PLoS Genetics: Onkogene Pathway Kombinationen Predict klinische Prognose in Gastric Cancer

Abstrakt

Viele soliden Tumoren einen hohen Grad an Heterogenität in ihrer Deregulierung verschiedener onkogenen Wege aufweisen, sind bekannt. Wir suchten wichtigsten onkogenen Wege bei Magenkrebs (GC) mit signifikanten Beziehungen das Überleben des Patienten zu identifizieren. Mit Genexpression Signaturen, entwickelten wir eine in silico
Strategie in 301 primären Magen-Krebs-Muster von onkogenen Stoffwechselwegaktivierung auf der Karte, die zweithäufigste Ursache für globale Krebssterblichkeit. Wir identifizierten drei onkogenen Wege (Proliferation /Stammzell, NF-kappaB und Wnt /β-Catenin) in der Mehrzahl dereguliert (> 70%) von Magenkrebs. Wir funktionell diese Weg Vorhersagen in einem Panel von Magenkrebs-Zelllinien validiert. Stratifizierung von Patienten durch onkogene Weg Kombinationen zeigten reproduzierbare und signifikante Unterschiede Überleben in mehreren Kohorten, was darauf hindeutet, dass Weg-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle Verhalten bei der Beeinflussung der Erkrankung spielen. Einzelne GCs können erfolgreich durch onkogene Signalweg-Aktivität in biologisch und klinisch relevante Untergruppen taxonomized werden. Die Vorhersage Signalweg-Aktivität durch Expression Signaturen ermöglicht somit die Untersuchung von mehreren krebsbedingte Wege gleichzeitig in Primärtumoren im Maßstab derzeit nicht erreichbar von anderen Plattformen zu interagieren.

Autor Zusammenfassung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache für globale Krebssterblichkeit. Mit den derzeitigen Behandlungen, weniger als ein Viertel der Patienten überleben länger als fünf Jahre nach der Operation. Einzelne Magenkrebs sind sehr unterschiedliche in ihrer zellulären Eigenschaften und Reaktionen auf Standard-Chemotherapeutika, Magenkrebs eine komplexe Krankheit zu machen. Pathway basierte Ansätze, anstatt einzelne Gen-Studien können helfen, diese Komplexität zu entwirren. Hier nutzen wir eine rechnerische Ansatz Verbindungen zwischen molekularen Wege und Krebsprofile zu identifizieren. In einer groß angelegte Studie von mehr als 300 Patienten identifizierten wir Untergruppen von Magenkrebs unterscheiden sich durch ihre Muster der molekularen Wege fahren. Wir zeigen, dass diese identifizierten Untergruppen klinisch relevanten Überlebensdauer bei der Vorhersage und kann in der Leitung der Wahl von gezielten Therapien entwickelt, um stören diese molekularen Wege als nützlich erweisen. Wir haben auch spezifische Magenkrebszelllinien spiegeln diese Bahn Untergruppen identifiziert, die für die präklinische Bewertung der Antworten auf gezielte Therapien in jeder Untergruppe erleichtern sollte

Citation. Ooi CH, Ivanova T, Wu J, Lee M, Tan IB, Tao J, et al. (2009) Onkogene Pathway Kombinationen Predict klinische Prognose bei Magenkrebs. PLoS Genet 5 (10): e1000676. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000676

Editor: Jason G. Mezey, Cornell University, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 22. April 2009; Akzeptierte vom 3. September 2009; Veröffentlicht: 2. Oktober 2009

© 2009 Ooi et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch Zuschüsse zu PT von BMRC 05/1/31/19/423, Singapur Cancer Syndicate SCS-BS0001, unterstützt wurde gewähren NMRC TCR /001/2007, und ein Duke-NUS Kern Zuschuss. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die zweithäufigste Ursache der globalen Krebssterblichkeit [1]. Besonders weit verbreitet in Asien, sind die meisten GC Patienten mit fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung diagnostiziert [2]. Deregulation der kanonischen onkogenen Wege wie E2F, K-ras, p53 und Wnt /β-Catenin-Signalisierung sind dafür bekannt, mit unterschiedlichen Frequenzen in GC auftreten [3] - [6], das anzeigt, dass ein GC molekular heterogene Krankheit. Frühere Studien GC Vielfalt in primären Tumoren zu beschreiben haben in der Regel auf einzelne Wege konzentriert, nur eine oder wenige Biomarker pro Experiment Messung [4], [6], [7]. Im Gegensatz dazu zeigt experimentelle Hinweise darauf, dass die meisten Krebs Phänotypen (unkontrolliertes Wachstum, Resistenz gegen Apoptose, usw.) sind weitgehend beherrscht nicht nur durch einzelne Bahnen, sondern komplexe Wechselwirkungen zwischen mehreren pro- und anti-onkogene Signalschaltungen [8]. Eingrenzen diese Lücke zwischen den klinischen und experimentellen Arenen werden Strategien erfordern, geeignet zum Messen und im Zusammenhang Aktivitätsmuster von mehreren onkogenen Wege gleichzeitig in Primärtumoren.

Frühere Studien haben unter Verwendung von Genexpressionssignaturen vorgeschlagen, um die Aktivität von onkogenen Wege zur Vorhersage in Krebserkrankungen [9] - hier haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Muster der onkogenen Stoffwechselwegaktivierung verwendet werden könnte, um eine genomische Taxonomie von GC zu entwickeln. Wichtig ist, dass dieser Weg zentrierte Strategie im Wesentlichen aus früheren Microarray-Studien unterscheidet assoziiert Ausdruck beschreibt, ändert sich mit morphologischen und Gewebetyp Unterschiede in GC [10], [11], als Weg Signaturen (und nicht einzelne Gene) als Grundlage für die Krebs Klassifikation verwendet . Wir entwickelten ein in silico
Methode Aktivierung Niveaus verschiedener Wege in Kohorten von komplexen primären Tumorprofile und validiert diesen Weg gerichtete Klassifizierungsansatz zur Karte unter Verwendung von Proof-of-Concept-Beispiele von Brustkrebs. Wir wendeten dann dieses Verfahren auf GC elf onkogenen Wege zu bewerten zuvor in Magen Karzinogenese beteiligt [3] - [7], [12] - [17]. Insgesamt analysierten wir mehr als 300 primäre aus drei unabhängigen Patientengruppen abgeleitet GCs, nach bestem Wissen und Gewissen von GC bisher die größte Genomanalyse durchführen. Wir identifizierten drei onkogenen Wege (nuclear factor-kappaB (NF-kappaB), Wnt /β-Catenin und Proliferation /Stammzelle), die in der überwiegenden Mehrheit dereguliert wurden (> 70%) von GCs und funktionell den Weg Vorhersagen validiert in-vitro-
unter Verwendung einer Gruppe von GC-Zelllinien. Obwohl zur Stratifizierung von Patienten auf der Ebene der einzelnen Bahnen gescheitert konsequent signifikanten Unterschiede in der klinischen Ergebnisse, Stratifizierung von Patienten durch onkogene Weg Kombinationen (zB hohe Proliferation /hohe NF-kappaB gegen niedrige Proliferation /low NF-kappaB) zeigte Unterschiede reproduzierbare und signifikante Überleben zeigen in mehreren unabhängigen Patientenkohorten, was darauf hindeutet, eine entscheidende Rolle für die Wegekombinationen in GC klinischen Verhalten zu beeinflussen. Unsere Ergebnisse zeigen somit, dass GCs erfolgreich Aktivität mit onkogenen Weg in biologisch taxonomized werden, funktionell und klinisch relevanten Subtypen.

Ergebnisse |

Die Vorhersage Stoffwechselwegaktivierung in Krebs-Gen-Expressionsprofile

Unsere Strategie für umfasst vier Schritte in Krebs Ebenen der onkogenen Stoffwechselwegaktivierung die Vorhersage (1A). Erstens haben wir definiert "Weg Signaturen" - Gruppen von Genen veränderte Expression nach funktionellen Störung eines bestimmten Weges in einem wohldefinierten Aussteller in vitro oder in in vivo
experimentellen System. Zweitens abgebildet wir die Bahn Signaturen auf Genexpressionsprofile aus einer heterogenen Reihe von Krebserkrankungen. Drittens wurden zu einzelnen Krebsarten von der Stärke des Zusammenschlusses mit der Bahn Signatur basierend zugewiesen einen nichtparametrischer, Rang-basierte Pattern-Matching Verfahren, Aktivierung Partituren verwenden. Schließlich wurden die einzelnen Krebsarten auf ihre Stoffwechselwegaktivierung Scores basierend sortiert.

Vor diesem Ansatz GC Anwendung, hielten wir es für wichtig, dies zu bestätigen in silico
Strategie in einer Reihe von Proof-of -Prinzip Experimente. Wir entschieden uns für das Beispiel von Brustkrebs, eine Malignität, für die es genügend Beweise für Weg Heterogenität und diskreten "molekularen Subtypen" [18]. Um diese Überprüfung durchführen, fragten wir zuerst, wenn zuvor beschriebenen Weg Signaturen mit eingeschränkter Östrogen-Signalisierung verbunden sind, könnten verwendet werden, um Brustkrebs-Zelllinien die eine hohe Mengen an Östrogen-Rezeptor (ER) Aktivität zu identifizieren. Wir analysierten eine Genexpression Panel von 51 Brust Linien Krebszelle ursprünglich in Neve bei al. [18] mit einem 11-Gen "Tamoxifen Empfindlichkeit 'Pathway Signatur abgeleitet aus einer Liste von Genen differentiell exprimierten zwischen Maca 3366, ein tamoxifen empfindlichen humanen Mammakarzinoms Xenotransplantat und Maca 3366 /TAM, einer Tamoxifen-resistenten Sublinie des gleichen Xenotransplantat [19]. Wir fanden heraus, dass Brustkrebs-Zelllinien positiv mit der Tamoxifen-Empfindlichkeit Signatur zugeordnet zeigten signifikant höhere Expression von ESR1
, die Östrogen-Rezeptor und molekulare Ziel von Tamoxifen, im Vergleich zu Linien zeigt negativen Stoffwechselwegaktivierung Scores (p = 2,12 × 10 ^{-7, Genauigkeit 84,3%, Sensitivität 100%, Spezifität 75%) (Abbildung 1B und Tabelle S1).}

Zweitens haben wir mit Östrogen, wenn ein Weg Signatur getestet Signalisierung aber aus nicht abgeleitet Brustgewebe könnte auch die gleiche Gruppe von Brustkrebszelllinien zu schichten verwendet werden. Wir abgefragt, um die Zelllinie Panel Brustkrebs mit einer 41-Gen "Östrogen-Antwort 'Signatur abgeleitet aus einer Liste von Genen, die durch Östradiol upregulated in U2OS menschlichen Osteosarkom-Zellen [20]. Trotz der Unterschrift von einem anderen Gewebetyp Ursprung (zB Osteosarkom), sobald wir wieder gefunden, dass, wenn sortiert auf der Grundlage ihrer vorhergesagten Östrogen Ansprechbarkeit, Brustkrebs-Zelllinien zusammen gruppiert nach ihrem Niveau von ESR1
(Östrogen-Rezeptor) Ausdruck (p = 0,0035, Genauigkeit 62,7%, Sensitivität 94,7%, Spezifität 43,8%) (1C und Tabelle S1). Diese Ergebnisse zeigen, dass es tatsächlich möglich ist, Muster Stoffwechselwegaktivierung in einem bestimmten Krebs von Interesse (Magenkrebs in unseren Fällen) zur Vorhersage unter Verwendung von Expressionssignaturen von verschiedenen experimentellen Bedingungen erhalten und sogar verschiedene Gewebetypen.

Muster von Onkogene Stoffwechselwegaktivierung in GC

nach diesen Weg Vorhersage Ansatz Validierung, gingen wir die Strategie zur primären GC anzuwenden. Anstatt alle möglichen Weg zu testen, wählten wir elf onkogenen und Tumor-Suppressor-Bahnen zuvor in Magen-Krebsentstehung beteiligt, in unserer Analyse RAS [4], p53 [5], BRCA1 [12], p21 [13], Wnt /β-Catenin [6], E2F [3], SRC [14], MYC [15], NF-kappaB [21], Histondeacetylierung (HDAC) [16], und Stammzellenbezogenen Signaturen [17]. Wann immer möglich, haben wir versucht, mehrere Signaturen für jeden Weg, vorzugsweise unabhängigen veröffentlichten Studien zu wählen. Zum Beispiel der beiden E2F Aktivierung Signaturen in unserem Ansatz verwendet wurde, wurde durch die Induktion E2F1-Aktivität in Ratten-Fibroblasten-Zellen eine Unterschrift erhalten [22], während die andere Signatur wurde ein Osteosarkom abgeleitete Zelllinie unter Verwendung enthält einen induzierbaren ER-E2F1-Fusionsprotein erhalten [23]. Endstrecke Prognosen für weitere Analysen wurden in der Regel durch die Kombination von Einzelsignaturen Zugehörigkeit zur gleichen Weg erhalten (siehe Materialien und Methoden).

Wir berechneten Aktivierungs Scores für die elf Bahnen vertreten durch 20 Weg Signaturen über drei unabhängige Kohorten von primären GCs abgeleitet aus Australien (Cohort 1-70 Tumoren), Singapur (Cohort 2-200 Tumoren) und das Vereinigte Königreich (Cohort 31.03 Tumoren). Zur Visualisierung von Mustern Stoffwechselwegaktivierung, dargestellt wir jede Kohorte als Heatmap, wo die Heatmap Farbe für jeden Weg in den einzelnen GCs die vorhergesagte Stärke der Aktivierung darstellt. Wir beobachteten beträchtliche Heterogenität der Stoffwechselwegaktivierung zwischen den einzelnen GC-Patienten (2A-2C). Doch von unabhängigen Studien abgeleitet Signaturen repräsentieren ähnliche Bahnen häufig ähnliche Vorhersage Muster (zB NF-kappaB (Haut) und NF-kappaB (Zervix)) ergab, und eine Chi-Quadrat-Test bestätigte, ein hohes Maß an Ähnlichkeit in den allgemeinen Muster des Weges Aktivierung zwischen den Australien und Singapur Kohorten (p = 0,00038), und zwischen den Australien und UK Kohorten (p = 0,00051 siehe Tabelle S2) darauf hindeutet, dass die GC Weg Prognosen zu einer bestimmten Patientengruppe nicht gebunden sind. Wir identifizierten zwei große Gruppen von coaktiviert Wege, die vollständig in Kohorten aufbewahrt wurden 1 und 2 (2A und 2B) und meist in Cohort 3 (2C) erhalten. Dazu gehörten: (i) eine "Proliferation /Stammzell 'Weg Cluster (braun vertikalen Balken in Abbildung 2) umfasst Wege im Zusammenhang mit verschiedenen Zellzyklusregulatoren (z MYC, E2F, p21) und Zell Unterschriften stammen; und (ii) eine "onkogenen Signal 'Weg Cluster (graue vertikale Balken in Abbildung 2), die viele verschiedene onkogene Wege (BRCA1, NF-kappaB, p53, Wnt /β-Catenin, SRC, RAS, und HDAC-Bahnen).

in-vitro-
Validierung
Pathway Prognosen

, um den GC-Weg Heatmap in Abbildung 2 Durch die Analyse wählten wir drei onkogenen Wege (NF-kappaB, Wnt /β-Catenin und Proliferation /Stammzelle), die einzeln in einem signifikanten Anteil von GCs (≥35%) aktiviert wurden, und wenn vorgesehen Berichterstattung über die Mehrheit kombiniert (> 70%) von GCs. Proliferation /Stammzellwege in 40% der GCs aktiviert wurden, in jeder Kohorte: (: 43 bis 48% -Bereich) und der NF- (Bereich 38 bis 43%), Wnt /β-Catenin-Bahnen wurden in 46% der GCs aktiviert (: 35 bis 41% -Bereich) (Farbbalken unter jedem Heatmap in Abbildung 2) kappaB Signalweg wurde in 39% der GCs aktiviert. Diese Frequenzen und andere häufig dereguliert Wege (zB p53) in der Tabelle S3 aufgeführt sind.

experimentell Um diese primären GC Weg Vorhersagen bestätigen, verwendeten wir den Weg Vorhersage-Algorithmus auf einem Panel von 25 GC-Zelllinien (GCCLs) ( Figur 3). Ähnlich wie bei primären GC "Proliferation /Stammzell" und "onkogenen Signal 'Pathway Cluster wurden auch in den GCCLs beobachtet. Ferner repräsentieren Signaturen den gleichen Stoffwechselweg, aber aus verschiedenen Studien, wie die beiden unabhängigen MYC-derived Signaturen erhalten [9], [24] auch gemeinsam in den GC-Zellinien gruppierten nach unbeaufsichtigt hierarchischen Clustering (purpurrot Klammern in Abbildung 3). Geleitet von den Pfad Prognosen identifizierten wir spezifische GC-Zelllinien-Muster von onkogenen Weg-Aktivität zeigt primäre GCs Spiegelung. Das Vertrauen in die Auswahl von spezifischen Zelllinien als In-vitro-
Modelle auch durch Wiederholung des Vorhersage-Verfahren siebenmal mit einer Vielzahl von Referenzprofilen, die von dem Median GCCL Profil an unabhängige Profile wie nicht-malignen normalen erreicht wurde Magen-Profile (siehe Materialien und Methoden und Tabelle S4). Paarweise Vergleiche bestätigt, dass zwei Referenzprofile wahrscheinlicher Weg zustimmenden Prognosen als widersprüchliche Vorhersagen (Text S1 und Tabelle S4) zu produzieren waren. Einige Beispiele für repräsentative Linien umfassen AZ521 und MKN28 Zellen, die zeigen Aktivierung der Proliferation /Stammzellwege, YCC3 und AGS-Zellen für Wnt /β-Catenin-Bahnen und MKN1 und SNU5 Zellen für die NF-kappaB Signalweg.

Zunächst haben wir direkt auf die proliferative Raten von 22 GCCLs und die Proliferationsrate Daten mit der mittleren Aktivierungs Punktzahl von Signaturen in der Proliferation korreliert /Zell-Stoffwechselweg Cluster stammen. Es gab eine signifikante Assoziation zwischen den experimentell ermittelten Proliferationsrate und der Stoffwechselwegaktivierung Scores (R = 0,4688, p = 0,0278) (4A). Unterstützung bei der Vorstellung, dass onkogenen Weg Signaturen überlegen Prädiktoren der Signalweg-Aktivität im Vergleich zur Expression einzelner Schlüssel Pathway-Gene wurden keine signifikanten Assoziationen entweder für MYC oder E2F1 Ausdruck (p = 0,48 und 0,38 für MYC und E2F1, beziehungsweise) (Abbildung S1 beobachtet ).

Zweitens, um die Wnt /β-Catenin-Signalweg Vorhersagen zu bestätigen, wurde die Expression verschiedener Wnt-Signalweg Komponenten (β-Catenin, TCF4) und relativen Mengen von TCF /LEF Transkriptionsaktivität in GC analysiert Zelllinien vorhergesagt Wnt /β-catenin- aktiviert oder Wnt /β-Catenin-nicht-aktivierte sein. Sieben Zelllinien für ihre experimentellen tractability ausgewählt (zB einfache Transfektion und bequem Wachstumsbedingungen), fanden wir, dass sowohl β-Catenin und TCF /LEF-Transkriptionsfaktor TCF4 (auch als TCF7L2 bekannt), Hauptkomponenten des Wnt-Signalwegs, in GC-Zelllinien wurden von der Reaktionswegs-Aktivierung vorhergesagt ausgedrückt analysiert Hoch Wnt /β-Catenin-Aktivität (AGS, YCC3, Kato III und NCI-N87) haben, aber nicht in zwei von drei Leitungen (SNU1 und SNU5) ausgedrückt assoziiert mit inkonsistenten oder niedrigen Wnt /β-Catenin-Aktivierung Scores (4B). Weiterhin direkt Wnt-Signalweg-Aktivitätstest in Ordnung, stellten wir fest, TCF /LEF transkriptionale Aktivität in der GC unter Verwendung von Zelllinien TOPFLASH, ein Luciferase-exprimierenden Plasmids multimerisierten TCF-Bindungsstellen enthält. Die TOPFLASH Assay bestätigt hohe TCF /LEF transkriptionale Aktivität in drei von vier GC-Zelllinien hohe Wnt /β-Catenin-Aktivität (AGS, YCC3 und Kato III) haben vorhergesagt, aber nur geringe oder keine TOPFLASH Aktivität in GC-Zelllinien, die mit inkonsistent oder niedrige Wnt /β-Catenin-Aktivierung Scores (SNU1, SNU5 und SNU16). Zusätzlich wurden die β-Catenin-Signalweg-Aktivierung Noten signifikant höher in GCCLs mit mehr als zweifach TCF /LEF Transkriptionsaktivität (AGS, YCC3, Kato III und NCI-N87) als in GCCLs mit niedrigeren TCF /LEF Transkriptionsaktivität (p = 0,007, 4B). Im Vergleich mit einzelnen Genen, überlegen Assoziationen zu TCF /LEF Transkriptionsaktivität erneut beobachtet wurden unter Verwendung der mittleren Aktivierungs Punktzahl von Wnt /β-Catenin-Signaturen im Vergleich zu entweder β-Catenin oder TCF4 (aka TCF7L2) Ausdruck allein (p = 0,038 für Signaturen vs. p = 0,31 und 0,58 für β-Catenin und TCF4, beziehungsweise) (Abbildung S1).

Drittens, die NF-kappaB Signalweg Vorhersagen zu überprüfen, wählten wir 11 GCCLs konsequent entweder als NF-κB- vorhergesagt aktiviert ( "NF-kappaB /on", sechs GCCLs) oder NF-kappaB-nicht-aktivierten ( "NF-kappaB /off ', fünf GCCLs) (Abbildung S2). Erhöhte Genexpression von p50 und p65, die NF-kappaB-Heterodimer-Untereinheiten wurden in NF-kappaB /auf GC-Zelllinien im Vergleich zu NF-kappaB /Aus-GC-Zelllinien (p = 0,0002 für p50, p = 0,046 für p65, beobachtet Abbildung 4C) und auf Proteinebene p65-Expression wurde weitgehend in der NF &kgr; B /auf den Leitungen (4C) beobachtet. Unter Verwendung der Immunzytochemie auf Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten GC-Zelllinien, p65-Proteinexpression mehr wurde häufig in NF-kappaB /auf GC-Zelllinien im Vergleich zu NF-kappaB /Aus-GC-Zelllinien in Bezug auf die Kern sublocalization beobachtet, Prozentsätze von Zellen mit Färbung (entweder Kern oder cytoplasmatische) und Färbeintensität (Tabelle S5, Abbildung S3). wenn NF-kappaB /auf GC-Zelllinien zeigte auch unterschiedliche Expression von p65-regulierte Gene im Vergleich zu NF-kappaB /Aus-GC-Zelllinien zu bestimmen, kombiniert wir die Liste der Gene direkt von der p65-Transkriptionsfaktor gebunden [25] mit Listen Gene auf mRNA-Ebene durch TNF-α reguliert [26], ein bekannter Induktor von NF- &kgr; B-Aktivierung. Mit Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, [27]), wir, dass p65-Zielgene upregulated durch TNF-α-Behandlung gefunden wurden in NF-kappaB /auf GC-Zelllinien im Vergleich zu NF-kappaB /Aus-GC-Zelllinien (normalisierte Anreicherung signifikant überexprimiert Score, NES = 1,86; False Discovery Rate, FDR < 0,001, unterste Platte, 4C). Im Gegensatz dazu wurden von TNF-α nach unten reguliert Gene p65 Ziel deutlich in NF-kappaB /auf GC-Zelllinien im Vergleich zu NF-kappaB /Aus-GC-Zelllinien unterexprimiert (NES = -1,56, FDR = 0,019, unterste Platte, 4C). Schließlich, um direkt das Vorhandensein von erhöhten NF &kgr; B-Aktivität zu bestätigen, transfizierten wir drei NF-kappaB /on GC Zelllinien und zwei NF-kappaB /off GC Zelllinien mit einem Luciferase-Reporter eine NF-kappaB-Reportergen enthält. Wie in 4D gezeigt, die drei NF-kappaB /on GC Zellinien zeigten erhöhte NF &kgr; B Transkriptions-Aktivität im Vergleich zu den beiden NF-kappaB /off GC-Zelllinien (p = 0,0084).

zusammengenommen, diese Ergebnisse das Konzept, dass in silico
Weg Prognosen unter Verwendung von Genexpressionsprofilen verknüpft sind mit der Aktivierung des entsprechenden Weges in-vitro-
unterstützen.

Pathway Kombinationen Predict Gastric Cancer Patient Überleben

die klinische Relevanz der identifizierten Untergruppen Weg zu bewerten, untersuchten wir, ob Muster der Weg Koaktivierung wie in den Heatmaps der verschiedenen Kohorten dargestellt könnte das Überleben des Patienten in Beziehung gesetzt werden. Wir haben die Gesamtüberlebensdaten aus Kohorte 1 und Kohorte 2 und geschichteten Patienten durch ihre vorhergesagten Muster der Signalweg-Aktivierung. Ein primäres GC-Profil wurde als die eine hohe Aktivierungsgrad eines Weges definiert, wenn die Aktivierung Score über Null war - das heißt positiv mit dem Weg Signatur zugeordnet ist. Patientengruppen geschichtet, indem entweder die Proliferation /Stammzell Stoffwechselwegaktivierung Score allein oder die NF-kappaB Signalweg-Aktivierung Score allein unterschied sich nicht signifikant ihre Gesamtüberlebenszeit in Bezug auf (p > 0,05 für die Proliferation /Stammzell und NF-kappaB in beiden Kohorten, 5A und 5B). Wenn jedoch die Reaktionswegs-Aktivierung Scores wurden vereinigt, Patienten mit hohen Aktivierungspegel sowohl NF-kappaB und Proliferation /Stammzellwege hatten signifikant kürzere Überlebenszeit im Vergleich zu Patienten mit niedrigen Aktivierungsniveaus sowohl NF-kappaB und Proliferation /Stammzellwege (p = 0,0399 und p = 0,0109 für Kohorten 1 bzw. 2, 5D).

Aktivierung der Wnt /β-Catenin-Weg signifikant mit dem Überleben des Patienten in Cohort 1 assoziiert war (p = 0,0056, 5C) aber nicht in Kohorte 2 (p = 0,0693, 5C). Allerdings Patienten in Kohorten 1 und 2 mit einer hohen Aktivierungsebenen beider Wnt /β-Catenin und die Proliferation /Stammzellwege hatten signifikant schlechter Überleben im Vergleich zu Patienten mit einer niedrigen Aktivierungsebenen beider Bahnen (p = 0,0073 und p = 0,0086, 5E ). Um Benchmark durchgeführt werden die Beiträge der Weg Kombinationen mit bekannten histopathologischen Kriterien haben wir eine multivariate Analyse einschließlich kombinierter Weg Vorhersagen und pathologischen Tumorstadium (TNM-Klassifikation: Stufen 1-4), die wichtigste prognostischer Faktor bei GC [28]. In beiden Kohorten, kombinierte Aktivierung von Proliferation /Stammzell und NF-kappaB Wege erwies sich als ein prognostischer Faktor unabhängig vom Tumorstadium (p = 0,003 und 0,048 für Kohorten 1 bzw. 2) (Tabelle S6) zu sein. Ebenso kombinierte Aktivierung der Proliferation /Stammzell und Wnt /β-Catenin-Bahnen ein unabhängiger prognostischer Faktor in der Kohorte war 1 und erreicht grenzwertig signifikant in Kohorte 2 (p < 0,001 und p = 0,058, Tabelle S7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bewertung des kombinierten Weg Aktivierungsstatus klinisch relevant ist, und darüber hinaus zusätzliche prognostische Informationen über zur Verfügung stellen kann und über dem aktuellen Goldstandard der Patientenprognose Vorhersage, die TNM-basierte Tumor-Staging.

Diskussion

In dieser Studie haben wir versucht, zu individualisierende Patientenbehandlungen und Verbesserung der Ergebnisse GCs in molekular homogene Untergruppen als ersten Schritt zu unterteilen. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu früheren GC Microarray-Studien Genexpressionsmuster in Bezug auf Histologie oder anatomischen Typ [10], [11], haben wir uns für unsere GC Unterteilungen auf Muster der onkogenen Weg Aktivität zu stützen. Nach der Entwicklung und dieses neuartigen Klassifizierungsansatz Validierung, waren wir in der Lage, zum ersten Mal, um eine genomische Taxonomie von GC basiert auf Mustern der onkogenen Weg Aktivität beschreiben. Unser Ansatz ist besonders für die Genexpression Microarrays geeignet, da diese Plattformen Tausende von mRNA-Transkripten in jeder Probe abzufragen, wodurch die Bewertung von Mehrfachwegen gleichzeitig in einem einzigen Experiment. Im Gegensatz dazu ist ein solcher Ansatz ist nicht möglich, auf der Proteinebene wegen des Mangels an geeigneten Plattformen. Mit dieser Strategie haben wir festgestellt drei dominanten Wege Aktivierung in der Mehrheit zeigt (> 70%) von GCs: Proliferation /Stammzell, Wnt /β-Catenin und NF-kappaB Signal

Die Fähigkeit, auszuführen. solche "High-Throughput-Weg Profilierung" eröffnet viele interessante Möglichkeiten. Zum Beispiel haben mehrere Studien berichteten zuvor inkonsistente Ergebnisse in Bezug auf die prognostische Bedeutung von verschiedenen onkogenen Wege in GC - die prognostische Bedeutung der Proliferation bezogene Antigene wie Ki-67 in GC nicht fest etabliert [29] und eine hohe NF &kgr; B-Aktivierung in GC wurde mit guten und schlechten GC Patienten Ergebnis in verschiedenen Studien [7], [30] verbunden. Es ist durchaus möglich, dass einige dieser Inkonsistenz aufgrund eines historischen Fokus haben können konventionelle Methoden zur Verwendung und entweder einzelne Bahnen oder einzelne Weg Komponenten (Gene /Proteine) zu analysieren. Unsere Beobachtung, dass Weg Kombinationen prädiktiv für das Outcome der Patienten sind darauf hin, dass Weg Kombinationen, anstatt einzelne Wege allein, eine entscheidende Rolle Verhalten bei der Beeinflussung der Tumor spielen können.

Ein weiterer Vorteil der High-Throughput-Weg Profilierung ist die Fähigkeit, zu definieren, höherer Ordnung Beziehungen zwischen verschiedenen onkogenen Wege. In der aktuellen Studie beobachteten wir konsequent die gleichzeitige Aktivierung von E2F, MYC, p21 (-repression) und Zellwegen in Tumoren stammen (die "Proliferation /Stammzell 'Weg Cluster). Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Zellproliferation in Tumorzellen, wie E2F wichtig in der Zellproliferationskontrolle und MYC ist sowohl ein p21-Repressor und Induktor von Cyclin D2 und Cyclin-abhängige Kinase-Bindungsprotein CksHs2 [31]. Weiterhin Stammzellen, insbesondere embryonale Stammzellen (ES-Zellen), sind auch hohe Zellproliferationsraten aufweisen bekannt [32]. anscheinend funktionell unterschiedliche Wege, wie β-Catenin und SRC sowie HDAC Inhibition und BRCA1 Mehr intriguingly beobachteten wir auch enge Verbindungen zwischen. Solche Weg Co-Aktivierungsmuster funktionelle Wechselwirkungen zwischen diesen Bahnen kann vorschlagen, die weiter untersucht werden verdienen. Beispielsweise ist es möglich, dass aktivierte c-SRC kann die Expression des Wnt-Signalwegs [33] zu verbessern. Erforschung der Beziehung zwischen Pfaden Koaktivierung zeigt somit wertvolle Informationen in Bezug auf die Fähigkeit der Krebszelle bereitzustellen, können die Aktivität von mehreren Bahnen zu koordinieren.

Ein dritter Vorteil des Weges Profilierungs Ansatz ist, dass es Identifizierung von größeren erleichtert krankheitsbezogene Pfade. Der Wege in dieser Studie untersucht, kann die Feststellung, daß NF &kgr; B-Signalisierung in einem signifikanten Anteil von GCs erhöht werden, verdient einige Aufmerksamkeit, da dieser Weg relativ weniger in GC untersucht wurde. Interessanterweise, während wir einen signifikanten Unterschied sowohl in p50 und p65 (NF &kgr; B-Untereinheiten) der Genexpression zwischen NF &kgr; B /on und NF &kgr; B /off GCCLs beobachtet, haben wir nicht manifesten Differential p50-Proteinexpression in diesen Linien zu beobachten, in Im Gegensatz zu p65 (4C). Dies kann zu einer Kombination von drei Ursachen haben. Erstens ist der absolute Bereich von p65-Genexpression in den Zelllinien deutlich größer ist als der absolute Bereich von p50 Genexpression (> 3 × Abbildung S4). Zweitens ist die Western-Blot-Assay verwendet, um diese Protein-Messungen durchzuführen, ist bekannt, stark nicht-quantitative sein, was in der Expression subtile Unterschiede maskieren. Drittens jenseits Genexpression ist p50-Expression auch unter einer Vielzahl von post-transkriptionalen Regulationsmechanismen wie Vorläuferspaltung, die die letzte Stufe des p50-Proteins beeinflussen könnten, während p65 nicht aus einem Vorläuferprotein [34] erzeugt wird. NF &kgr; B wurde von H aktiviert werden gezeigt. pylori
[35], ein bekanntes Karzinogen GC und aberrant NF &kgr; B-Signalisierung wurde auch in mehreren entzündungs ​​verbunden Krebsarten wie GC [36] in Verbindung gebracht. NF &kgr; B wurde vorgeschlagen konstitutiv in primären Magenkarzinome in einigen Studien aktiviert werden [7]. Gezielte NF-kappaB-Hemmer werden derzeit in vielen Krebsmedikamentenentwicklungsprogramme und eine Teilmenge von GC-Patienten (dh mit erhöhter NF-kappaB-Aktivität) darstellen kann, eine geeignete Unterklasse für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Verbindungen aktiv entwickelt.

die in silico
Methode in unserer Studie verwendet wird, ist vom Konzept her ähnlich wie die Arbeit von Bild et al, die eine binäre Regressionsmodell verwendet Tumoren zu klassifizieren basierend auf der vorhergesagten Aktivität von fünf onkogenen Wege [9]. Anders als binäre Regression, unser Ansatz, die Verwendung eines rangbasierten Connectivity-Metrik macht [37], erfordert keine aufwendige Trainingsprozess auf jedem Weg Unterschrift und auch nicht die Verfügbarkeit von Roh-Expressionsdaten erfordert, die Nutzung der vielen Erleichterung öffentlich zugänglich Weg Signaturen in der Literatur [27]. Allerdings ist die Genexpression basierten Ansatz Grenzen. Erstens, weil unser Weg die Prognosen auf die Genexpression basieren eher als Proteine ​​sind solche Prognosen zwar molekularen Surrogate wahre Weg Signalaktivität. Zweitens sind wir derzeit begrenzt auf die Analyse onkogenen Wege bekannt in der Literatur bisher identifiziert. Drittens: Obwohl wir in der Lage waren, von Weg Signaturen zu verwenden, sehr unterschiedliche Gewebe Kontexten Weg Aktivierungsstatus, eine Prüfung der anfänglichen proof-of-principle Brustkrebs Beispiele zeigte, um vorherzusagen, dass die Assoziation von ER-Status Reaktion auf Östrogen als mit der Osteosarkom Signatur vorhergesagt , obwohl signifikant, war deutlich schwächer im Vergleich zur Vereinigung von ER zu Tamoxifen Empfindlichkeit Status vorhergesagt aus dem gleichen Gewebetyp eine Signatur abgeleitet (dh Brust). Dieses Ergebnis impliziert, dass es auch gewebespezifische Unterschiede in Stoffwechselweg Signaturen bestehen können, die Vorhersagegenauigkeit beeinflussen können. Viertens, im Vergleich zu unserer Studie, die auf Bahnen von bekannter biologischer Relevanz in GC konzentriert, ist es unklar, ob dieses Verfahren auf Krankheiten angewendet werden kann, wo vorherige Kenntnis der beteiligten Bahnen nicht verfügbar. im Zusammenhang mit verschiedenen biochemischen und Signalwege existiert bereits in der Literatur, die aus öffentlichen Datenbanken wie MSigDB zugegriffen werden kann (http://www.broad.mit, jedoch sollte es (1000 >), die eine Fülle von Pathway Unterschriften anzumerken, .edu /GSEA /msigdb /genesets.jsp? Sammlung = CGP). Da unser Ansatz kann auf praktisch jedes krankheitsrelevante Daten-Set angewendet werden, für die Genexpression Informationen zur Verfügung steht, ist jede Unterschrift in einem Hochdurchsatz-Art und Weise die Prüfung auf Anzeichen von Pathway Deregulierung sowohl denkbar und möglich. In solchen Fällen Weg hohen Frequenzen der Deregulierung aufweisen würde dann Kandidatenwege in der betreffenden Krankheit beteiligt darstellen, die dann für gezielte Untersuchungen und Experimente gezielt werden kann. Die Bewältigung dieser Probleme wird den Boden für viel zukünftige Forschung bilden.

Abschließend haben wir in dieser Arbeit gezeigt, dass Signaturen Pfade erfolgreich den Aktivierungsstatus von zellulären Signalwegen, auch in biologischen Einheiten wie komplex zur Vorhersage verwendet werden als Mensch GC. Eine offensichtliche unmittelbare Anwendung solcher Weg basierte Taxonomien auf die Verwendung von zielgerichteten Therapien beziehen. Erste Versuche, die Rolle von gezielten Therapien in GC Beurteilung haben nur bescheidene Ergebnisse zeigten, [38]; Allerdings haben die meisten dieser Studien durchgeführt worden, ohne pre-Stratifizierung Patienten molekularen oder histopathologischen Kriterien.

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