Extracto
Antecedentes
proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) es una glicoproteína que funciona para inhibir la angiogénesis, la proliferación y la invasión en diferentes tipos de cáncer. Se cree que la capacidad de SPARC para modular la neovascularización estar mediado en parte por su capacidad para modular la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y metaloproteinasas de la matriz (MMPs). En este estudio, que tuvo como objetivo determinar el efecto de la expresión de SPARC en células de cáncer gástrico sobre la proliferación y la angiogénesis in vitro Se evaluó la expresión de SPARC en siete líneas celulares de cáncer gástrico humano. A continuación, se estableció un SPARC transfectadas establemente sobreexpresa línea celular (BGC-SP) y una línea transfectadas establemente SPARC knock-down celular (HGC-sh). El efecto de la sobreexpresión de SPARC y SPARC silenciamiento se estudió mediante el examen de la formación de capilares de HUVECs in vitro Opiniones y un pliegue de piel modelo de cámara dorsal in vivo endógeno sobreexpresión SPARC inhibió la expresión de VEGF y MMP-7, así como de la angiogénesis inducida por las células BGC-SP. Correspondientemente, SPARC silenciamiento aumentó la expresión de VEGF y MMP-7, así como de la angiogénesis inducida por las células HGC-SH. angiogénesis inducida por el elevado SPARC silenciamiento en células SH-HGC se redujo cuando el VEGF fue neutralizado por anticuerpos, y MMP-7 fue derribado in vitro Conclusión SPARC suprime la angiogénesis del cáncer gástrico por abajo de la regulación de la expresión de VEGF y MMP-7 Visto:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) suprime la angiogénesis por abajo de la regulación de la expresión de VEGF y MMP-7 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10.1371 /journal.pone.0044618 Editor: Rajesh Mohanraj, Universidad UAE, Emiratos Árabes Unidos Recibido: June 9, 2012; Aceptado: 6 Agosto de 2012; Publicado: 5 Septiembre 2012 Copyright: © Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia Introducción Entre las muertes relacionadas con el cáncer, el cáncer gástrico ocupa el segundo lugar en todo el mundo después del cáncer de pulmón; casi dos tercios de los casos se producen en los países en vías de desarrollo, incluyendo el 42% de China [1]. La angiogénesis es un proceso crítico en el cáncer gástrico; Por lo tanto, las moléculas de regulación y de señalización que modulan la angiogénesis se están convirtiendo en el foco de la presente investigación. La angiogénesis no es un proceso activo por sí mismo; que es controlada por algunos de los factores angiogénicos y algunos inhibidores de la angiogénesis. proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC), también conocido como osteonectina o BM-40, es una glicoproteína secretada de múltiples facetas que se expresa por muchos tipos diferentes de células y se asocia con la formación de hueso, la fibrosis y la reparación de tejidos. estudios recientes muestran que SPARC modula la proliferación, la apoptosis, la invasión y la angiogénesis en diferentes tipos de células cancerosas, sin embargo, el papel de SPARC en tumourigenesis es complicado y parece ser células de tipo específico debido a sus diversas funciones en un micro-entorno determinado [2]. funciones SPARC como un supresor de tumores en los cánceres de mama, neuroblastoma, pancreático, de ovario y de pulmón [3]. El cáncer de ovario en ratones SPARC nulo creció significativamente mayor que en los animales de tipo salvaje con niveles aumentados del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y metaloproteinasas de matriz (MMP) [4]. Al suprimir la vascularización del tumor a través de la supresión de la expresión de VEGF y la secreción, SPARC inhibió el crecimiento glioma [5]. SPARC se une a VEGF, inhibiendo de este modo la fosforilación de VEGFR, proteínas quinasas activadas por mitógenos de activación (MAPK) y la síntesis de ADN inducida por VEGF [6]. Sin embargo, el papel de SPARC en la angiogénesis es también del tipo de célula específico, lo que altera los eventos de transducción de señales en respuesta a los ambientes celulares únicas [7]. VEGF estimula la angiogénesis, y es la proteína más importante de la señal producida por las células [8]. MMPs juegan un papel importante en el desarrollo de tumores, no sólo en la degradación de la matriz extracelular, sino también en la regulación de la angiogénesis. MMP-7, que es el peso molecular más pequeño de todos los miembros de la familia de MMP, se ha demostrado que acelera la proliferación de las células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) de una manera dependiente de la dosis in vitro La función principal de SPARC en la angiogénesis de líneas celulares de cáncer gástrico sigue siendo poco clara. Por lo tanto, en este estudio, la hipótesis de que SPARC podría modular la proliferación y la angiogénesis mediante la regulación de VEGF y MMP-7 expresiones en células de cáncer gástrico. Para probar esta hipótesis, hemos probado expresión de SPARC en siete líneas celulares de cáncer gástrico. A continuación, para evaluar el efecto de SPARC alterada en células de cáncer gástrico, establecimos un clon BGC-SP, que sobreexpresa SPARC y un clon HGC-SH en la que el SPARC endógena fue derribado. La expresión de SPARC en células cultivadas de cáncer gástrico Se evaluó la expresión de SPARC en varias líneas celulares de cáncer gástrico humano. Western Blot mostró que el SPARC era indetectable en líneas de células AGS, MKN45, NCI-N87 y BGC-823, línea celular sin embargo SGC-7901 expresó bajo nivel de SPARC y HGC-27, MGC-803 líneas celulares expresaron alto nivel de SPARC ( Figura 1A). la sobreexpresión y la inhibición de la endógeno SPARC en el cáncer gástrico Líneas celulares Western Blot mostró que la banda 43 kDa correspondiente a la proteína SPARC se incrementó significativamente en BGC-SP (células BGC las células que expresan SPARC ADNc) en comparación con células parentales (BGC-P) y de control transfectadas con el vector vacío (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC se inhibió en casi dos tercios en las células HGC-SH (células que expresan SPARC HGC-shRNA) en comparación con las células HGC-P y HGC-EV (P < 0,05, Figura 1B). RT-PCR indicaron que la expresión de SPARC mRNA en células BGC-SP se aumentó en comparación con las células BGC-EV BGC-P y (P < 0,05); la expresión de SPARC mRNA en HGC-SH se redujo en casi un 80% en comparación con las células HGC-EV HGC-P y (P < 0,05, Figura 1B). SPARC sobreexpresión reduce la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico Para determinar si la expresión alterada SPARC afectó a la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico, el crecimiento de las células transfectadas se compararon con los de los controles de vectores parentales y vacíos. Los datos mostraron que el crecimiento de células BGC-SP fue inhibido en comparación con las células BGC-P y BGC-EV después de 8 días de cultivo (P < 0,05); el crecimiento de las células HGC-SH se aumentó ligeramente en comparación con las células HGC-EV HGC-P y (P < 0,05, Figura 1C). SPARC sobreexpresión en gástrico líneas celulares de cáncer Disminuye Angiogénesis in vitro Para entender el efecto de la expresión de SPARC sobre la angiogénesis alterada en líneas celulares de cáncer gástrico, HUVECs se incubaron en medio condicionado. El sobrenadante BGC-SP inducida HUVECs para diferenciarse en estructuras similares a capilares dentro de las 36 h (2564,5 ± 553,1 m, P < 0,05) en menor medida que el sobrenadante de las células BGC-EV (5002,4 ± 665,7 m) y células BGC-P (5417,3 ± 784,25 m, Figura 2A). El sobrenadante HGC-sh inducida HUVECs para diferenciarse en estructuras similares a capilares dentro de las 36 h (7024,9 ± 923,1 m, P < 0,05) en un grado más fuerte que el sobrenadante de las células HGC-EV (4456,2 ± 554,2 m) y células HGC-P (4023,4 ± 665,2 m, Figura 2A). La cuantificación de la longitud media del tubo indicó que la longitud del tubo de HUVEC en medio acondicionado de BGC-SP se redujo en aproximadamente un 52,7% en comparación con células de control; la longitud del tubo de HUVEC en un medio condicionado de clones HGC-SH se incrementó un 74,6% en comparación con las células control (Figura 2A) guía. El modelo de ventana dorsal mostró que las células BGC-SP tuvieron una disminución del 40,4% en tumour- inducida microvasos en comparación con células de control (P < 0,05). células HGC-SH en la cámara dorsal del pliegue de piel como resultado un incremento 73,2% en microvasos inducidas por el tumor, con un mayor número de puntos de sangrado pequeñas en comparación con las células de control (P < 0,05 Figura 2B). Estos resultados muestran claramente que la sobreexpresión de SPARC en el cáncer gástrico inhibe la angiogénesis Para determinar el efecto de la sobreexpresión de SPARC sobre la MMP-7 y VEGF, cuantitativa en tiempo real PCR y ensayos de transferencia Western se realizaron. Los resultados mostraron que la MMP-7 y la expresión de VEGF se regula negativamente por la expresión de SPARC. En las células BGC-SP, los niveles de MMP-7 mRNA, proteína MMP-7, el ARNm de VEGF, y la proteína VEGF fueron inhibidas por 87.2%, 68.9%, 48.4% y 58.6%, respectivamente, en comparación con las células vector transfectadas vacías. En las células HGC-SH, el nivel de mRNA de MMP-7 aumentó 11,6 veces, el nivel de proteína MMP-7 aumentó 8,1 veces, el nivel de ARNm de VEGF aumentó 8,8 veces, y el nivel de proteína VEGF aumentó 3,2 veces en comparación con vacío células de vector (Figura 3A, B). Para determinar si la vía de señalización MAPK estaba regulado por SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 y P-38 niveles se evaluaron por transferencia de Western. Los resultados mostraron que los niveles de p-ERK1 /2 se redujo significativamente en las células BGC-SP y elevado en las células HGC-SH en comparación con sus células de control (Figura 3C). para confirmar que los efectos pro-angiogénicos observados con disminución de la expresión de SPARC se deben al aumento de la expresión de MMP-7 y VEGF y no a los niveles de sí SPARC, HUVECs se incubaron en medios acondicionados a partir de células cosechadas HGC-SH con exógenos añadió recombinante humana SPARC (rhSPARC, 0,3 mg /ml). Nuestros datos indican que la adición de SPARC exógeno no inhibió estructuras similares a capilares de HUVECs en comparación con HGC-SH (Figura 4), a diferencia de la respuesta anti-angiogénico visto con la expresión endógena de SPARC en BGC823 células (Figura 2). para caracterizar mejor el papel de VEGF y MMP-7 en la modulación de la angiogénesis mediada por SPARC, MMP-7-shRNA y el anticuerpo VEGF 1 mg /ml de neutralización (Chemicon, Temacula, CA, EE.UU.) se utilizaron para los clones HGC-sh para antagonizar las funciones de MMP-7 y VEGF. Hemos examinado la capacidad de MMP-7 expresión en células SH-HGC para modular la angiogénesis in vitro fotos: por transfección estable MMP-7-shRNA en células HGC-sh. Figura 4A indica que la expresión de MMP-7 en células MMP7-sh-sh + HGC se había reducido regulado por expresar de forma estable MMP-7-sh-ARN a un nivel comparable con el de las células HGC-EV HGC-P y. Para dilucidar el papel de la MMP-7 en la promoción mediada por SPARC derribo de la angiogénesis inducida por células tumorales, se realizó un análisis de la formación de capilares con medio condicionado de células HGC-sh-sh y HGC + células MMP7-sh. Como se muestra en la Figura 4B, los resultados indican que la disminución de MMP-7 expresión en células de HGC-SH + MMP7-sh llevado a una significativa disminución de la formación de capilares por HUVECs in vitro Para determinar la función de la expresión de VEGF elevada inducida por silenciamiento SPARC, VEGF en los medios de HGC-sh-sh y HGC + MMP7-sh acondicionado las células se neutralizó por el anticuerpo VEGF (1 mg /ml). Los resultados mostraron que la formación de capilares de HUVECs se redujo significativamente en el sobrenadante HGC-SH que contiene el VEGF anticuerpos neutralizantes en comparación con el sobrenadante de las células HGC-SH solos (HGC-SH + anti-VEGF vs medio condicionado libre de suero recogidas de HGC-P, HGC-EV, HGC-SH con o sin rhSPARC (0,3 mg /ml) y las células HGC-SH + MMP7-SH se concentraron por tubo de ultrafiltración (Millipore, Bedford, MA , EE.UU.) en las mismas condiciones. transferencia Western mostró que la concentración de SPARC en células HGC-SH con 0,3 mg /ml inmedium rhSPARC era igual a la de la HGC-P sobrenadante (Figura 4A). sobreexpresión de SPARC en células de cáncer gástrico Inhibe tumorigenicidad en ratones desnudos Para evaluar la eficacia terapéutica de la expresión de SPARC, BGC-P, BGC-EV, células BGC-SP o HGC-P, HGC-EV, se inyectaron células HGC-sh por vía subcutánea en ratones desnudos. No hubo diferencia significativa en el tamaño entre BGC-P (n = 6, con una media del volumen del tumor = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6, con una media del volumen del tumor = 1856 ± 69 mm 3 xenoinjertos). Una disminución significativa (39,1%) en el volumen medio del tumor fue encontrado en animales implantados con xenoinjertos de BGC-SP (n = 6; volumen del tumor promedio = 1130 ± 55 mm 3) en comparación con los animales implantados con xenoinjertos de BGC-EV ( P < 0,05, Figura 5). No hubo diferencia significativa en el tamaño entre HGC-P (n = 6, con una media del volumen del tumor = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6, con una media del volumen del tumor = 1708 ± 82 mm 3 xenoinjertos). Un aumento significativo (50,3%) en el volumen medio del tumor fue encontrado en animales implantados con xenoinjertos de HGC-SH (n = 6; volumen del tumor promedio = 2412 ± 75 mm 3) en comparación con los animales implantados con xenoinjertos de HGC-EV ( P <. 0,05, Figura 5) Para evaluar SPARC, VEGF, MMP-7 expresiones in vivo Discusión Con el fin de investigar el papel de SPARC en el cáncer gástrico, primero a prueba la expresión de SPARC en siete líneas celulares de cáncer gástrico. La mayoría de las líneas de células no expresan, o sólo se expresan bajo nivel de SPARC. Para determinar el papel de SPARC en el crecimiento y la angiogénesis de cáncer gástrico, se estableció el clon de BGC-SP que fue transfectada de forma estable con un vector de SPARC cDNA, y el clon HGC-sh que fue transfectada de forma estable con un vector de shRNA orientación SPARC mRNA. expresión SPARC se incrementó significativamente en el clon BGC-SP y la disminución en el clon HGC-sh en comparación con sus respectivos clones de control, tal como se determina por transferencia de Western y RT-PCR análisis. tasa de proliferación celular fue menor en el clon BGC-SP, y fue mayor en el clon HGC-SH que en sus respectivos clones de control por el método MTT. También se encontró que la sobreexpresión de SPARC inhibe la formación de capilares inducida por células tumorales de HUVECs in vitro Los vasos sanguíneos son esenciales para suministrar nutrientes a los tejidos . Por lo tanto, la neovascularización es indispensable para el desarrollo de tumor sólido. Estudios anteriores han demostrado que SPARC desempeña un papel en la angiogénesis [7]. Nuestros resultados mostraron que la sobreexpresión de SPARC inhibe la angiogénesis Hemos puesto en marcha más estudios para investigar el papel de VEGF y MMP-7 en la modulación de la angiogénesis mediada por SPARC. Cuando se añadió la proteína SPARC humana recombinante a medio condicionado del clon HGC-sh para restaurar la concentración de SPARC, este medio acondicionado no cambió la formación de capilares de HUVECs por in vitro VEGF juega un papel clave en la angiogénesis, y es necesario para la supervivencia de las células endoteliales [8]. En glioma, SPARC inhibió el crecimiento del tumor mediante la alteración de su microambiente y la supresión de su angiogénesis a través de la inhibición de la expresión de VEGF y la secreción de [5]. Puede haber una relación negativa entre SPARC y expresiones de VEGF, es decir, cuanto más SPARC, menos VEGF o viceversa MMP-7 es capaz de membrana basal o degradantes tejido conectivo alrededor de los vasos. También estimula la síntesis de ADN en las células endoteliales vasculares cultivadas, e induce la angiogénesis en el sitio donde se implantaron células de cáncer de colon en un modelo de ratón [15]. VEGF y otros factores angiogénicos funcionan principalmente a través de las vías de señalización de MAPK, que se cree que son importantes vías de transducción implicados en los procesos neovascularización en tumores [8]. Nuestro estudio reciente mostró que la MMP-7 de expresión se modula a través de la activación de las vías de señalización MAPK [16]. Varios estudios también demostraron que SPARC modula negativamente la activación de las vías de MAPK [17]. En consecuencia, la expresión de SPARC puede alterar el equilibrio angiogénico de tumores por abajo de la regulación de una serie de factores de promoción de la neovascularización. Para investigar la función de SPARC en la regulación del crecimiento del cáncer gástrico in vivo SPARC se expresa en las células normales gástricas epiteliales, células de cáncer gástrico, y las células del estroma que rodean el cáncer gástrico en un nivel inferior [21 ]. Un estudio de inmunohistoquímica mostró que SPARC expresa principalmente en las células del estroma que rodean al tumor [22]. Estas diferencias no pueden ser explicadas por completo. SPARC expresión puede depender el tipo histológico del tumor, o En resumen, la inhibición del crecimiento de cáncer gástrico por SPARC parece estar mediado a través de sus efectos de supresión de MMP-7 y VEGF expresiones, que a su vez puede inhibir la infiltración de microvasos en los tumores. Se concluye que la baja regulación de SPARC puede asociar con el progreso de cáncer gástrico, y la exploración destinado a regular la expresión de SPARC puede llegar a ser un enfoque significativo para mejorar el tratamiento del cáncer gástrico. Los anticuerpos y reactivos Los anticuerpos contra SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2, (p) p-38, MMP-7 (tecnología de señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), el VEGF, y CD31 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) se utilizaron para el Western Blot e inmunohistoquímica. El rhSPARC fue suministrado por R & D (Minneapolis, MN, EE.UU.). Reverse kit de PCR de transcripción fue suministrado por Promega (Madison, WI, EE.UU.). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, EE.UU.) se utilizó para la baja regulación de MMP-7 en los clones de células. β-caseína (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, EE.UU.) se utilizó en zimografía β-caseína. Todos los demás reactivos fueron de grado analítico o mejor. humanos líneas celulares de cáncer gástrico AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 se obtuvieron de la Instituto del cáncer de la Academia china de Ciencias Médicas. Todas las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). BGC-EV (transfectadas con el vector vacío), BGC-SP (sobreexpresión de SPARC cDNA), HGC-EV (que expresan el vector vacío) y HGC-sh (que expresan SPARC shRNA) se cultivaron en RPMI 1640 completo con G418 (50 mg /ml) . Todas las células se mantuvieron en cultivos monocapa a 37 ° C en el aire humidificado con un 5% de CO 2. Aproximadamente 150.000 BGC-823 células se sembraron por pocillo en una placa de seis pocillos en RPMI 1640 con 10% de FBS y dejó que se unieran durante la noche. cantidades equimolares de pcDNA3.1 con larga duración de cDNA SPARC vector o el vector vacío (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) se incubaron con el reactivo Lipofectamine 2000 transfección (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). Validado SureSilencing humana SPARC shRNA y el vector de control vacío se obtuvieron de SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, EE.UU.). HGC-27 células se transfectaron como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las células fueron transfectadas de manera estable usando lipofectamina. células transfectadas se seleccionaron con G418 (100 mg /ml para BGC-SP y clones HGC-SH) durante 14 días antes de que el aislamiento de clones individuales. Se establecieron variantes HGC-sh-sh-MMP7 como se ha descrito anteriormente, células del clon HGC-SH se transfectaron con MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, EE.UU.) utilizando lipofectamina. Luego, las células transfectadas se seleccionaron por puromicina (1 mg /ml) durante 10 días. La proliferación celular se determinó mediante un 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) bromuro (MTT) ensayo de -2,5-difeniltetrazolio como se describe anteriormente [24]. Brevemente, 500 células fueron cultivadas por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 8 días y, a continuación, MTT (R & D, Minneapolis, MN, EE.UU.) se añadió a las células. Los valores de absorbancia a 550 nm se midió con un lector de microplacas. Los resultados se muestran como la media de la absorbancia a 550 nm y los medios (± SD) de determinaciones por cuadruplicado de seis experimentos separados. lisados de células totales se prepararon y analizaron por Western Blot como se describe anteriormente [24]. Brevemente, los anticuerpos para SPARC, MMP-7, y VEGF (1:1000 dilución) se utilizaron para detectar SPARC, MMP-7, y VEGF, respectivamente, mientras que los anticuerpos para (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2 y (p-) p 38-(1:800 dilución) se utilizaron para detectar la activación de la vía de señalización MAPK. Los anticuerpos unidos se visualizaron utilizando ECL (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en una estación de imágenes Kodak System Pro 4000 mm (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.). La densidad de las bandas se cuantificó por análisis densitométrico utilizando el sistema de herramienta de Image (versión 3.0). ARN total fue aislado de las células tumorales transfectadas de manera estable utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) y se trató durante 45 minutos a 37 ° C con DNasa RQ1 (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El ARN se transcribe de forma inversa utilizando la transcriptasa inversa AMV (A3500, Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un sistema de detección de secuencias ABI Prism7300 (Applied Biosystems, Beverly, MA, EE.UU.) utilizando un kit A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los cebadores usados para cuantitativa en tiempo real PCR fueron las siguientes: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sentido) y 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisentido); y VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sentido) y 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisentido). Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sentido) y 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisentido); y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sentido) y 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisentido). β-caseína Zymography La actividad funcional de MMP-7 se evaluó por zimografía β-caseína en 10% geles de poliacrilamida embebidos con 1 mg /ml β-caseína. se sometieron a electroforesis cantidades iguales de los medios de comunicación libre de suero condicionado de células cultivadas durante 24 horas. Después de la electroforesis, los geles se lavaron en 2,5% de Triton X-100 durante una hora para eliminar el SDS. Los geles se incubaron a continuación durante 18 horas a 37 ° C en Tris 50 mM /HCl que contiene CaCl 10 mM 2 y 0,02% NaN 3, se tiñeron con azul brillante de Coomassie y a continuación se destiñó. actividades proteolíticas de latente de MMP-7 y activado MMP-7 se evidenciaron como bandas con masas moleculares de 28 y 19 kDa, respectivamente. acondicionado colección de medios de Experimentación En total, 2 × 10 5 células de HGC-P, BGC-P o sus correspondientes clones transfectados de manera estable se sembraron y se incubaron en RPMI 1640 completo en portaobjetos de cámara de 6 pocillos y se dejaron crecer durante 24 h. Posteriormente, se recogieron los medios acondicionados, etiquetados y almacenados a -80 ° C para su uso futuro. Para examinar el efecto de SPARC en In vitro Dorsal pliegue de la piel Modelo de Cámara Los estudios se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Pekín (ética aprobación de la solicitud número No. J201155). Los in vivo modelos de xenoinjertos e inmunohistoquímica Los ratones desnudos atímicos se asignaron al azar a los diferentes grupos (n = 6 por grupo). Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco trasero inferior con BGC-P humana, BGC-EV, BGC-SP o HGC-EP, HGC-EV, células HGC-SH (2 × 10 6 células por ratón). El crecimiento del tumor se monitorizó mediante la palpación en el sitio de la inoculación.
y in vivo
.
Método
. Cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot se realizaron para detectar si la expresión de VEGF y MMP-7 fueron modulados por la expresión de SPARC. A fin de determinar el efecto de la expresión de SPARC en la angiogénesis in vivo
, se establecieron modelos de xenoinjerto y densidad de los microvasos (MVD) de diferentes clones se detectaron mediante inmunohistoquímica.
Resultados
.
[9].
Resultados
y in vivo
e in vitro in vivo
.
La señalización MAPK Camino y expresión de VEGF y MMP-7 se inhiben la sobreexpresión de SPARC
Knock-down de SPARC Expresión en HGC-27 células, estimula la angiogénesis a través de VEGF regulado plano y MMP-7 expresión
(HGC-SH + MMP7-sh vs
HGC-sh, P <. 0,05)
HGC-sh, P < 0,05 Figura 4B). la formación de capilares de HUVECs fue casi completamente inhibida cuando se cultivan en medios acondicionados de HGC-SH + células MMP7-sh plus añadió anticuerpo VEGF neutralizante ( vs
HGC-sh, P < 0,05 Figura 4B).
, secciones de xenoinjertos se tiñeron con un anticuerpo monoclonal contra SPARC humano, VEGF o MMP-7 . Figura 5A indica que los tumores BGC-SP expresan más SPARC de BGC-P, los tumores BGC-EV, mientras que concomitantemente VEGF, MMP-7 expresiones se disminuyó (P < 0,05, Figura 5A). Secciones de tumores HGC-sh expresan SPARC menos de HGC-P, los tumores HGC-EV mientras que concomitantemente VEGF, MMP-7 expresiones se aumentaron (P < 0,05, Figura 5A). CD31 se utiliza principalmente para demostrar la presencia de las células endoteliales vasculares en secciones de tejidos histológicos, que pueden ayudar a evaluar el grado de angiogénesis tumoral. Para evaluar si la expresión alterada SPARC medió la densidad microvascular (MVD), se analizó la angiogénesis en xenoinjertos mediante análisis histológico de CD-31. No hubo diferencia significativa en MVD entre BGC-P (12,5 ± 2,3 microvasos /0.145 mm 2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 microvasos /0.145 mm 2) xenoinjertos. MVD se redujo un 54,8% en BGC-SP (5.2 ± 2.1 por microvasos /mm 2) los tumores en comparación con los tumores BGC-EV (P < 0,05, Figura 5). No hubo diferencia significativa en MVD entre HGC-P (6,4 ± 2,1 microvasos /0.145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 microvasos /0.145 mm 2) xenoinjertos. MVD se elevó un 51,7% en HGC-SH (10,5 ± 1,5 microvasos /0.145 mm 2), los tumores en comparación con los tumores HGC-EV (P < 0,05, Figura 5) guía
y la angiogénesis en el ensayo de ventana dorsal in vivo
. Por otro lado, la baja regulación de SPARC por la interferencia ARNm promovió la formación de capilares in vitro y la angiogénesis
in vivo
.
e in vitro in vivo
en asociación con la disminución de la MMP-7, VEGF y fosforilados ERK1 /2, mientras que la baja regulación de SPARC promovido angiogénesis
e in vitro in vivo
en asociación con el aumento de MMP-7, VEGF y fosforilados ERK1 /2.
ensayo en comparación con la formación de capilares de HUVECs se incubaron en el medio condición sin exógeno rhSPARC. A continuación, utiliza la MMP-7-shRNA para regular a la baja la expresión de MMP-7 en el clon HGC-sh, y /o anticuerpo anti-VEGF para neutralizar VEGF en medio condicionado del clon HGC-sh. la formación de capilares de HUVECs se inhibió significativamente cuando se incubaron en el medio acondicionado con un menor MMP-7 y /o VEGF bloqueado. Estos experimentos sugieren que SPARC baja regulación no es suficiente para la inducción de neovascularización, y otros factores deben estar involucrados en este proceso.
[13], [14].
, clones de células HGC-SH BGC-SP y se compararon con sus clones de control para su capacidad para formar tumores en un modelo subcutáneo. SPARC sobreexpresión reduce significativamente el tamaño del tumor de xenoinjerto con MVD reducida, baja regulación de SPARC de interferencia por ARN promueve el crecimiento del tumor de xenoinjerto con el aumento de MVD. Por lo tanto, en xenoinjertos de cáncer gástrico, la expresión de SPARC se correlaciona negativamente con la angiogénesis. Estudios anteriores indicaron que SPARC contribuyó a la regulación de la formación de tumores, aunque su papel parecía ser células de tipo específico. En el cáncer de xenoinjertos de línea celular hepatocelular, SPARC sobreexpresión retrasó significativamente la formación de tumores, reduce el tamaño del tumor, y la disminución de MVD en comparación con xenoinjertos de control [18]. En los tejidos de cáncer de colon, la expresión de SPARC se correlacionó negativamente con la expresión de VEGF y MVD [19]. En las células de meduloblastoma, SPARC sobreexpresión inhibe la angiogénesis conduce a la disminución del crecimiento del tumor [11]. En las células endoteliales microvasculares humanas, SPARC inhibe la síntesis de ADN in vitro
[6]. En los xenoinjertos de neuroblastoma, péptidos SPARC inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral in vivo
[20]. Estos resultados confirmaron SPARC como un inhibidor de la angiogénesis tumoral in vivo
.
viceversa. Un estudio reciente encontró que la inmunohistoquímica expresión SPARC se correlaciona negativamente con la expresión de VEGF y MVD en tejidos de cáncer gástrico, y la expresión de SPARC se redujo en el cáncer gástrico con un mayor grado de malignidad [23].
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Establecimiento de BGC-SP, clones HGC-sh y clones HGC-sh-sh-MMP7
Ensayo de proliferación celular
análisis de transferencia Western
RT-PCR y cuantitativa en tiempo real PCR
de células endoteliales capilares-como la formación de tubos de ensayo
la angiogénesis, se realizó un ensayo de formación capilar. En este ensayo, matrigel se pipeteó en placas de 96 pocillos pre-refrigerados (75 l de Matrigel por pocillo) y se polimeriza durante 30 minutos a 37 ° C. Para determinar si la expresión alterada SPARC regularía la angiogénesis, HUVECs (5000 células por pocillo) se incubaron en 100 l de medio acondicionado cosechadas a partir de diferentes tipos de células. Después de 36 h de incubación, se fotografiaron las estructuras tubulares. Cada condición de ensayo se evaluó en las determinaciones por cuadruplicado a partir de tres experimentos separados. Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara A640 de tiro del cañón de energía en un microscopio invertido Olympus con una magnificación de 100 ×; la longitud del tubo se cuantificó mediante IPP (versión 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
procedimientos fueron realizados de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. ratones atímicos desnudos (6 semanas de edad, hembra, 26-28 g, n = 3 por grupo) fueron criados y mantenidos dentro de un ambiente libre de gérmenes. La técnica de implantación se ha descrito anteriormente [11]. Un saco de aire dorsal se hizo en el ratón mediante la inyección subcutánea de 10 ml de aire después de que el animal fue anestesiado por completo. cámaras de difusión (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se prepararon mediante la alineación de las membranas Millipore de 0,45 mm en ambos lados de la llanta de la junta tórica con el cemento. BGC-P, BGC-EV y BGC-SP; HGC-P, HGC-EV o células HGC-SH (1 × 10 6) suspendido en PBS se inyectaron en la cámara. A 2 cm de largo incisión se hizo horizontalmente a lo largo del borde del saco de aire dorsal, y las cámaras se coloca debajo de la piel. Los ratones se sacrificaron 10 días más tarde. Los animales fueron despellejados cuidadosamente alrededor de las cámaras implantadas. Los pliegues de la piel que cubren las cámaras se fotografiaron bajo luz visible. Se contó el número de vasos sanguíneos.
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