PLOS ONE: proteína secretada ácido e rico em cisteína (SPARC) Suprime Angiogenesis por Down-regulação da expressão de VEGF e MMP-7 em Câncer Gástrico

Abstract

Fundo

proteína secretada ácido e rico em cisteína (SPARC) é uma glicoproteína que funciona para inibir a angiogênese, proliferação e invasão em diferentes tipos de câncer. Acredita-se que a capacidade da SPARC para modular a neovascularização para ser mediada, em parte, pela sua capacidade para modular a expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metaloproteinases da matriz (MMPs). Neste estudo, teve como objetivo determinar o efeito da expressão SPARC em células cancerosas gástricas na proliferação e angiogênese in vitro
e in vivo
.

Método

Nós avaliamos a expressão de SPARC em sete linhas celulares de cancro gástrico humano. Em seguida, foi estabelecido um SPARC estavelmente transfectadas overexpressed linha de células (BGC-SP) e uma linha estavelmente transfectadas SPARC knock-down celular (HGC-sh). O efeito da SPARC superexpressão e SPARC silenciamento foi estudada examinando formação capilar de HUVECs in vitro
e um modelo de câmara da prega da pele dorsal in vivo
. Quantitative PCR em tempo real e transferência de Western foram realizadas para detectar se as expressões de VEGF e MMP-7 foram modulados pela expressão SPARC. Para determinar ainda mais o efeito de expressão SPARC sobre a angiogênese in vivo
, modelos de xenotransplante foram estabelecidos e densidade microvascular (MVD) de diferentes clones foram detectados por imuno-histoquímica.

Resultados

endógena superexpressão SPARC inibiu a expressão de VEGF e MMP-7, bem como a angiogénese induzida por células BGC-SP. Correspondentemente, SPARC silenciamento aumentou a expressão de VEGF e MMP-7, bem como a angiogénese induzida por células HGC-SH. angiogênese elevada induzida por SPARC silenciamento em células HGC-sh foi diminuída quando VEGF foi neutralizada por anticorpos, e MMP-7 foi derrubado in vitro
.

Conclusão

SPARC suprime a angiogénese do cancro gástrico por regulação negativa da expressão de VEGF e MMP-7

citação:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et ai. (2012) proteína secretada ácido e rico em cisteína (SPARC) Suprime Angiogenesis por Down-regulação da expressão de VEGF e MMP-7 em câncer gástrico. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10.1371 /journal.pone.0044618

editor: Rajesh Mohanraj, Universidade dos Emirados Árabes Unidos, Emirados Árabes Unidos

Recebido: 09 de junho de 2012; Aceito: 06 de agosto de 2012; Publicação: 05 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.901.417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Entre as mortes relacionadas ao câncer, câncer gástrico ocupa o segundo lugar em todo o mundo depois do câncer de pulmão; quase dois terços dos casos ocorrem em países em desenvolvimento, incluindo 42% da China [1]. A angiogênese é um processo crítico no câncer gástrico; portanto, moléculas regulatórias e de sinalização que modulam a angiogênese estão se tornando o foco da presente pesquisa. Angiogênese não é um processo ativo por si só; é controlado por alguns factores angiogénicos e alguns inibidores de angiogénese.

proteína secretada ácida e rica em cisteína (SPARC), também conhecido como osteonectina ou BM-40, é uma glicoproteína segregada multi-facetado que é expresso pela muitos tipos diferentes de células e está associada com a formação óssea, fibrose e tecido de reparação.

estudos recentes mostram que modula a proliferação SPARC, apoptose, angiogénese e invasão em diferentes tipos de células cancerosas, no entanto, o papel da SPARC em tumorigénese é complicada e parece ser a célula-tipo específico, devido às suas diversas funções numa determinada micro-ambiente [2]. SPARC funciona como um supressor tumoral em cancros da mama, neuroblastoma, do pâncreas, do ovário e do pulmão [3]. cancro do ovário em ratinhos SPARC-nulo cresceu significativamente maior do que nos animais de tipo selvagem com níveis aumentados de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metaloproteinases da matriz (MMPs) [4]. Ao suprimir a vascularização do tumor através da supressão da expressão de VEGF e secreção, SPARC inibida glioma crescimento [5]. SPARC se liga ao VEGF, inibindo, assim, a fosforilação de VEGFR, proteínas quinases activadas por mitogénio de activação (MAPK) e a síntese de ADN induzida por VEGF [6]. No entanto, o papel da SPARC em angiogénese é também célula-tipo específico, o que altera os eventos de transdução de sinal em resposta a meios celulares originais [7].

O VEGF estimula a angiogénese, e é o mais importante sinal proteína produzida por células [8]. As MMPs têm um papel importante no desenvolvimento do tumor, não só na degradação da matriz extracelular, mas também na regulação da angiogénese. MMP-7, que é o peso molecular menor de todos os membros da família MMP, demonstrou acelerar a proliferação de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em uma maneira dependente da dose, In vitro
[9].

A função primária da SPARC em angiogénese de linhas celulares de cancro gástrico permanece obscura. Portanto, neste estudo, a hipótese de que SPARC pode modular a proliferação e angiogênese pela regulação VEGF e MMP-7 expressões em células cancerosas gástricas. Para testar essas hipóteses, testamos expressão de SPARC em sete linhas celulares de cancro gástrico. Então, para avaliar o efeito da SPARC alterada em células de câncer gástrico, foi estabelecido um clone BGC-SP que overexpressed SPARC e um clone HGC-sh em que o SPARC endógena foi derrubado.

Resultados

a expressão de SPARC em cultura de células de câncer gástrico

Nós avaliamos a expressão de SPARC em várias linhas celulares de cancro gástrico humano. Western blot mostraram que o SPARC foi undectable em linhas de células AGS, MKN45, NCI-N87 e BGC-823, linha celular no entanto SGC-7901 expressas baixo nível de SPARC e HGC-27, MGC-803 linhas de células expressa elevado nível de SPARC ( Figura 1A).

a superexpressão e inibição de endógeno SPARC no câncer gástrico celular Lines

Western blotting mostrou que a kDa banda 43 correspondente à proteína SPARC foi aumentado significativamente em BGC-SP (células BGC células que expressam ADNc SPARC) em comparação com as células parentais (BGC-P) e de controlo transfectadas com o vector vazio (BGC-EV) (P < 0,05); o SPARC foi inibida por quase dois terços nas células HGC-sh (células que expressam HGC SPARC-shRNA) em comparação com células HGC-P e HGC-EV (P < 0,05, Figura 1B). RT-PCR indicaram que a expressão de ARNm em células SPARC BGC-SP foi aumentada em comparação com células BGC-EV BGC-P e (P < 0,05); a expressão de mRNA SPARC no HGC-sh diminuiu quase 80% em comparação com células HGC-EV HGC-P e (P < 0,05, Figura 1B).

SPARC superexpressão diminui a proliferação de linhas celulares de cancro gástrico

Para determinar se a expressão alterada SPARC afectou a proliferação de linhas celulares de cancro gástrico, o crescimento de células transfectadas foram comparados com os de controlos parentais e vector vazio. Os dados mostraram que o crescimento das células BGC-SP foi inibido em comparação com as células BGC-P e BGC-EV após 8 dias de cultura (p < 0,05); o crescimento de células HGC-sh foi aumentado ligeiramente em comparação com células HGC-EV HGC-P e (P < 0,05, Figura 1C).

SPARC superexpressão em gástrica linhas celulares de cancro Diminui Angiogenesis in vitro
e in vivo

Para entender o efeito da expressão SPARC alterada na angiogênese em linhas celulares de cancro gástrico, HUVECs foram incubadas em meios condicionados. O sobrenadante BGC-SP induzida HUVECs de se diferenciar em estruturas do tipo capilar dentro de 36 h (2564,5 ± 553,1 uM, P < 0,05) em menor grau do que o sobrenadante a partir de células BGC-VE (5002,4 ± 665,7

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