PLoS ONE: erittyvän proteiinin Hapan ja Runsaasti kysteiiniä (SPARC) Estää angiogeneesin Down-ekspressiota sääteleviä VEGF ja MMP-7 mahasyövän

tiivistelmä

Background

erittyvän proteiinin happamien ja runsaasti kysteiiniä (SPARC) on glykoproteiini, joka toimii angiogeneesin estämiseen, leviämisen ja invaasion eri syöpätyyppien. Kyky SPARC moduloida uudissuonittuminen uskotaan välittyvän osittain sen kyvystä moduloida ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja matriksin metalloproteinaasien (MMP: t). Tässä tutkimuksessa pyrittiin määrittämään vaikutuksen SPARC ilmaisun mahalaukun syöpäsolujen proliferaatioon ja angiogeneesiin in vitro
ja in vivo
.

Menetelmä

arvioitiin ilmentymistä SPARC seitsemässä ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Sitten loimme pysyvästi transfektoitu SPARC yli-ilmentynyt solulinjassa (BGC-SP) sekä stabiilisti transfektoiduista SPARC knock-down solulinja (HGC-sh). Vaikutus SPARC yli-ilmentymisen ja SPARC hiljentäminen tutkittiin tutkimalla kapillaarisen muodostuminen HUVEC in vitro
ja selkä Nahkapoimun kammio malli in vivo
. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ja western blotting tehtiin havaita, jos ilmaisut VEGF ja MMP-7 oli moduloitu SPARC ilme. Edelleen vaikutuksen määrittämiseksi SPARC ilmaisun angiogeneesistä in vivo
, ksenograftimalleja perustettiin ja mikroverisuonitiheys (MVD) eri kloonien havaittiin immunohistokemiallisesti.

Tulokset

endogeeninen SPARC yli-ilmentyminen inhiboi VEGF: n ilmentymistä ja MMP-7, sekä indusoiman angiogeneesin BGC-SP-soluissa. Vastaavasti, SPARC hiljentäminen lisäsi VEGF: n ilmentymistä ja MMP-7, sekä indusoiman angiogeneesin HGC-sh-soluja. Kohonnut indusoiman angiogeneesin SPARC hiljentäminen in HGC-sh soluissa todettu heikentyvän, kun VEGF neutraloitiin vasta-aineita ja MMP-7, joka pudotettiin in vitro
.

Johtopäätös

SPARC tukahduttaa angiogeneesiä mahalaukun syövän alaspäin säätäminen ilmentymisen VEGF ja MMP-7.

Citation: Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) erittyvän proteiinin Happamat ja Runsaasti kysteiiniä (SPARC) Estää angiogeneesin Down-ekspressiota sääteleviä VEGF ja MMP-7 mahasyövän. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618

Editor: Rajesh Mohanraj, UAE University, Arabiemiirikunnat

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 06 elokuu 2012; Julkaistu: 05 syyskuu 2012

Copyright: © Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Natural Science Foundation of China (nro 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

joukossa syöpään liittyvien kuolemien, mahasyöpä toisella sijalla maailmanlaajuisesti keuhkosyövän jälkeen; Lähes kaksi kolmasosaa tapauksista tapahtuu kehitysmaissa, mukaan lukien 42% Kiinasta [1]. Angiogeneesi on kriittinen prosessi mahasyövän; siksi, sääntely- ja molekyylejä, jotka moduloivat angiogeneesiä ovat tulossa painopiste olevaan tutkimukseen. Angiogeneesi ei ole aktiivinen prosessi itsessään; se ohjaa eräät angiogeenisten tekijöiden ja jotkut angiogeneesin estäjiä.

erittyvän proteiinin happamien ja runsaasti kysteiiniä (SPARC), joka tunnetaan myös osteonektiini tai BM-40, on monipuolinen eritetty glykoproteiini, joka ilmaistaan monia erilaisia ​​soluja ja liittyy luun muodostumista, fibroosi ja kudosten korjaamiseen.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että SPARC moduloi proliferaatiota, apoptoosin, invaasion ja angiogeneesin eri tyyppisiä syöpäsoluja, mutta rooli SPARC vuonna tuumorigeneesiä on monimutkainen ja näyttää olevan solutyyppispesifisten koska sen erilaisia ​​toimintoja tietyssä mikro-ympäristö [2]. SPARC toimii tuumorisuppressori rinta-, neuroblastooma, haimasyöpä, munasarja- ja keuhkosyövistä [3]. Munasarjasyövän SPARC-null hiiret kasvoi merkittävästi suurempi kuin villityypin eläimiä lisätyn tasoa verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja matriisi (MMP) [4]. Tukahduttamaan kasvaimen verisuonitus kautta tukahduttamista VEGF ilmaisun ja erittymisen, SPARC esti gliooma kasvuun [5]. SPARC sitoutuu VEGF, estäen siten VEGFR fosforylaation, mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) aktivointi ja VEGF: n indusoiman DNA-synteesin [6]. Kuitenkin rooli SPARC angiogeneesissä on myös solutyyppispesifisten, mikä muuttaa signaalitransduktiotapahtumien vastauksena ainutlaatuinen solun ympäristöihin [7].

VEGF stimuloi angiogeneesiä, ja on tärkein signaalin tuottama proteiini solujen [8]. MMP tärkeitä rooleja kasvainten kehittymiseen, paitsi hajottamiseen soluväliaineen mutta myös sääntelyyn angiogeneesiä. MMP-7, joka on pienin molekyylipaino kaikki MMP perheenjäsenten on osoitettu nopeuttavan leviämisen ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC), annoksesta riippuvalla tavalla in vitro
[9].

päätehtävä SPARC angiogeneesissä mahasyövän solulinjojen jää epäselväksi. Siksi tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että SPARC saattavat moduloida lisääntymistä ja angiogeneesin säätelemällä VEGF ja MMP-7 ilmaisuja mahalaukun syöpäsoluja. Testata näitä hypoteeseja, testasimme ilmentyminen SPARC seitsemässä mahasyövässä solulinjoissa. Sitten vaikutusten arvioimiseksi muuttuneen SPARC mahalaukun syöpäsolujen perustimme BGC-SP-klooni, joka yli-ilmennetään SPARC ja HGC-sh klooni, jossa endogeeninen SPARC pudotettiin.

Tulokset

ilmentäminen SPARC vuonna Viljellyt mahasyöpä Syöpäsolut

arvioitiin ilmentymistä SPARC useissa ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Western blotting osoitti, että SPARC oli undectable vuonna AGS, MKN45, NCI-N87 ja BGC-823 solulinjoissa, mutta SGC-7901 solulinja ilmaistuna alhainen SPARC ja HGC-27, MGC-803 solulinjat ilmensivät korkeaa SPARC ( Kuva 1A).

yliekspressio ja esto Endogeenisen SPARC mahasyövän Solulinjat

Western blotting osoitti, että 43 kDa: n vyöhyke, joka vastaa SPARC-proteiinin määrä oli lisääntynyt BGC-SP (BGC solut ilmentävät SPARC cDNA-solut) verrattuna emo (BGC-P) ja valvonta-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC estyi lähes kaksi kolmasosaa HGC-sh-solut (HGC soluja, jotka ilmentävät SPARC-shRNA) verrattuna HGC-P ja HGC-EV-solujen (P < 0,05, kuvio 1 B). RT-PCR osoitti, että SPARC mRNA: n ekspression BGC-SP-soluissa lisääntyi verrattuna BGC-P ja BGC-EV-solujen (P < 0,05); SPARC mRNA: n ekspression HGC-sh laski lähes 80% verrattuna HGC-P ja HGC-EV-solujen (P < 0,05, kuvio 1 B).

SPARC yliekspressio Vähennykset leviämisen mahasyövän Cell Lines

Voit selvittää muuttunut SPARC ilmaisu vaikutti leviämisen mahasyövän solulinjojen kasvua transfektoituja soluja verrattiin vanhempien ja tyhjän vektorin valvontaa. Tiedot osoittivat, että kasvu BGC-SP-soluissa estyi verrattuna BGC-P ja BGC-EV-solujen kuluttua 8 päivän viljelyn (P < 0,05); kasvu HGC-sh soluissa lisääntyi hieman HGC-P ja HGC-EV-solujen (P < 0,05, kuvio 1C).

SPARC yli-ilmentyminen mahasyövän Solulinjat Vähentää Angiogeneesi in vitro
ja in vivo

ymmärtää vaikutuksen muuttuneen SPARC ilmentymisen angiogeneesiä mahasyövässä solulinjoissa, HUVEC inkuboitiin elatusaineessa. BGC-SP supernatantin indusoiman HUVEC erilaistumaan kapillaarimaisen rakenteet 36 h (2564,5 ± 553,1 um, P < 0,05) ja vähemmässä määrin kuin supernatantti BGC-EV-soluja (5002,4 ± 665,7 um) ja BGC-P-soluissa (5417,3 ± 784,25 um, kuvio 2A). HGC-sh supernatantin indusoiman HUVEC erilaistumaan kapillaarimaisen rakenteet 36 h (7024,9 ± 923,1 pm, P < 0,05) vahvempi määrin kuin supernatantti HGC-EV-solut (4456,2 ± 554,2 um) ja HGC-P-solujen (4023,4 ± 665,2 um, kuvio 2A). Kvantifiointi keskimääräisestä putken pituus osoitti, että putken pituus HUVEC kunnostetussa mediaa BGC-SP pieneni noin 52,7% verrattuna kontrolli soluihin; putken pituus HUVEC kunnostetussa mediaa HGC-sh kloonien lisääntyi 74,6% verrattuna kontrolli soluja (kuvio 2A).

selkä ikkuna malli osoitti, että BGC-SP-soluissa oli 40,4%: n lasku tumour- aiheuttama mikrosuonten verrattuna säätökennoja (P < 0,05). HGC-sh solujen selän ihon-kertainen kammion johti 73,2% kasvaimen aiheuttama mikrosuonten, jossa on suurempi määrä pieniä verenvuodon kohdetta verrattuna kontrollisolujen (P < 0,05 kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että SPARC yli-ilmentymisen mahasyövässä esti angiogeneesiä in vitro
ja in vivo
.

Euroopan MAPK merkinanto Pathway ja ilmentäminen VEGF ja MMP-7 estyy by SPARC yliekspressio

vaikutuksen määrittämiseksi SPARC ilmentymisen vaikutus MMP-7: n ja VEGF, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ja western blotting määritykset suoritettiin. Tulokset osoittivat, että MMP-7: n ja VEGF-ilmentyminen säätelee negatiivisesti SPARC ilme. In BGC-SP-soluja, MMP-7-mRNA: n, MMP-7-proteiinia, VEGF-mRNA: n ja VEGF-proteiinin inhiboi 87,2%, 68,9%, 48,4%, ja 58,6%, vastaavasti, verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoituja soluja. In HGC-sh soluissa MMP-7-mRNA taso nousi 11,6-kertaiseksi, MMP-7-proteiinin taso nousi 8,1-kertaiseksi, VEGF mRNA taso nousi 8,8-kertaiseksi, ja VEGF-proteiinin taso nousi 3,2-kertaiseksi verrattuna tyhjä vektori soluja (kuvio 3A, B). Sen määrittämiseksi, oliko MAPK signalointireitille säänneltiin SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 ja p-38 tasot arvioitiin western blottauksella. Tulokset osoittivat, että tasot p-ERK1 /2 olivat merkittävästi vähentyneet BGC-SP-soluissa ja koholla HGC-sh soluissa verrattuna niiden ohjaus soluja (kuvio 3C).

Knock-down SPARC Expression in HGC-27 Cells edistää angiogeneesiä kautta Up-säänneltyjen VEGF ja MMP-7 Expression

sen varmistamiseksi, että angiogeneesiä, joita on esiintynyt vähentynyt SPARC ilme johtuu lisääntyneestä MMP-7: n ja VEGF ilmaisua eikä tasoa SPARC itse, HUVEC inkuboitiin elatusaineessa korjattu HGC-sh solujen eksogeenisen lisätty rekombinanttia ihmisen SPARC (rhSPARC, 0,3 ug /ml). Tuloksemme osoittivat, että lisätään ulkoisten SPARC ei estänyt kapillaari-rakenteita HUVEC: ien verrattuna HGC-sh (kuvio 4), toisin kuin anti-angiogeeninen vaste nähdään endogeenisen ilmentymisen SPARC in BGC823 soluissa (kuvio 2).

edelleen karakterisoimiseksi rooli VEGF: n ja MMP-7: SPARC-välitteisen angiogeneesin modulaatio, MMP-7-shRNA ja 1 ug /ml neutraloivaa VEGF-vasta-(Chemicon, Temacula, CA, USA) käytettiin HGC-sh kloonien antagonisoivat toiminnot MMP-7: n ja VEGF.

tutkittiin kykyä MMP-7 ilmentymisen HGC-sh solujen moduloida angiogeneesiä in vitro
transfektoimalla MMP-7-shRNA osaksi HGC-sh-soluja. Kuvio 4A osoittaa, että MMP-7 HGC-sh + MMP7-sh solujen alas-säädellä jotka ilmentävät pysyvästi MMP-7-sh-RNA tasolle verrattavissa HGC-P ja HGC-EV soluissa. Valaistaan ​​roolin MMP-7 knock-down SPARC-välitteisen edistäminen kasvainsolun aiheuttamaa angiogeneesiä, suoritimme kapillaari muodostumisen analyysi elatusaineen HGC-sh solujen ja HGC-sh + MMP7-sh soluissa. Kuten kuviossa 4B, tulokset osoittavat, että vähentynyt MMP-7 ilmentymisen HGC-sh + MMP7-sh solut johti merkittävästi vähentynyt kapillaarisen muodostusta HUVEC in vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P < 0,05).

Voit selvittää toiminnan kohonnut VEGF ilmaisun aiheuttama SPARC hiljentäminen, VEGF ilmastoituna tiedotusvälineet HGC-sh ja HGC-sh + MMP7-sh solut neutraloitiin VEGF-vasta-aineen (1 ug /ml). Tulokset osoittivat, että kapillaarinen muodostuminen HUVEC väheni merkittävästi HGC-sh sisältävä supernatantti VEGF neutraloivan vasta-aineen verrattuna supernatanttia HGC-sh pelkät solut (HGC-sh + anti-VEGF vs
HGC-sh, P < 0,05 kuvio 4B). Capillary muodostuminen HUVEC oli estää lähes täysin, kun viljellään elatusaineessa on HGC-sh + MMP7-sh soluissa sekä lisättyä VEGF neutraloivan vasta-aineen ( vs
HGC-sh, P < 0,05 kuvio 4B).

seerumivapaa media korjattu HGC-P, HGC-EV, HGC-sh kanssa tai ilman rhSPARC (0,3 ug /ml) ja HGC-sh + MMP7-sh solut konsentroitiin ultrasuodatuksella putki (Millipore, Bedford, MA , USA) samoissa olosuhteissa. Western blotting osoitti, että pitoisuus SPARC in HGC-sh-soluja 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium oli sama kuin HGC-P supernatantti (kuvio 4A).

yli-ilmentyminen SPARC mahasyövän Solut Estää Tumourigenicity nude-hiirissä

arvioimiseksi terapeuttista tehoa SPARC ilmaisun, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP soluja tai HGC-P, HGC-EV, HGC-sh solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin. Ei ollut merkitsevää eroa kooltaan BGC-P (n = 6; kasvaimen tilavuus = 2004 ± 63 mm ^{3), BGC-EV (n = 6; kasvaimen tilavuus = 1856 ± 69 mm 3 ) ksenograftit. Merkittävä vähennys (39,1%) keskimääräisen kasvaimen todettiin eläimillä istutettu BGC-SP ksenografteissa (n = 6; kasvaimen tilavuus = 1130 ± 55 mm 3) verrattuna eläimiin istutettiin BGC-EV ksenografteja ( P < 0,05, kuva 5). Ei ollut merkitsevää eroa kooltaan HGC-P (n = 6; kasvaimen tilavuus = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; kasvaimen tilavuus = 1708 ± 82 mm 3 ) ksenograftit. Merkittävä lisäys (50,3%) keskimääräisen kasvaimen todettiin eläimillä istutettu HGC-sh ksenografteissa (n = 6; kasvaimen tilavuus = 2412 ± 75 mm 3) verrattuna eläimiin istutettiin HGC-EV ksenografteja ( P < 0,05, kuva 5).}

arvioimiseksi SPARC, VEGF, MMP-7 ilmaisuja in vivo
, ksenografti leikkeet värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella ihmisen SPARC, VEGF tai MMP-7 . Kuvio 5A osoittaa, että BGC-SP kasvaimia ilmaista enemmän SPARC kuin BGC-P, BGC-EV kasvaimia, kun taas samanaikaisesti VEGF, MMP-7 ilmaisuja väheni (P < 0,05, kuvio 5A). Palasia HGC-sh kasvaimia ilmaista vähemmän SPARC kuin HGC-P, HGC-EV kasvaimet taas samanaikaisesti VEGF, MMP-7 ilmaisuja lisääntynyt (P < 0,05, kuvio 5A). CD31 käytetään ensisijaisesti osoittamaan läsnäolon verisuonten endoteelisolujen histologisia kudosleikkeissä, jonka avulla voidaan arvioida, missä määrin kasvaimen angiogeneesiä. Sen arvioimiseksi, onko muuttunut SPARC ilmaisu välitti mikroverisuonitiheys (MVD), analysoimme angiogeneesi ksenografteissa histologiset analyysi CD-31. Ei ollut mitään merkittävää eroa MVD välillä BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrosuonten /0,145 mm ^{2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 mikrosuonten /0,145 mm 2) ksenograftit. MVD pieneni 54,8% vuonna BGC-SP (5,2 ± 2,1 mikrosuonten per /mm 2) kasvaimissa verrattuna BGC-EV kasvaimet (P < 0,05, kuva 5). Ei ollut mitään merkittävää eroa MVD välillä HGC-P (6,4 ± 2,1 mikrosuonten /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 mikrosuonten /0,145 mm 2) ksenograftit. MVD kohosi 51,7% vuonna HGC-sh (10,5 ± 1,5 mikrosuonten /0,145 mm 2) kasvaimissa verrattuna HGC-EV kasvaimet (P < 0,05, kuva 5).}

Keskustelu

SPARC on kudosspesifinen proteiini, joka vaikuttaa useiden solujen prosesseja, kuten solujen lisääntymisen, invaasio ja angiogeneesi vaihtelevasti erilaisissa kudoksissa. Esimerkiksi aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että SPARC edistää hyökkäys, kun samanaikaisesti estämällä kasvainten kasvua [5], [10]. Vuonna medulloblastooma, yliekspressio SPARC voi estää angiogeneesiä kasvaimen alentamalla ilmentymisen ja erittymisen VEGF: n ja MMP-9 [11]. Melanooma, mutta ilmentyminen SPARC korreloi positiivisesti angiogeneesiä [12]. Funktio SPARC mahalaukun syöpäsoluja jää epäselväksi.

Tutkiakseen roolin SPARC mahasyövän, me testattiin ensin ilmentymistä SPARC seitsemässä solulinjoissa mahasyövän. Useimmat solulinjat ei ilmaissut, vai ainoastaan ​​ilmaistuna alhainen SPARC. Roolin määrittämiseksi SPARC kasvun ja angiogeneesin mahalaukun syövän, loimme BGC-SP-klooni, joka oli stabiilisti transfektoitu SPARC cDNA vektoriin ja HGC-sh-klooni, joka oli stabiilisti transfektoitu shRNA kohdentuvan vektorin SPARC mRNA: ta. SPARC ilmaisu lisääntynyt merkittävästi BGC-SP klooni ja laski HGC-sh klooni verrattuna niiden ohjaus klooneja, määritettynä western blottauksella ja RT-PCR-analyysejä. Solujen lisääntyminen oli matalampi BGC-SP klooni, ja oli suurempi HGC-sh klooni kuin omilla ohjaus klooneja MTT-menetelmällä. Olemme myös havainneet, että yli-ilmentyminen SPARC esti kasvainsolun aiheuttamaa kapillaarinen muodostumista HUVEC in vitro
ja angiogeneesiä selkä ikkunaan määrityksessä in vivo
. Toisaalta, alas-säätely SPARC mRNA häiriö edistää hiussuonten muodostumista in vitro
ja angiogeneesissä in vivo
.

Verisuonet ovat välttämättömiä toimittaa ravintoaineita kudoksiin . Näin ollen, neovaskularisaatio on välttämätön myös kiinteän kasvaimen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että SPARC on rooli angiogeneesissä [7]. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen SPARC esti angiogeneesiä in vitro
ja in vivo
yhdessä lasku MMP-7, VEGF ja fosforyloitu ERK1 /2, kun taas alas-säätely SPARC edistetään angiogeneesi in vitro
ja in vivo
yhdessä kasvu MMP-7, VEGF ja fosforyloitu ERK1 /2.

lisäksi toteutettu tutkimuksia tutkia roolia VEGF ja MMP-7 SPARC-välitteisen angiogeneesin modulaatio. Kun rekombinantti ihmisen SPARC-proteiinia lisättiin väliaine HGC-sh klooni palauttaa SPARC pitoisuus, tämä väliaine ei muuttanut kapillaarinen muodostumista HUVEC mukaan in vitro
määrityksessä verrattuna kapillaarinen muodostumista HUVEC inkuboitiin ehto väliaine ilman eksogeenista rhSPARC. Sitten käytimme MMP-7-shRNA alas-MMP-7 ilmentymisen HGC-sh klooni, ja /tai anti-VEGF-vasta-aineen neutraloimiseksi VEGF kunnostetussa alustassa päässä HGC-sh klooni. Capillary muodostuminen HUVEC estyi merkittävästi, kun ne inkuboidaan elatusaine alemman MMP-7 ja /tai tukossa VEGF. Nämä kokeet viittaavat siihen, että SPARC alassäätöä yksin riitä induktio uudissuonittuminen, ja muita tekijöitä on mukana tässä prosessissa.

VEGF on keskeinen rooli angiogeneesissä, ja on välttämätöntä selviytymisen endoteelisolujen [8]. Vuonna gliooma, SPARC esti kasvaimen kasvua muuttamalla sen mikro-ympäristö ja tukahduttamalla sen angiogeneesin kautta VEGF ilmaisun ja eritystä [5]. Ei voi olla negatiivinen suhde SPARC ja VEGF ilmaisuja, eli enemmän SPARC, sitä vähemmän VEGF tai päinvastoin
[13], [14].

MMP-7 kykenee halventavan tyvikalvon tai sidekudoksen ympärillä alusta. Se stimuloi myös DNA-synteesin viljellyissä verisuonten endoteelisoluissa, ja indusoi angiogeneesiä paikassa, jossa paksusuolen syövän soluja istutettiin hiirimallissa [15]. VEGF: n ja muiden angiogeenisten tekijöiden toimivat pääasiassa MAPK signalointireittejä, joiden uskotaan olevan tärkeitä transduktioreittejä mukana uudissuonittuminen prosesseissa kasvaimissa [8]. Meidän tuore tutkimus osoitti, että MMP-7 ilmentyminen oli mukautettu kautta MAPK signalointipolkujen [16]. Useat tutkimukset osoittivat myös, että SPARC negatiivisesti moduloida MAPK polkuja [17]. Niinpä SPARC ilmentyminen voi muuttaa angiogeenisten tasapaino kasvaimia alaspäin säätäminen joukko uudissuonittumisen edistää tekijöistä.

tutkimiseksi toiminta SPARC säätelyssä mahasyövän kasvun in vivo
, BGC-SP ja HGC-sh solun klooneja verrattiin niiden ohjaus kloonien kykyä muodostaa kasvaimia ihonalaisessa mallissa. SPARC yli-ilmentyminen vähensi koko Ksenosiirretyn kasvaimen pienemmällä MVD, alas-säätely SPARC RNA interferenssin edisti kasvua Ksenosiirretyn kasvaimen lisääntynyt MVD. Siksi mahasyövän ksenografteissa, SPARC ilmentyminen korreloi negatiivisesti angiogeneesiä. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että SPARC osaltaan sääntelyä kasvaimen muodostumisen, vaikka sen rooli tuntui olevan solutyyppispesifisten. Hepatosellulaaristen syöpäsolu-line ksenografteissa, SPARC yli-ilmentyminen merkitsevästi viivästynyt kasvaimen muodostumisen, pienentää kasvaimen kokoa, ja laski MVD verrattuna ohjaus ksenografteissa [18]. Paksusuolen syöpä kudoksissa, SPARC ilmentyminen korreloi negatiivisesti VEGF ilme ja MVD [19]. Vuonna medulloblastooma soluissa, SPARC yliekspressio inhiboi angiogeneesiä, joka johtaa kasvaimen kasvun vähenemiseen [11]. Ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja, SPARC esti DNA-synteesiä in vitro
[6]. Neuroblastoomakasvaimissa ksenografteja, SPARC peptidit estivät angiogeneesiä ja kasvaimen kasvua in vivo
[20]. Nämä tulokset vahvistivat SPARC estäjänä kasvaimen angiogeneesin in vivo
.

SPARC ilmaisee normaaleissa mahan epiteelisoluissa, mahalaukun syövän soluja, ja stroomasoluja, jotka ympäröivät mahasyövän alemmalla tasolla [21 ]. Immunohistokemiallista tutkimus osoitti, että SPARC pääasiassa ilmaistu stroomasoluja, jotka ympäröivät kasvainta [22]. Poikkeamia ei voida täysin selittää. SPARC ilmentyminen saattaa riippua histologinen tyyppi kasvain, tai päinvastoin
. Viimeaikaiset immunohistokemia tutkimuksessa todettiin, että SPARC ilmentyminen korreloi negatiivisesti VEGF: n ilmentymistä ja MVD mahasyövän kudoksissa, ja SPARC ilmentyminen väheni mahasyövän korkeamman asteen maligniteetin [23].

Yhteenvetona kasvun estäminen mahalaukun syövän SPARC näyttää välittyvän kautta tukahduttaminen vaikutuksia MMP-7: n ja VEGF ilmaisuja, jotka puolestaan ​​voivat estää pienten suonten tunkeutumisen kasvaimia. Voimme päätellä, että alas-säätely SPARC voi liittyä edistymistä mahasyövän, ja etsintä, joilla pyritään säätelemään SPARC lauseke voi tulla mielekäs lähestymistapa parantaa mahalaukun syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineita SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (Soluviestintä tekniikka, Danvers, MA, USA), VEGF, ja CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) käytettiin western blottaus ja immunohistokemia. RhSPARC toimitti R &D (Minneapolis, MN, USA). Käänteistranskriptio-PCR kit toimitti Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) käytettiin alaspäin-MMP-7 solussa klooneja. β-kaseiini (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) käytettiin β-kaseiinitsymografialla. Kaikki muut reagenssit olivat analyysilaatua tai parempi.

Cell Culture

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 saatiin Cancer Institute of Kiinan Academy of Medical Science. Kaikki solut kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). BGC-EV (transfektoitu tyhjällä vektorilla), BGC-SP (yliekspressoivia SPARC cDNA), HGC-EV (ilmentävät tyhjän vektorin) ja HGC-sh (ilmentävien SPARC shRNA) kasvatettiin täydellisessä RPMI 1640 G418 (50 ug /ml) . Kaikki soluja pidettiin yksikerrosviljelmissä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO _2.

perustaminen BGC-SP, HGC-sh klooneja ja HGC-sh-MMP7-sh Clones

noin 150000 BGC-823-soluja maljattiin kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Ekvimolaariset määrät pcDNA3.1 täyspitkä SPARC cDNA vektorin tai tyhjän vektorin (Invitrogen, San Diego, CA, USA) inkuboitiin Lipofectamine-2000 Transfection Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validoitu SureSilencing ihmisen SPARC shRNA ja tyhjän kontrollivektorin saatiin SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27-soluja transfektoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, solut transfektoitiin stabiililla tavalla käyttäen lipofektamiinia. Transfektoidut solut valittiin G418: aa (100 ug /ml BGC-SP ja HGC-sh-kloonit) ja 14 päivää ennen eristämistä yksittäisten kloonien. HGC-sh-MMP7-sh variantit luotiin, kuten edellä on kuvattu, HGC-sh kloonin solut transfektoitiin MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) käyttäen lipofektamiinia. Sitten transfektoidut solut valitaan puromysiini (1 ug /ml) ja 10 päivää.

proliferaatiomääritystä

Solujen proliferaatio määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2- yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, 500 solua viljeltiin per kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 8 päivää, ja sitten, MTT: tä (R &D, Minneapolis, MN, USA) lisättiin soluihin. Absorbanssiarvot 550 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla. Tulokset on esitetty keskiarvona absorbanssi 550 nm: ssä, ja välineet (± sd) neljän rinnakkaisen määrityksen kuudesta erillisestä kokeesta.

Western-blottaus-analyysi

Yhteensä solujen lysaatit valmistettiin ja analysoitiin western-blottauksella kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, vasta-aineita SPARC, MMP-7, ja VEGF: n (1:1000 laimennus) käytettiin havaitsemaan SPARC, MMP-7, ja VEGF: n, vastaavasti, kun taas vasta-aineita (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2 ja (p-) p-38 (1:800 laimennus) käytettiin havaitsemaan aktivointi MAPK signalointireitin. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttämällä ECL (Promega, Madison, WI, USA) on Kodak Image Station 4000 mm Pro System (Kodak, Rochester, NY, USA). Tiheys nauhojen kvantifioitiin densitometrinen analyysi käyttäen Image Tool (versio 3.0) järjestelmä.

RT-PCR: llä ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin transfektoitiin stabiilisti kasvainsoluja käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ja käsiteltiin 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa RQ1 DNaasia (Promega, Madison, WI, USA). RNA käänteistranskriboitiin käyttäen AMV Reverse Transcriptase (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) käyttäen GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Käytetyt alukkeet kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR olivat seuraavat: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sense) ja 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisense); ja VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sense) ja 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisense). Alukkeita käytettiin PCR olivat seuraavat: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sense) ja 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisense); ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sense) ja 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisense).

β-kaseiinin Zymografia

funktionaalinen aktiivisuus MMP-7 arvioitiin β-kaseiinitsymografialla 10% polyakryyliamidigeeleillä upotettu 1 mg /ml β-kaseiini. Yhtä suuret määrät seerumittomassa elatusaine soluista, joita kasvatettiin 24 tunnin ajan suoritettiin elektroforeesi. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 2,5% Triton X-100 tunnin ajan SDS: n poistamiseksi. Sitten geelejä inkuboitiin 18 tuntia 37 ° C: ssa 50 mM Tris /HCI: ää, joka sisälsi 10 mM CaCl _{2 ja 0,02% NaN 3, värjättiin Coomassie brilliant blue ja sitten väri poistettiin. Proteolyyttistä toimintoa latentin MMP-7 ja aktivoitu MMP-7 osoituksena kuten bändejä molekyyli- massat 28 ja 19 kDa, vastaavasti.}

Pakattu Media Collection kokeiluihin

Yhteensä 2 x 10 ^{5 solua HGC-P, BGC-P tai niitä vastaavat stabiilisti transfektoidut kloonit ympättiin ja inkuboitiin täydellisessä RPMI 1640 6-kuoppaisiin kammio dioja ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Sen jälkeen elatusaine kerättiin, merkitty ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten.}

endoteelisolujen Capillary kaltainen Putken muodostumisen määritys

vaikutuksen tutkimiseksi SPARC on vuonna vitro
angiogeneesi, kapillaarin muodostumisen määritys suoritettiin. Tässä määrityksessä matrigeeliä pipetoitiin esijäähdytettyyn 96-kuoppaisille levyille (75 pl matrigeeliä per kuoppa) ja polymeroidaan 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sen määrittämiseksi, onko muuttunut SPARC ilmentyminen säädellä angiogeneesiä, HUVEC-soluja (5000 solua per kuoppa) inkuboitiin 100 ul: ssa elatusaine kerättiin eri soluja. 36 tunnin inkubaation putkirakenteilla valokuvattiin. Kukin määritys ehto arvioitiin neljänä määrityksissä kolmesta erillisestä kokeesta. Kuvat otettiin käyttäen Cannon PowerShot A640 kamera Olympus käänteismikroskooppi kanssa 100-kertainen suurennus; Putken pituus kvantifioitiin käyttämällä IPP (versio 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Dorsal Skin-kertainen jaosto Model

Tutkimukset suoritettiin protokollan mukaan hyväksymän animal Care ja käyttö komitean Pekingin yliopisto (eettiset sovellus hyväksymisnumero nro J201155). in vivo
menettelyt olivat noudattaen suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kateenkorvattomiin karvattomia hiiriä (6 viikon ikäisiä, naispuolinen, 26-28 g, n = 3 per ryhmä) oli kasvatettu ja ylläpidetty sisällä alkio-vapaassa ympäristössä. Implantaation tekniikkaa on kuvattu aiemmin [11]. Selkä Ilmapussi tehtiin hiiren injektoimalla 10 ml ilmaa ihonalaisesti kun eläin nukutettiin kokonaan. Diffuusiokammiot (Millipore, Bedford, MA, USA) valmistettiin kohdistamalla 0,45 mm Millipore kalvojen molemmille puolille vannetta O-rengas sementillä. BGC-P, BGC-EV ja BGC-SP; HGC-P, HGC-EV tai HGC-sh-solut (1 x 10 ^{6) suspendoitiin PBS: ään injektoitiin kammioon. A2 cm pitkä viilto tehtiin vaakasuoraan reunaan selkä Ilmapussi, ja kammiot sijoitettiin ihon alle. Hiiret lopetettiin 10 päivää myöhemmin. Eläimiä huolellisesti nyljetty ympärille istutettu kammiot. Ihon poimut kattaa kammiot valokuvattiin alla näkyvää valoa. Lukumäärä verisuonten laskettiin.}

ksenograftimalleja ja immunohistokemia

kateenkorvattomia nude-hiiriä satunnaistettiin eri ryhmiin (n = 6 ryhmää kohti). Hiiriin istutettiin ihonalaisesti alempaan taka kylki ihmisen BGC-P, BGC-EV, BGC-SP tai HGC-EP, HGC-EV, HGC-sh soluja (2 x 10 ^{6 solua hiirtä kohti). Kasvaimen kasvua seurattiin tunnustelu on inokulaatiopaikalla.}

• PLoS ONE: paljastuu Molecular mekanismi mahasyövän Marker anneksiini A4 Cancer Cell Proliferation käyttäminen eksoni Arrays
• PLoS ONE: Functional Pstl /RsaUlä polymorfismi CYP2E1 liittyy Development, Progression ja huono tulos Mahalaukun Cancer