Sažetak pregled
Pozadina pregled
izlučuje protein kiseli i bogate cisteinom (SPARC) je glikoprotein koji funkcionira tako da inhibira angiogenezu, proliferaciju i invaziju u različitim vrstama raka. Vjeruje sposobnost SPARC modulirati neovaskularizaciju biti djelomično posredovano svojoj sposobnosti da modulira ekspresiju faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) i metaloproteinaza matriksa (MMP). U ovom istraživanju, željeli smo utvrditi učinak SPARC izražavanja u želučanih stanica raka na proliferaciju i angiogenezu In vitro Metoda pregled Procijenili smo ekspresiju SPARC sedam staničnih linija raka želuca. Onda smo uspostaviti stabilno transfektirane SPARC pojačana ekspresija stanične linije (BGC-SP) i stabilno transficirana SPARC knock-down stanične linije (HGC-sh). Učinak SPARC prekomjernom ekspresijom i SPARC ušutkavanja je studirao ispitujući nastanak kapilara HUVEC In vitro Rezultati endogeni SPARC prekomjerna ekspresija inhibira ekspresiju VEGF i MMP-7, kao i angiogeneza inducirana BGC-SP stanica. Odgovarajuće, SPARC utišavanje povećava ekspresiju VEGF i MMP-7, kao i angiogeneza inducirana HGC-SH stanicama. Povišena angiogeneza inducirana SPARC utišavanje u HGC-sh stanica bila je smanjena kada je VEGF je neutralizirana antitijela i MMP-7 je srušen in vitro pregled. SPARC potiskuje angiogenezu raka želuca podreguliranjem ekspresiju VEGF i MMP-7 pregled Izvor. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012), izlučeni protein Kiseli i Bogata cisteina (SPARC) slabi angiogenezu podreguliranje ekspresija VEGF i MMP-7 u rak želuca. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 pregled Urednik: Rajesh Mohanraj, UAE University, Ujedinjeni Arapski Emirati Primljeno: 9. lipnja 2012. godine; Prihvaćeno: 6. kolovoz 2012; Objavljeno: 5. rujna 2012 pregled Copyright: © Zhang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan financiranja. Ovo djelo je financirala Nacionalna zaklada prirodoslovni Kine (br 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled Uvod pregled Od smrti izazvane rakom, rak želuca zauzima drugo mjesto na svijetu, nakon raka pluća; Gotovo dvije trećine slučajeva javlja se u zemljama u razvoju, uključujući i 42% iz Kine [1]. Angiogeneza kritična proces raka želuca; dakle, regulatorne i signalne molekule koje moduliraju angiogenezu postaju fokus ovog istraživanja. Angiogeneza nije aktivan proces po sebi; je kontroliran neki angiogenih faktora i nekih inhibitora angiogeneze. pregled izlučenog proteina kiseli i bogate cisteinom (SPARC), također poznat kao Osteonectin ili BM-40, je mnogostran izlučeni glikoprotein koji se izražava mnoge različite vrste stanica i povezana je sa stvaranjem kostiju, fibroze i popravak tkiva. pregled Nedavne studije pokazuju da SPARC modulira proliferaciju, apoptoza, invaziju i angiogenezu u različite vrste stanica raka, međutim, uloga SPARC u tumourigenesis je složen i čini se da je stanični tip zbog svoje različite funkcije u danom mikrookoliša [2]. SPARC djeluje kao supresor tumora kod raka dojke, neuroblastom, gušterače, jajnika i pluća. [3] Jajnika u SPARC-nul miševi porastao znatno veća od one u divljeg tipa životinja s povećane razine faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) i metaloproteinaza matriksa (MMP). [4] Po suzbijanju tumora vascularity kroz suzbijanje VEGF ekspresije i izlučivanja, SPARC inhibirana glioma rasta [5]. SPARC veže na VEGF, čime se inhibira VEGFR fosforilacije, mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK), aktivaciju i sintezu DNA VEGF-induciranu [6]. Međutim, uloga SPARC u angiogenezi je stanični tip, koji mijenja signalnih događaja kao odgovor na stanični jedinstvene sredina [7]. Pregled VEGF potiče angiogenezu i najvažniji signal protein proizveden u stanicama [8]. MMP igraju važnu ulogu u razvoju tumora, a ne samo u degradiraju ekstracelularni matriks ali i reguliranja angiogeneze. MMP-7, koji je najmanji molekulska težina svih članova obitelji MMP, pokazano je da ubrzavaju proliferaciju stanica endotela ljudske pupčane vene (HUVEC) u dozi ovisan in vitro pregled [9]. pregled primarna funkcija SPARC u angiogenezu želučanih staničnim linijama karcinoma ostaje nejasno. Stoga, u ovom istraživanju, pretpostavili smo da SPARC mogli modulirati proliferacije i angiogeneze pomoću regulacije VEGF i MMP-7 izraza u želučanim stanice raka. Za testiranje ove hipoteze, testirali smo ekspresiju SPARC u sedam želučanih staničnim linijama karcinoma. Zatim, kako bi se ocijenio učinak izmijenjenom SPARC na želučanih stanica raka, uspostavili smo BGC-SP klon, koji jako izražen SPARC i HGC-sh klon u kojem je endogeni SPARC srušen. Pregled Rezultati pregled Ekspresija SPARC u kulturi stanica raka želuca Procijenili smo ekspresiju SPARC u nekoliko staničnih linija raka želuca. Western blot je pokazala da je SPARC je undectable u AGS, MKN45, NCI-N87 i BGC-823 staničnih linija, međutim SGC-7901 stanična linija izražena nisku razinu SPARC i HGC-27, MGC-803 staničnih linija izražena visoka razina SPARC ( Slika 1A). pregled Prekomjerna i Inhibicija endogenom sPARC u želudac staničnim linijama karcinoma Western hibridizacije pokazala je da je 43 kDa vrpca koja odgovara sPARC proteina značajno povećao u BGC-SP (BGC stanica eksprimiraju SPARC cDNA stanice) u usporedbi s roditeljskim (BGC-P), te kontrolnih stanica transfeciranih sa praznim vektorom (BGC-EV) (P 0,05); sparc je inhibirana gotovo dvije trećine u HGC-sh stanica (HGC stanica koje eksprimiraju SPARC-shRNA) u usporedbi s HGC-P i HGC-EV stanica (P < 0.05, Slika 1B). RT-PCR je naznačeno da je povećana SPARC mRNA u BGC-SP stanica u usporedbi s BGC-P i BGC-EV stanica (P 0,05); izraz SPARC mRNA u HGC-sh smanjen za gotovo 80% u odnosu na HGC-P i HGC-EV stanica (P 0,05, slika 1B). pregled SPARC Prekomjerna Smanjene Proliferacija Želučani staničnim linijama raka Kako bi se utvrdilo je li promijenio SPARC izraz utjecati na proliferaciju želučanih staničnim linijama karcinoma, rast inficiranim stanicama uspoređeni su s onima iz roditeljskih i praznih vektorske kontrole. Podaci pokazuju da je rast BGC-SP stanice je inhibirana u odnosu BGC-P i BGC-EV stanica nakon 8 dana kulture (P < 0.05); povećan rast HGC-SH stanicama malo u usporedbi s HGC-P i HGC-EV stanica (P < 0.05, Slika 1C). pregled SPARC Prekomjerna ekspresija u Gastric staničnim linijama raka smanjuje Angiogeneza in vitro Da bi razumjeli učinak izmijenjenom SPARC izražavanja na angiogenezu u želučanom staničnim linijama karcinoma, HUVEC su inkubirani u održavanoj podlozi. Supernatant BGC-SP inducirane HUVEC za diferencijaciju u kapilarama strukturama u roku od 36 sati (2564,5 ± 553.1 um, P 0,05), u manjoj mjeri nego što je supernatant iz BGC-EV stanica (5002,4 ± 665,7 uM) i BGC-P stanicama (5417,3 ± 784,25 um, Slika 2A). Supernatant HGC-sh inducirane HUVEC za diferencijaciju u kapilarama strukturama u roku od 36 sati (7024,9 ± 923,1 pm, P 0,05) jačeg mjeri nego supernatanta iz HGC-EV stanica (4456,2 ± 554,2 uM) i HGC-P stanicama (4023,4 ± 665,2 pm, Slika 2A). Kvantifikacija prosječne duljine cijevi pokazuju da je duljina cjevčica od HUVEC u kondicioniranom mediju iz BGC-SP je smanjena za oko 52.7% u usporedbi s kontrolnim stanicama; Duljina cijevi od HUVEC u održavanoj medijima iz HGC-sh klonova povećan je 74,6% u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 2a). pregled Model leđna prozor je pokazao da BGC-SP stanice imala pad od 40,4% u tumour- inducirana kapilarama u usporedbi s kontrolnim stanicama (p 0,05). HGC-SH stanica u koži leđa puta komora dovela do povećanja 73,2% u kapilarama tumorom inducirana, sa većim brojem sitnih krvarenja mrlje u usporedbi s kontrolnim stanicama (p < 0.05 Slika 2B). Ovi rezultati jasno pokazuju da SPARC pojačana ekspresija kod raka želuca inhibirana angiogenezu In vitro pregled i in vivo pregled. Pregled MAPK signalnim Put i ekspresija VEGF i MMP-7 su inhibirane po SPARC Prekomjerna ekspresija Netlogu Da bi se odredio učinak SPARC prekomjernom ekspresijom na MMP-7 i VEGF, kvantitativne real-time PCR i Western blot-testovima su izvedene. Rezultati su pokazali da MMP-7 i VEGF ekspresija negativno regulirana SPARC izražavanja. U BGC-SP stanica, razine MMP-7 mRNA, MMP-7 proteina VEGF mRNA i proteina VEGF inhibirana 87,2%, 68,9%, 48,4% i 58,6%, po istom redoslijedu, u usporedbi s praznim vektorom transfektiranim stanicama. U HGC-sh stanica, MMP-7 razina mRNA povećana 11,6 puta, razina MMP-7 proteina povećana 8,1 puta, razina VEGF mRNA povećana 8,8 puta, a razina proteina VEGF povećana za 3,2 puta u odnosu na prazna vektor stanica (Slika 3A, B). Da bi se utvrdilo da li je MAPK Signalni put bio je reguliran SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 i P-38 su određene pomoću Western blot pokusa. Rezultati su pokazali da su razine p-ERK1 /2 bile su značajno smanjeni u BGC-SP stanice i povišena u HGC-SH stanicama u usporedbi s njihovim kontrolnim stanicama (Slika 3C). Pregled knock-down SPARC Ekspresija u HGC-27 stanice pospješuje angiogenezu putem regulira prema gore VEGF i MMP-7 Expression kako bi potvrdili da su pro-angiogeni učinak viđen sa smanjenim SPARC izraz su zbog povećanog MMP-7 i VEGF izražavanja, a ne na razini Sam SPARC, HUVEC su inkubirane u kondicioniranom mediju koji dobivenih iz HGC-sH stanicama s egzogeno doda rekombinantni humani SPARC (rhSPARC, 0,3 ug /ml). Naši podaci pokazuju da dodavanje egzogenog SPARC ne inhibira nalik kapilarama strukture HUVEC usporedbi s HGC-sh (slika 4), za razliku od anti-angiogeneze odgovora opaženog s endogenim izrazom SPARC u BGC823 stanicama (Slika 2). Pregled za daljnju karakterizaciju ulogu VEGFu i MMP-7 u SPARC posredovanog modulaciju angiogeneze, MMP-7-shRNA i 1 ug /ml za neutralizaciju VEGF antitijela (Chemicon, Temacula, CA, USA) su korišteni za HGC-sh klonova u antagonizira funkcije MMP-7 i VEGF. pregled ispitali smo sposobnost MMP-7 ekspresije u HGC-sH stanicama za moduliranje angiogeneze in vitro Da bi odredili funkciju pojačanom ekspresijom VEGF inducirane SPARC ušutkavanja, VEGF u održavane podloge HGC-SH i HGC-SH + MMP7-sh stanice se neutralizira VEGF protutijela (1 ug /ml). Rezultati su pokazali da je formiranje kapilarna HUVEC se značajno smanjio u HGC-SH tekućine koja je sadržala VEGF neutralizaciju antitijela u usporedbi s supernatant iz HGC-sh stanica sama (HGC-sh + anti-VEGF vs bez seruma medij dobivenih iz HGC-p, HGC-EV HGC-sh, sa ili bez rhSPARC (0,3 ug /ml) i HGC-sh + MMP7-SH stanicama se koncentriraju ultrafiltracijom cijevi (Millipore, Bedford, MA , USA) pod istim uvjetima. Western blot je pokazala da je koncentracija u SPARC HGC-SH stanicama s 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium bila je jednaka onoj koju ima HGC-P supernatant (Slika 4A). Pregled Prekomjerna SPARC u želudac stanica raka Koči Tumourigenicity na miševe pregled Kako procijeniti terapijski učinak SPARC izražavanja, BGC-p, BGC-EV, BGC-SP stanica ili HGC-p, HGC-EV, HGC-SH stanice su injektirane potkožno u miševa. Nije bilo značajne razlike u veličini između BGC-P (n = 6; znači volumen tumora = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6; znači volumen tumora = 1856 ± 69 mm 3 ) ksenografta. Značajno smanjenje (39,1%) u srednje vrijednosti volumena tumora je pronađena u životinja kojima je ucijepljen BGC-SP ksenografta (n = 6 znače volumen tumora = 1130 ± 55 mm 3) u usporedbi sa životinjama usađene BGC-EV ksenografta ( P < 0.05, Slika 5). Nije bilo značajne razlike u veličini između HGC-P (n = 6; znači volumen tumora = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; znači volumen tumora = 1708 ± 82 mm 3 ) ksenografta. Značajno povećanje (50,3%) u srednje vrijednosti volumena tumora je pronađena u životinja kojima je ucijepljen HGC-sh ksenografta (n = 6 znače volumen tumora = 2412 ± 75 mm 3) u usporedbi sa životinjama usađene HGC-EV ksenografta ( p <, 0.05, Slika 5) pregled za procjenu SPARC, VEGF, MMP-7 izrazi in vivo pregled, ksenografta sekcije su označene s monoklonskim protutijelom protiv ljudskog SPARC, VEGF ili MMP-7 , Slika 5A pokazuje da BGC-SP tumori eksprimiraju više od SPARC BGC-P, BGC-EV tumora, dok je istovremeno VEGF, MMP-7 izrazi smanjena (P < 0.05, slika 5A). Sekcije iz HGC-sh tumora izraziti manje SPARC od HGC-P, HGC-EV tumora, dok istovremeno VEGF, MMP-7 izrazi (P < 0.05, Slika 5A). CD31 se prvenstveno koristi za utvrdi prisutnost vaskularnih endotelnih stanica u sekcijama histoloških tkiva, što može pomoći za procjenu stupnja tumorske angiogeneze. Kako procijeniti je li promijenio SPARC izraz posredovani gustoću mikrožila (MVD), analizirali smo angiogenezu u ksenografta po histološkom analizom CD-31. Nije bilo značajne razlike u MVD između BGC-P (12.5 ± 2.3 Mikro vaskularne žile /0.145 mm 2), BGC-EV (11.5 ± 3.4 kapilarama /0.145 mm 2) stranih tijela. MVD je smanjen 54,8% u BGC-SP (5,2 ± 2,1 kapilarama po /mm 2) tumori u usporedbi s BGC-EV tumora (P < 0.05, Slika 5). Nije bilo značajne razlike u MVD između HGC-P (6,4 ± 2,1 Mikro vaskularne žile /0.145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 kapilarama /0.145 mm 2) stranih tijela. MVD je uzdignut 51,7% u HGC-sh (10,5 ± 1,5 Mikro vaskularne žile /0.145 mm 2) tumori u usporedbi s HGC-EV tumora (p 0.05, Slika 5) pregled Rasprava pregled Kako bi se istražilo ulogu SPARC kod raka želuca, prvo smo testirali izraz SPARC u sedam staničnim linijama karcinoma želuca. Većina stanične linije nisu iskazali, ili samo izrazio nisku razinu SPARC. Da se odredi uloga SPARC u rastu i angiogeneza raka želuca, uspostavili smo BGC-SP klon koji je stabilno transfektirana s SPARC cDNA vektor, i HGC-sh klon koji je stabilno transfektirana s shRNA ciljnog vektora SPARC mRNA. SPARC izraz značajno povećao u BGC-SP klona i smanjena je u HGC-SH klona u usporedbi sa svojim kontrolnim klonova, kao što je određeno Western blot metodom i RT-PCR analize. proliferaciju bila je niža u BGC-SP klona, a bio je viši u HGC-SH klon nego u njihovim kontrolnim klonova MTT metodom. Također smo otkrili da prekomjerna ekspresija SPARC inhibiran stanica tumora izazvanog kapilarno nastajanje HUVEC In vitro pregled i angiogeneza u ispitivanju leđnoj prozora in vivo pregled. S druge strane, down-regulacije SPARC strane mRNA smetnji promovira kapilarno nastajanje In vitro pregled i angiogeneza in vivo pregled. Pregled Krvne žile su neophodni za dostavu hranjivih tvari u tkiva , Stoga neovaskularizaciju je neophodna za razvoj čvrstog tumora. Prethodna ispitivanja su pokazala da SPARC igra ulogu u angiogenezi [7]. Naši rezultati pokazuju da prekomjerna ekspresija SPARC inhibirana angiogenezu In vitro pregled i in vivo pregled u suradnji s padom MMP-7, VEGF i fosforilirani ERK1 /2, dok je down-regulacije SPARC promaknut angiogeneza In vitro pregled i in vivo pregled u suradnji s porastom MMP-7, VEGF i fosforilirani ERK1 /2. pregled Mi i dalje provoditi studije istražiti ulogu VEGF i MMP-7, SPARC-posredovane angiogeneze modulacije. Kada se rekombinantni ljudski SPARC protein je upisan u uvjetovanog medija iz HGC-SH klona vratiti koncentraciju SPARC, ovaj uređaj srednje nije promijenio nastajanja kapilara HUVEC u In vitro pregled test u odnosu na nastajanje kapilara od HUVEC inkubirani u stanje medij bez egzogenog rhSPARC. tada se koristi MMP-7-shRNA da podregulira MMP-7 ekspresije u HGC-SH klona i /ili anti-VEGF antitijelo za neutralizaciju VEGF u kondicioniranom mediju iz HGC-SH klona. Formiranje kapilarna HUVEC je značajno inhibira kada su inkubirani u uvjetovanoj medija s nižim MMP-7 i /ili blokiran VEGF. Ti eksperimenti ukazuju da SPARC-dolje reguliranje sama nije dovoljna za indukciju neovaskularizaciju i drugi faktori moraju biti uključeni u ovaj proces. Pregled VEGF igra ključnu ulogu u angiogeneze, i nužna je za opstanak endotelne stanice [8]. U gliom, SPARC inhibira rast tumora promjenom njegova mikro-sredinu i suzbijanja njezinog angiogenezu kroz inhibiciju VEGF ekspresiju i sekreciju [5]. Postoji svibanj biti negativan odnos između SPARC i VEGF izraza, odnosno, više SPARC, manje VEGF ili obratno pregled [13], [14]. Pregled MMP-7 je sposoban ponižavajuće membranu ili vezivno tkivo oko krvnih žila. Također stimulira sintezu DNA u uzgojenim stanicama endotela krvnih žila, i izaziva angiogenezu na mjestu gdje su stanice raka debelog crijeva su implantirane u mišjem modelu [15]. VEGF i drugih angiogenetskih faktora funkcionira uglavnom preko MA.PK signalne puteve, koji se smatra da su važne prijenosa staze uključene u neovaskularizaciji procesa u tumorima [8]. Naš Nedavno istraživanje je pokazalo da MMP-7 ekspresije moduliran preko aktivacije MA.PK signalne puteve [16]. Nekoliko studija također pokazala da SPARC negativno modulirani aktivaciju MAPK putanja [17]. Prema tome, SPARC ekspresija može mijenjati angiogeneze ravnotežu u tumorima podreguliranjem niz neovaskularizaciju promovira faktora. Pregled Kako bi se istražila funkcija SPARC u regulaciji rasta karcinoma želuca in vivo pregled, BGC-SP i stanični klonovi HGC-SH je u usporedbi s njihovim kontrolnim klona na njihovu sposobnost da se formira tumora u potkožne modelom. SPARC prekomjerna ekspresija značajno smanjuje veličinu ksenografta tumora uz smanjenu MVD, down-regulacije SPARC RNA interferencije promovira rast ksenografta tumora s povećanim MVD. Stoga, u želučanim ksenografta raka, SPARC ekspresija u negativnoj korelaciji s angiogenezom. Prethodne studije pokazale su da SPARC pridonijeli regulaciju nastajanja tumora, iako je njegova uloga, čini se, stanični tip. U hepatocelularnih stanica raka-line ksenografta, SPARC prekomjerna ekspresija značajno kasni nastanak tumora, smanjuje veličinu tumora i smanjena MVD u usporedbi s kontrolnim ksenografta [18]. U debelog tkiva raka, izraz SPARC negativno povezana sa VEGF izražavanja i MVD [19]. U meduloblastom stanicama, SPARC prekomjerna ekspresija inhibirana angiogeneze što dovodi do smanjenja rasta tumora [11]. U ljudskim mikrovaskularnih endotelne stanice, SPARC inhibiraju sintezu DNA In vitro pregled [6]. U neuroblastoma ksenografta, SPARC peptida inhibiraju angiogenezu i rast tumora In vivo SPARC izražava u normalnim želuca epitela, želuca stanice raka, te stromalnih stanica koje okružuju želučane raka na nižoj razini [21 ]. Imunohistokemijski studija pokazala je da SPARC uglavnom izražen u stanice strome koje okružuju tumor [22]. Te razlike se ne mogu u potpunosti objasniti. SPARC ekspresija može ovisiti o histološkom tipu tumora, ili obratno pregled. Nedavna imunohistokemijski istraživanje pokazalo je da SPARC izraz negativno korelirana s izrazom VEGF i MVD u želučanog tkiva karcinoma, i SPARC izraz smanjena kod raka želuca s višim stupnjem malignosti [23]. Pregled Ukratko, inhibicija rasta raka želuca do SPARC čini se da je posredovan kroz suzbijanje učinaka na MMP-7 i VEGF izraza koji sa svoje strane može inhibirati infiltraciju u mikrožila tumora. Zaključujemo da dolje regulacija SPARC može povezati s napretkom raka želuca, a istraživanje s ciljem da regulira ekspresiju SPARC može postati značajna pristup za poboljšanje želučanog liječenja raka. Pregled Materijali i metode pregled Antitijela i reagensi pregled Antitijela protiv SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2, (p) p-38, MMP-7 (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA), VEGF, i CD31 (ABcam, Cambridge, MA, USA) su korišteni za Western hibridizacija i imunohistokemije. RhSPARC je isporučen s R &D (Minneapolis, MN, USA). Reverzne transkripcije-PCR je dobavljen od Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) je korišten za down-regulaciju MMP-7 u staničnim klonovima. β-kazeina (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) je korišten u P-kazein zimografije. Svi ostali reagensi su analitičkog stupnja ili bolje. Pregled Kultura Cell pregled ljudskog želuca staničnim linijama karcinoma AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 dobiveni su iz Rak institut kineske akademije medicinskih znanosti. Sve stanice se uzgajaju u RPMI 1640 mediju s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). BGC-EV (transficiranih s praznim vektorom) BGC-SP (ekspresijom SPARC cDNA) HGC-EV (izražavanje praznim vektorom) i HGC-SH (izražavanje SPARC shRNA) su rasle u kompletnom RPMI 1640 s G418 (50 ug /ml) , Sve stanice su održavane u jednoslojne kulture na 37 ° C u vlažnoj zraka s 5% CO 2. Pregled Uspostava BGC-SP, HGC-sh Klonovi i HGC-SH-MMP7-SH klonova približno 150.000 BGC-823 stanice po jažici u šest jažica u RPMI 1640 s 10% FBS, te ostavi da se vežu preko noći. Podjednaka količina pcDNA3.1 s full-length SPARC cDNA vektor ili prazan vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) su inkubirani s Lipofektaminje-2000 reagensa za transfekciju (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validirani SureSilencing ljudski SPARC shRNA i prazna kontrolu prijenosnika su dobiveni iz SuperArray Bioscience Corp (Frederick, MD, USA). HGC-27 stanice su transfektirane kako je ranije opisano [24]. Ukratko, stanice su transfektirane na stabilan način pomoću lipofektamina. Transfektirane stanice su selektirane s G418 (100 ug /ml za BGC-SP i HGC-sh klonova) 14 dana prije izdvajanja pojedinačnih klonova. HGC-sh-MMP7-SH inačice su postavljene kao što je opisano gore, HGC-SH klon stanice su transficirane s MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) primjenom lipofektamina. Zatim, transfektirane stanice su selektirane pomoću puromicina (1 ug /ml) tijekom 10 dana. Pregled stanične proliferacije pregled proliferacija stanica određena je 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difeniltetrazolijevog bromida (MTT) testa kao što je ranije opisano [24]. Ukratko, 500 stanice su kultivirane po ploči sa 96 otvora i inkubira kroz 8 dana, a zatim MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA), doda se u stanice. Vrijednosti apsorbancije pri 550 nm je mjerena pomoću čitača mikroploče. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost apsorbancija pri 550 nm, te sredstva (± SD) za četiri određivanja od šest različitih eksperimenata. Pregled Western blotting analiza pregled Ukupno stanični lizati su pripravljeni i analizirani western blot analizom kao što je opisano [24]. Ukratko, protutijela na SPARC, MMP-7, i VEGF (1:1000 razrjeđenje) su korišteni za detekciju SPARC, MMP-7, i VEGF, odnosno, dok antitijela (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 i (p) p-38 (1:800 razrjeđenje) su korišteni za detekciju aktivaciju MAPK signalnim putem. Vezanih antitijela su vizualizirani pomoću ECL (Promega, Madison, WI, USA) na Kodak sliku Station 4000 mm Pro sustav (Kodak, Rochester, NY, USA). Gustoća vrpci kvantificira denzitometrijsku analizom pomoću slika alat (verzija 3.0) sustava. Pregled RT-PCR i kvantitativne PCR u stvarnom vremenu pregled Ukupna RNA je izolirana iz stabilno transfektiranih tumorskih stanica pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, San Diego, CA, USA) i tretira kroz 45 minuta na 37 ° C uz RQ1 DNA-za (Promega, Madison, WI, USA). RNA je reverzibilno prepisana pomoću reverzne transkriptaze AMV (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativna realnom vremenu PCR je provedena u sustavu ABI Prism7300 Sequence Detection (Applied Biosystems, Beverly, MA, SAD) pomoću GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Primeri korišteni za kvantitativnu realnom vremenu PCR su kao što slijedi: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(smislena) i 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisens); i VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(smislena) i 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisense). Primeri korišteni za PCR su kao što slijedi: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(smislena) i 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisens); i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(smislena) i 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisense). pregled β-kazeina zimografiia pregled funkcionalna aktivnost MMP-7, procijenjena je β-kazeina zimografije na 10% poliakrilamidnim gelovima ugrađeni sa 1 mg /ml beta-kazeina. Jednake količine seruma kondicioniranog medija iz stanica koje su rasle 24 sata je elektroforeza. Nakon elektroforeze, gelovi su isprani u 2,5% Triton X-100 tijekom jednog sata da se ukloni SDS. Gelovi su potom inkubirane 18 sati na 37 ° C u 50 mM Tris /HCl koji sadrži 10 mM CaClz 2 i 0.02% NaN 3, obojan je sa Coomassie brilliant blue i obezbojena. Proteolitičke aktivnosti latentne MMP-7 i aktivira MMP-7 su dokazuje kako bendova s molekularnim masama 28 i 19 kDa, respektivno. Pregled Klima Media Kolekcija za eksperimentiranje Netlogu U ukupno, 2 × 10 5 stanice HGC-P, BGC-P i njihovi odgovarajući stabilno transfektiranih klonovi su nasadeni i inkubirani su u potpunosti u RPMI 1640 u 6 jažica komornim pločicama i ostavljene da rastu kroz 24 h. Nakon toga, uvjetovane mediji su prikupljeni, obilježeni i pohranjeni na -80 ° C za buduću uporabu. Pregled endotelnih stanica nalik kapilarama Tube Formiranje Test pregled Da bi ispitali učinak SPARC na u vitro pregled angiogeneze, analiza formacija kapilarna je izvedena. U ovom ispitivanju, Matrigel pipetom u prethodno ohlađene pločice s 96 jamica (75 ul Matrigel po jažici), a polimerizira se 30 minuta pri 37 ° C. Utvrditi prilagođena SPARC izraz bi regulirati angiogeneze, HUVEC (5000 stanica po jažici) su inkubirane u 100 ul medija kondicioniranog dobivenih iz različitih vrsta stanica. Nakon 36 sati inkubacije, cjevaste strukture su fotografirane. Svaki uvjet test je ocijeniti u četverostrukim određivanja od tri odvojena pokusa. Slike su snimljene Cannon Snaga Shot A640 fotoaparat Olympus obrnutoj mikroskop sa 100 × povećanja; duljina cijevi se kvantificira korištenjem IPP (verzija 6.0, Media Kibernetika, Silver Spring, MD). pregled kože leđa puta komora Model pregled Ispitivanja su provedena u skladu s protokolom je odobrena od strane njega životinja i uporaba odbor Sveučilišta u Pekingu (etički odobrenja zahtjev broj broj J201155). in vivo modelima sa i Imunohistokem pregled atimičnih golih miševa su randomizirani u različitim skupinama (n = 6 po skupini). Miševi su supkutano u donji stražnji bok s ljudskom BGC-P, BGC-EV, BGC-SP ili HGC-EP, HGC-EV, HGC-SH stanicama (2 × 10 6 stanica po mišu). Rast tumora praćen je palpacijom na mjestu inokulacije.
i in vivo pregled. Pregled
i dorzalni modela komore kožnog nabora in vivo pregled. Kvantitativna real-time PCR i Western blot provedeni su to otkriti ako se izrazi VEGF i MMP-7 su modulirana SPARC izražavanja. Kako bi se dodatno utvrditi učinak SPARC izražavanja na angiogenezu in vivo pregled, osnovane su modelima stranog tijela i gustoća mikropora (MVD) različitih klonova su otkrivene imunohistokemijski. Pregled
Zaključak pregled
i In vivo
od stabilno transfekcijom MMP-7-shRNA u HGC-SH stanicama. Slika 4A pokazuje da ekspresija MMP-7, HGC-sh + MMP7-sh stanica podregulira stabilno eksprimiraju MMP-7-sh-RNA na razinu koja je usporediva s onom HGC-P i HGC-EV stanica. Za rasvijetliti ulogu MMP-7 u knock-down SPARC-posredovane promociji tumorske angiogeneze stanica induciranu, proveli smo analizu nastajanje kapilara s uvjetovanim medijima HGC-sh stanica i HGC-sh + MMP7-sh stanica. Kao što je prikazano na slici 4B, rezultati pokazuju da je smanjen MMP-7 ekspresije u HGC-sh + MMP7-sh stanica je rezultirala je značajno smanjio nastajanje kapilara od HUVEC in vitro pregled (HGC-sh + MMP7-sh vs pregled HGC-sh, p '. 0.05) pregled
HGC-sh, P < 0.05 Slika 4B). nastajanje kapilara od HUVEC je gotovo u potpunosti inhibira kada se uzgajaju u kondicioniranom mediju HGC-sh + MMP7-SH stanicama plus dodatnu VEGF neutralizirajuće antitijelo ( vs pregled HGC-sh, P < 0.05 Slika 4B). pregled
[20]. Ovi rezultati potvrđuju SPARC kao inhibitora angiogeneze tumora in vivo pregled. Pregled
postupci bili u skladu sa preporukama u Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja iz National Institutes of Health. Atimičnih golih miševa (6 tjedana starih ženki, 26-28 g, n = 3 po skupini) uzgojeni su i održavani unutar klica okoliša. Tehnika implantacija je ranije [11] što je opisano. Leđna zrak sac je napravljen u miša ubrizgavanjem 10 ml zraka supkutano nakon što je životinja bila potpuno anestezira. Difuzije komore (Millipore, Bedford, MA, USA) su pripremljeni tako da poravnate 0,45 mm Millipore membrana na obje strane ruba "O" prsten s cementom. BGC-P, BGC-EV i BGC-SP; HGC-P, HGC-EV ili HGC-SH stanicama (1 × 10 6) suspendirane u PBS se injektira u komoru. 2 cm dugi rez je napravljen vodoravno uz rub zraka vreće leđnoj strani, i komore su postavljene pod kožu. Miševi su žrtvovani 10 dana kasnije. Životinje su pažljivo kože oko implantiranih komora. U naborima kože pokrivaju komore su fotografirane pod vidljive svjetlosti. Broj krvnih žila se broje. Pregled
Što je ERCP?
Crijevni mikrobiom mijenja se kuhanjem biljne hrane,
Veliko istraživanje pokazalo je da je SARS-CoV-2 virusno opterećenje najniže u djece
Prisutnost određene crijevne bakterije u majki mogla bi zaštititi bebe od alergija na hranu
Studija opisuje početnu bazu zdravih crijevnih mikrobioma i profil obilja
Teške komplikacije COVID-19 povezane s rušenjem crijevne barijere
Nova strategija može ojačati komunikaciju crijeva i mozga
Komunikacijski sustav između crijeva i mozga poznat je kao osovina crijeva i mozga i dobro je uspostavljen. Sada, znanstvenici su razvili strategiju koja povećava volumen komunikacije crijeva i tijela
Istraživanja pokazuju da invazije crijevnih parazita smanjuju ozbiljnost COVID-19
Svaki dan učimo više o bolesti COVID-19. Odrasle osobe bilo koje dobi s određenim temeljnim medicinskim stanjima izložene su povećanom riziku od teške bolesti uzrokovane virusom COVID-19. COVID-19,
Istraživanja pokazuju da probiotici mogu pomoći u borbi protiv anksioznosti i depresije
Prethodna istraživanja povezivala su probleme mentalnog zdravlja i razvojne poremećaje sa zdravljem crijeva. Sada, tim britanskih znanstvenika pokazao je da hrana koja proširuje profil korisnih bakter