit bol dodaný firmou Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-zhrnie (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp Frederick, MD, USA) bola použitá pre down-reguláciu MMP-7 v bunkových klonov. β-kazeín (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) bol použitý v beta-kazeín zymografie. Ostatné činidlá boli analytickej čistoty, alebo lepšie. rakovina žalúdka u ľudí bunkových línií AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 boli získané z Cancer Institute of čínskej akadémie lekárskych vied. Všetky bunky boli pestované v RPMI 1640 médiu doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (FBS). BGC-EV (transfekované prázdnym vektorom), BGC-SP (expresiou SPARC cDNA), HGC-EV (exprimujúce prázdny vektor) a HGC-sh (exprimujúce SPARC zhrnieme) boli pestované v kompletnom RPMI 1640 G418 (50 ug /ml) , Všetky bunky boli udržiavané v jednovrstvové kultúry pri 37 ° C vo zvlhčenom vzduchu s 5% CO 2. Približne 150000 BGC-823 bunky boli umiestnené do každej jamky v šiestich jamkami v RPMI 1640 s 10% FBS a ponechané prichytiť sa cez noc. Ekvimolárne množstvo pcDNA3.1 s plnou dĺžkou SPARC cDNA vektor alebo prázdnym vektorom (Invitrogen, San Diego, CA, USA) boli inkubované s Lipofectamine-2000 transfekčního činidla (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Overené SureSilencing ľudskej SPARC zhrnie a prázdnu kontrolný vektor boli získané z SuperArray Bioscience Corp (Frederick, MD, USA). Bunky HGC-27 sa transfekovaly, ako bolo opísané skôr [24]. V stručnosti, bunky boli transfekovány stabilným spôsobom pomocou lipofektaminu. Transfekované bunky boli vybrané s G418 (100 ug /ml pre BGC-SP a HGC-SH klonov) počas 14 dní pred izoláciou jednotlivých klonov. HGC-sh-MMP7-SH varianty boli stanovené, ako je opísané vyššie, HGC-SH klon bunky boli transfekovány MMP-7-zhrnie (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp Frederick, MD, USA) za použitia lipofektaminu. Potom sa transfekované bunky sa selektovali puromycin (1 ug /ml) po dobu 10 dní. Bunková proliferácia bola stanovená 3- (4,5-dimetyl-thiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT), ako bolo opísané skôr [24]. V stručnosti, 500 buniek boli kultivované na jamku v 96-jamkových doštičkách a inkubované po dobu 8 dní, a potom, MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA) sa pridá k bunkám. Hodnoty absorbancie pri 550 nm bola meraná pomocou ELISA readeru. Výsledky boli uvedené ako priemerné absorbancie pri 550 nm, a prostriedky (± SD) v štyroch stanovení zo šiestich samostatných experimentov. Celkové fragmenty buniek boli pripravené a analyzované westernovým prenosom ako bolo opísané skôr [24]. Stručne povedané, protilátky proti SPARC, MMP-7, a VEGF (1: 1000 riedenie) boli použité na detekciu SPARC, MMP-7, a VEGF, v danom poradí, zatiaľ čo protilátky proti (p-) Šapka /JNK, (p) ERK1 /2 a (p) p-38 (1: 800 riedenie) boli použité na detekciu aktivácie MAPK signálnej dráhy. Naviazané protilátky boli vizualizované pomocou ECL (Promega, Madison, WI, USA) na Kodak Image Station 4000 mm Pre systému (Kodak, Rochester, NY, USA). Hustota pásom bola kvantifikovaná denzitometrické analýzou pomocou Image Tool (verzia 3.0) systému. Celková RNA bola izolovaná z stabilne transfekciou nádorových buniek za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, San Diego, CA, USA) a spracuje sa po dobu 45 minút pri teplote 37 ° C s RQ1 DNázy (Promega, Madison, WI, USA). RNA bola reverzne transkribovaných za použitia AMV reverznej transkriptázy (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitatívny real-time PCR bola vykonaná v Prism7300 systéme ABI Sequence Detection (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) s použitím súpravy A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA). Primery použité pre kvantitatívne real-time PCR boli nasledovné: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sense) a 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisencie); a VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sense) a 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisencie). Primery použité pre PCR boli nasledujúce: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sense) a 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisencie); a glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sense) a 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisencie). β-kazeín zymografií funkčná aktivita MMP-7 bola hodnotená pomocou β-kazeín zymografií na 10% polyakrylamidovom gélu s vloženými 1 mg /ml p-kazeínu. boli podrobené elektroforéze rovnaké množstvá v bezsérovém kondicionovaného prostredia z buniek pestovaných po dobu 24 hodín. Po elektroforéze boli gély premyjú v 2,5% Triton X-100 po dobu jednej hodiny za účelom odstránenia SDS. Gély potom boli inkubované po dobu 18 hodín pri teplote 37 ° C v 50 mM Tris /HCl s obsahom 10 mM chloridu vápenatého 2 a 0,02% NaN 3, zafarbený Coomassie brilantná modrá a potom sa odfarbuje. Proteolytické aktivity latentné MMP-7 a aktivovanej MMP-7 bola doložená ako pásy s molekulovou hmotnosťou 28 až 19 kDa. V celkom, 2 × 10 5 bunky HGC-P, BGC-P alebo ich zodpovedajúce stabilne transfekciou klonov boli schovať a inkubované v kompletnom RPMI 1640 v 6-jamkových komôr sklíčka a ponechané rásť po dobu 24 hodín. Následne sa stabilizuje média boli odobraté, označené a skladované pri -80 ° C pre neskoršie použitie. Ak chcete skúmať účinok SPARC na v vitro chrbtovej kožnej riasy komora Model Tieto štúdie boli vykonané v súlade s protokolom, ktoré je schválené starostlivosť o zvieratá a použitie výbor Peking University (etické schválenie prihláška číslo č J201155). in vivo xenoštěpu modely a Imunohistochémia athymických nahých myší bolo náhodne do rôznych skupín (n = 6 v každej skupine). Myši boli Inokulované subkutánne do spodnej zadnej krídla s ľudskou BGC-P, BGC-EV, BGC-SP alebo HGC-EP, HGC-EV, HGC-SH bunky (2 x 10 6 buniek na myš). Rast nádoru bol monitorovaný palpáciou v mieste očkovania.
.
Metóda
. Kvantitatívny real-time PCR a western blot boli vykonávané na zistenie, či výrazy VEGF a MMP-7 bola upravovaná podľa SPARC výrazom. Pre ďalšie stanovenie účinku SPARC prejave na angiogenézu in vivo
, xenografe modely boli stanovené a hustotou mikrociev (MVD) rôznych klonov boli detekované pomocou imunohistochémia.
Výsledky
.
Záver
[9].
Výsledky
a in vivo
.
The MAPK signalizačnej Pathway a expresie VEGF a MMP-7 sú tlmená SPARC tým, že nadmerná expresia
knock-down SPARC expresie v HGC-27 Cells podporuje angiogenézy cez up-regulovaná VEGF a MMP-7 expresie
podľa stabilne transfekcia MMP-7-zhrnie do HGC-sh buniek. Obrázok 4A ukazuje, že expresia MMP-7 v HGC-SH + MMP7-sh buniek down-regulované stabilne exprimujúce MMP-7-SH-RNA na úroveň porovnateľnú s HGC-P a HGC-EV buniek. Na objasnenie role MMP-7 v knock-down SPARC sprostredkované propagácie nádorové angiogenézy buniek indukovanú sme vykonali analýzu tvorby kapilár s podmienečným médiách HGC-SH buniek a HGC-SH + MMP7-sh buniek. Ako je znázornené na obrázku 4B, výsledky ukazujú, že sa znížil MMP-7 expresie v HGC-SH + MMP7-sh buniek viedla k významné zníženie tvorby kapilár o HUVEC in vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P. < 0,05)
HGC-SH, P menšie ako 0,05 Obrázok 4B). Tvorba kapilárnej z HUVEC bola takmer úplne inhibovaná, keď sú kultivované v upravenom médiu HGC-SH + MMP7-sh buniek a pridá VEGF neutralizujúce protilátky ( vs
HGC-sh, P menší ako 0,05 Obrázok 4B).
Nadmerná expresia SPARC v žalúdočnej nádorových buniek inhibuje Tumourigenicity u nahých myší
, xenografe rezy boli zafarbené monoklonálnou protilátkou proti ľudskému SPARC, VEGF alebo MMP-7, , Obrázok 5A ukazuje, že BGC-SP nádory exprimujú viac ako SPARC BGC-P, BGC-EV nádory, zatiaľ čo súčasne VEGF, MMP-7 výrazy sa znížila (P menšia ako 0,05, obr 5A). Rezy z HGC-sh nádory exprimujú menej ako SPARC HGC-P, nádory HGC-EV, zatiaľ čo súčasne VEGF, MMP-7 výrazy sa zvýši (P menšia ako 0,05, obrázok 5A). CD31 sa používa predovšetkým na preukázanie prítomnosti vaskulárnych endoteliálnych buniek v histologických rezoch tkanív, ktoré môžu prispieť k hodnoteniu stupňa nádorovej angiogenézy. Aby bolo možné posúdiť, či zmenil SPARC expresie sprostredkovanej hustotu mikrociev (MVD) sme analyzovali angiogenézy v xenoimplantátům podľa histologickej analýzou CD-31. Nebol žiadny významný rozdiel v MVD medzi BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrocievkach /0,145 mm 2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 mikrocievkach /0,145 mm 2) xenoimplantátů. MVD bol znížený 54,8% v BGC-SP (5,2 ± 2,1 vlásočníc per /mm 2) nádory v porovnaní s BGC-EV nádorov (P menšia ako 0,05, Obrázok 5). Nebol žiadny významný rozdiel v MVD medzi HGC-P (6,4 ± 2,1 mikrocievkach /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 mikrocievkach /0,145 mm 2) xenoimplantáty. MVD bola zvýšená 51,7% v HGC-SH (10,5 ± 1,5 vlásočníc /0,145 mm 2) nádory v porovnaní s HGC-EV nádorov (P menšia ako 0,05, obrázok 5)
. Na druhej strane, down-regulácia SPARC interferencií mRNA podporoval tvorbu kapilár in vitro stroje a angiogenézy in vivo
.
v súvislosti s poklesom MMP-7, VEGF a fosforylovaného ERK1 /2, zatiaľ čo down-regulácia SPARC podporoval angiogenézy in vitro stroje a in vivo
v súvislosti so zvýšením MMP-7, VEGF a fosforylovaného ERK1 /2.
teste v porovnaní s tvorbou kapiláry HUVEC inkubovaná v podmienka médium bez exogénny rhSPARC. Potom sme použili MMP-7-zhrnieme k down-regulácii MMP-7 expresie v HGC-sh klonu, a /alebo anti-VEGF protilátky na neutralizáciu VEGF v upravenom médiu z HGC-sh klonu. Tvorba kapilárnej z HUVEC bola významne inhibovaná, keď sa inkubujú v podmienečnom médiá s nižším MMP-7 a /alebo nepovolená VEGF. Tieto experimenty naznačujú, že SPARC down-regulácia sama o sebe dostatočná pre indukciu neovaskularizácie, a musia byť zapojené ďalšie faktory v tomto procese.
[13], [14].
BGC-SP a bunkové klony HGC-SH bol v porovnaní s ich kontrolných klonov pre ich schopnosti tvoriť nádory v podkožnom modelu. SPARC nadmerná expresia významne znížila veľkosť nádoru xenografted so zníženou MVD, down-regulácia SPARC od RNA interferencie podporoval rast nádoru xenografted so zvýšeným MVD. Z tohto dôvodu, v karcinómu žalúdka xenoimplantátov, SPARC expresie je v negatívnej korelácii s angiogenézou. Predchádzajúce štúdie ukázali, že SPARC prispel k regulácii tvorby nádorov, hoci jeho úloha Zdalo sa, že bunky špecifické pre typ. V karcinómom pečene xenoimplantátů bunkové línie, SPARC nadmerná expresia významne predĺžená tvorbu nádorov, znižuje veľkosť nádoru, a znížil MVD v porovnaní s kontrolnými xenoimplantátů [18]. V rakovinových tkanív hrubého čreva, SPARC expresie bola v negatívnej korelácii s expresiu VEGF a MVD [19]. V meduloblastóm bunkách, SPARC nadmerná expresia inhibuje angiogenézu vedúce k zníženiu rastu nádoru [11]. V ľudských mikrovaskulárnych endoteliálnych buniek, SPARC inhibuje syntézu DNA in vitro
[6]. V neuroblastómu xenoimplantátov, SPARC peptidy inhibujú angiogenézu a nádorový rast in vivo
[20]. Tieto výsledky potvrdili SPARC ako inhibítor angiogenézia nádoru in vivo
.
. Nedávna štúdia zistila, že imunohistochemické SPARC expresie bola v negatívnej korelácii s expresiou VEGF a MVD v žalúdočnej rakovinové tkanive, a SPARC expresie v karcinómu žalúdka sa znižuje s vyšším stupňom malignity [23].
Materiály a metódy
bunkovej kultúre
Založenie BGC-SP, HGC-SH klonov a HGC-sh-MMP7-sh Klony
Cell Test proliferácie
Western Blotting Analýza
RT-PCR a kvantitatívnej PCR v reálnom čase
Podmienený Media Collection pre experimentovanie
endoteliálnych buniek kapilár-like Tube Formation Test
angiogenézy, bola vykonaná skúška kapilárnej formácie. V tomto teste, Matrigel bolo pipetovanie do vopred vychladených 96-jamkových doštičiek (Matrigel 75 ul na jamku) a polymerizovaný po dobu 30 minút pri teplote 37 ° C. Na určenie, či zmeniť SPARC výraz by regulovať angiogenézu, HUVEC (5000 buniek na jamku) boli inkubované v 100 ul kondicionovaných médií získaných z rôznych druhov buniek. Po 36 hodinách inkubácie, rúrkové konštrukcie boli fotografované. Každá podmienka testu bola hodnotená v štyroch stanovení z troch oddelených pokusov. Snímky boli nadobudnuté Cannon Power Shot A640 fotoaparát Olympus inverzného mikroskopu s 100 × zväčšenia; dĺžka trubice bola kvantifikovaná za použitia IPP (verzia 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
postupy boli v súlade s odporúčaniami uvedenými v Príručke pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat z National Institutes of Health. Athymických nahých myší (vek 6 týždňov, žena, 26-28 g, n = 3 na skupinu) boli chované a udržiavané v rámci zárodočnej bez prostredia. Implantácia technika bola popísaná skôr [11]. Letecký vak chrbtovej bol vykonaný na myšiach injektovaním 10 ml vzduchu subkutánne po tom, čo zviera sa anestetizují úplne. Difúzna komory (Millipore, Bedford, MA, USA) boli pripravené tak, že vyrovnáte 0,45 mm, Millipore membrány na oboch stranách okraja "O" prsteň s cementom. BGC-P, BGC-EV a BGC-SP; HGC-P, HGC-EV alebo HGC-SH bunky (1 x 10 6) suspenduje v PBS bolo do komory. ± 2 cm dlhý rez bol vykonaný horizontálne pozdĺž okraja vzduchového vaku chrbtovej a komory boli umiestnené pod kožu. Myši boli usmrtené po 10 dňoch. Zvieratá boli opatrne kože okolo implantovaných komôr. Záhyboch kože pokrývajúce komory boli vyfotografované pod viditeľným svetlom. bol počítaný počet krvných ciev.
Dobrá správa pre pacientov s IBS, pretože vedci zistili „črevné svrbenie“
Vedci našli v modeli MS nový spôsob ochrany pred chorobami
Molekuly mikróbov proti koronavírusu by mohli byť kľúčom k novej liečbe
Kvalita spánku by mohla byť indikátorom neskoršej štúdie o Alzheimerovej chorobe
Pľúcny mikrobióm predpovedá závažnosť ochorenia COVID-19
Krajiny so staršou populáciou majú vyššie infekcie a úmrtia na SARS-CoV-2,
Nový superaktivujúci makrofágový receptor by mohol vysvetliť hyperzápal pri závažnom ochorení COVID-19
Imunita je zaujímavá vec. Aj keď sú nevyhnutné pri ochrane tela pred napadnutím patogénmi a cudzími antigénmi, môže sa tiež obrátiť proti telu a spustiť deštruktívne imunologické procesy. Nová štúdia
Črevný mikrobióm spojený s problémami správania u detí
Deti s problémami so správaním môžu mať v črevnom mikrobióme rôzne zloženie, pričom rodičia hrajú hlavnú úlohu v tom, aké výrazné boli rozdiely, okrem jedla, ktoré poskytujú, naznačuje nová štúdia.
Jedlo selektívne ovplyvňuje črevné mikróby, tvrdí štúdia
Jedlo by mohlo hrať úlohu pri tvorbe mikrobiálnej flóry v ľudskom čreve. Toto sa opakovane ukázalo vo viacerých štúdiách a výskumoch. Vedci zo Štátnej univerzity v San Diegu teraz ukázali, že potravin