PLoS Genetics: oncogênicos Caminho Combinações predizer o prognóstico clínico em Câncer Gástrico

Sumário

Muitos cancros sólidos são conhecidos por apresentar um alto grau de heterogeneidade na sua desregulamentação das diferentes vias oncogênicas. Buscou-se identificar as principais vias oncogênicas em câncer gástrico (GC) com os relacionamentos significativos para a sobrevida do paciente. Usando assinaturas de expressão gênica, eu inventei um in silico estratégia
para mapear os padrões de ativação da via oncogénica em 301 cânceres gástricos primários, a segunda maior causa de mortalidade por câncer global. Foram identificados três vias oncogénicos (/proliferação de células estaminais, NF-kB, e Wnt /β-catenina) desreguladas na maioria (> 70%) dos cancros gástricos. Nós funcionalmente validado estas previsões caminho em um painel de linhas celulares de cancro gástrico. estratificação paciente por via oncogénicos combinações mostraram diferenças de sobrevivência e reprodutíveis significativos em múltiplos grupos, sugerindo que as interacções de vias pode desempenhar um papel importante em influenciar o comportamento da doença. GCs individuais podem ser taxonomized com sucesso pela atividade da via oncogénica em biologicamente e clinicamente subgrupos relevantes. Prevendo atividade da via por assinaturas de expressão permite assim o estudo das múltiplas vias relacionadas ao câncer interagindo simultaneamente em cânceres primários, em uma escala de momento não podem ser obtidas com outras plataformas.

Autor Resumo

O câncer gástrico é a segunda principal causa de mortalidade por câncer global. Com os tratamentos atuais, menos de um quarto dos pacientes sobrevivem mais de cinco anos após a cirurgia. cancros gástricos individuais são altamente díspares em suas características celulares e respostas aos medicamentos quimioterápicos padrão, tornando o câncer gástrico uma doença complexa. abordagens da via de base, em vez de estudos único gene, pode ajudar a desvendar essa complexidade. Aqui, fazemos uso de uma abordagem computacional para identificar ligações entre vias moleculares e perfis de câncer. Em um estudo em grande escala de mais de 300 pacientes, foram identificados subgrupos de cancros gástricos distinguíveis pelos seus padrões de condução vias moleculares. Mostramos que estes subgrupos identificados são clinicamente relevante na previsão de duração de sobrevivência e pode revelar-se útil para guiar a escolha de terapias específicas destinadas a interferir com estas vias moleculares. Foram também identificadas linhas celulares de cancro gástrico específicas que espelham estes subgrupos caminho, o que deve facilitar a avaliação pré-clínica de respostas a terapias específicas em cada subgrupo

Citation:. Ooi CH, Ivanova T, Wu J, Lee M, tan IB, J Tao, et al. (2009) Oncogênicos Caminho Combinações predizer o prognóstico clínico em câncer gástrico. PLoS Genet 5 (10): e1000676. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000676

editor: Jason G. Mezey, Universidade de Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Abril de 2009; Aceito: 03 de setembro de 2009; Publicação: 02 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Ooi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações para a PT de BMRC 05/1/31/19/423, Singapore Cancer Syndicate SCS-BS0001, NMRC conceder TCR /001/2007, e uma subvenção núcleo Duke-NUS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a segunda principal causa de mortalidade global de câncer [1]. Particularmente prevalente na Ásia, a maioria dos pacientes do GC são diagnosticadas com doença em estágio avançado [2]. A desregulação de vias oncogénicos canónicos tais como E2F, K-ras, a p53, e a sinalização /β-catenina de Wnt são conhecidas como ocorrendo com frequências variáveis ​​no GC [3] - [6], indicando que a GC é uma doença heterogénea molecularmente. Estudos anteriores que descrevem a diversidade GC em tumores primários têm tipicamente focada em vias individuais, medindo apenas um ou alguns biomarcadores por experimento [4], [6], [7]. Em contraste, as evidências experimentais indicam que a maioria dos fenótipos câncer (crescimento descontrolado, resistência à apoptose, etc) são em grande parte regido não apenas por percursos individuais, mas as interações complexas entre pro- múltipla e circuitos de sinalização anti-oncogênicos [8]. Estreitando essa lacuna entre as arenas clínicos e experimentais vão exigir estratégias capazes de medir e relacionar os padrões de múltiplas vias oncogênicas atividade simultaneamente em tumores primários.

Estudos anteriores têm proposto o uso de assinaturas de expressão gênica para prever a atividade de vias oncogênicas em cancros [9] - aqui, a hipótese de que os padrões de activação da via oncogénica poderia ser utilizado para desenvolver uma taxonomia genómico de GC. Mais importante, esta estratégia via centrada difere substancialmente a partir de estudos de microarranjos anteriores descrevem as alterações de expressão associadas com diferenças tipo morfológico e tecidos em GC [10], [11], como assinaturas da via (em vez de genes individuais) são usadas como base para a classificação do cancro . Desenvolvemos um in silico
método para mapear níveis de ativação de diferentes vias em coortes de perfis de tumor primário complexas e validado esta abordagem de classificação dirigiu-pathway usando exemplos de prova de conceito de câncer de mama. Em seguida, aplicada a este método GC para avaliar as vias oncogénicos onze previamente implicado na carcinogénese gástrica [3] - [7], [12] - [17]. No total, foram analisados ​​mais de 300 GCs primários derivados de três coortes independentes de pacientes, realizando o melhor de nosso conhecimento o maior análise genômica de GC até à data. Foram identificados três vias oncogénicos (factor nuclear kB (NF-kB), Wnt /β-catenina, e proliferação /células-tronco), que foram desregulados na grande maioria (> 70%) de GC, e funcionalmente validado as previsões pathway in vitro
utilizando um painel de linhas celulares GC. Embora a estratificação dos pacientes ao nível dos percursos individuais falhou consistentemente para demonstrar diferenças significativas nos resultados clínicos, a estratificação dos pacientes por via oncogénicos combinações (por exemplo, proliferação de alta /alta NF-kB contra a proliferação de baixo /baixo NF-kB) mostrou diferenças de sobrevivência significativas e reprodutíveis em vários grupos independentes de pacientes, sugerindo um papel crítico para combinações via, influenciando o comportamento clínico GC. Nossos resultados, portanto, demonstrar que GCs pode ser taxonomized com sucesso usando atividade da via oncogénica em subtipos biologicamente, funcionalmente, e clinicamente relevante.

Resultados

Prevendo via de ativação na Cancer Gene Expression Profiles

a nossa estratégia para prever níveis de activação da via oncogénica em cancros envolve quatro passos (Figura 1A). Primeiro, definimos 'assinaturas via "- conjuntos de genes que apresentam expressão alterada após perturbação funcional de uma via específica em um in vitro
ou in vivo
sistema experimental bem definido. Em segundo lugar, nós mapeamos as assinaturas via Onto perfis de expressão genética de uma série heterogénea de cânceres. Em terceiro lugar, usando um procedimento padrão de correspondência não paramétrico, baseado em classificação, a pontuação de ativação foram designados para cânceres individuais com base na força de associação à assinatura via. Finalmente, os cânceres individuais foram ordenados com base em suas pontuações ativação da via.

Antes de aplicar esta abordagem para GC, que considerou importante para validar esta in silico
estratégia em uma série de prova de experimentos -Princípio. Nós escolhemos o exemplo de câncer de mama, um tumor maligno para o qual existe ampla evidência de heterogeneidade via e 'subtipos moleculares' discretos [18]. Para executar esta validação, que pediu primeiro se as assinaturas de vias anteriormente descritas associadas com a sinalização do estrogénio auditivos poderia ser usado para identificar linhas celulares de cancro da mama que apresentam níveis elevados de receptor de estrogénio (ER) actividade. Analisou-se um painel de linhas celulares de cancro da mama 51 originalmente descritos em Neve et al expressão do gene. [18] com um 11-gene "sensibilidade tamoxifeno 'assinatura via derivada a partir de uma lista de genes diferencialmente expressos entre MACA 3366, um mamário humano Carcinoma xenoenxerto sensível ao tamoxifeno, e MACA 3366 /TAM, uma sublinha tamoxifeno-resistente do mesmo xenoenxerto [19]. Descobrimos que linhas celulares de cancro da mama associado positivamente com a assinatura sensibilidade tamoxifen exibiram níveis de expressão significativamente mais elevados de ESR1
, o receptor de estrogênio e alvo molecular do tamoxifeno, em comparação com linhas que mostram pontuações ativação da via negativos (p = 2,12 × 10 ^{-7, Precisão 84,3%, 100% de sensibilidade, especificidade 75%) (Figura 1B e Tabela S1).}

em segundo lugar, nós testamos se uma assinatura via associado ao estrogênio sinalização, mas derivado de não tecido da mama, também poderia ser usado para estratificar o mesmo painel de linhas celulares de cancro da mama. Nós interrogado painel linha de células do cancro da mama com um 41-gene "resposta de estrogênio" assinatura derivado de uma lista de genes regulados positivamente por estradiol em células de osteossarcoma humano U2OS [20]. Apesar da assinatura proveniente de um tipo de tecido diferente (por exemplo osteossarcoma), mais uma vez descobriu que, quando classificadas com base em suas previsto estrogênio capacidade de resposta, linhas celulares de cancro da mama agrupados pelo seu nível de ESR1
(receptor de estrogênio) expressão (p = 0,0035, Precisão 62,7%, sensibilidade de 94,7%, especificidade de 43,8%) (Figura 1C e Tabela S1). Estes resultados demonstram que é realmente viável para prever os padrões de ativação da via em um tipo específico de câncer de interesse (câncer gástrico em nossos casos), utilizando assinaturas de expressão obtidos a partir de diferentes condições experimentais e até mesmo diferentes tipos de tecidos.

Padrões de Oncogênicos ativação da via no GC

Depois de validar esta abordagem previsão caminho, procedeu-se a aplicar a estratégia de GC primário. Em vez de testar cada via possível, foram selecionados onze percursos supressores oncogênicos e tumorais previamente implicado na carcinogênese gástrica, usando em nossas RAS análise [4], p53 [5], BRCA1 [12], p21 [13], Wnt /β-catenina [6], E2F [3], SRC [14], MYC [15], NF-kB [21], desacetilação da histona (HDAC) [16], e com células-tronco assinaturas relacionados [17]. Sempre que possível, tentamos selecionar várias assinaturas para cada via, de preferência a partir de estudos publicados independentes. Por exemplo, as duas assinaturas de activação de E2F utilizados na nossa abordagem, uma assinatura foi obtida por indução da actividade de E2F1 em células de fibroblastos de rato [22] enquanto que a outra assinatura foi obtido utilizando uma linha de células derivadas de osteossarcoma contendo uma proteína de fusão ER-E2F1 indutível [23]. previsões via final para análises posteriores foram tipicamente obtidos através da combinação de assinaturas individuais pertencentes à mesma via (ver Materiais e Métodos).

Nós calculado contagens de ativação para as vias onze representados por 20 assinaturas via em três coortes independentes de primária GCs derivada da Austrália (Cohort 1-70 tumores), Cingapura (Cohort 2-200 tumores) e Reino Unido (Cohort 3-31 tumores). Para visualizar os padrões de ativação da via, nós representado cada coorte como um mapa de calor, onde a cor heatmap representa a força prevista de ativação para cada percurso na GCs individual. Observou-se uma considerável heterogeneidade da activação da via de GC entre pacientes individuais (Figura 2A-2C). No entanto, as assinaturas obtidas de estudos independentes que representam caminhos semelhantes com frequência produziram padrões de previsão semelhantes (por exemplo, NF-kB (pele) e NF-kB (colo do útero)), e um teste qui-quadrado confirmou um nível significativo de similaridade nos padrões gerais de via ativação entre os coortes Austrália e Singapura (p = 0,00038), e entre as coortes Austrália e do Reino Unido (p = 0,00051, ver Tabela S2), sugerindo que as previsões da via GC não estão vinculados a uma coorte paciente específico. Foram identificados dois maiores aglomerados de vias co-activado, que foram completamente conservados em coortes 1 e 2 (Figura 2A e 2B) e na maior parte preservados em Coorte 3 (Figura 2C). Estes incluíram: (i) um "proliferação /célula estaminal" aglomerado via (barra vertical Brown na Figura 2) que abrange vias associadas com vários reguladores do ciclo celular (por exemplo, MYC, E2F, p21) e da haste assinaturas de células; e (ii) um agrupamento via 'de sinalização oncogénica' (cinzento barra vertical na Figura 2) contendo muitas vias oncogénicas diferentes (BRCA1, NF-kB, p53, Wnt /β-catenina, vias SRC, RAS, e HDAC).

In Vitro
Validação de previsões caminho

ao analisar a heatmap via GC na Figura 2, foram selecionados três vias oncogênicos (NF-kB, Wnt /β-catenina, e proliferação /célula estaminal) que foram activadas individualmente em uma proporção significativa dos GC (≥35%), e quando combinado fornecida cobertura da maioria (> 70%) de GCs. Proliferação /haste vias celulares foram activadas em 40% dos GCs em cada coorte (gama: 38 a 43%), as vias de Wnt /β-catenina foram activadas em 46% de GC (gama: 43 a 48%), e o NF- kB via foi activado em 39% de GC (gama: 35 a 41%) (barras de cor abaixo de cada mapa de calor da Figura 2). Estas frequências e outras vias com frequência desregulados (por exemplo, p53) estão listadas na Tabela S3.

Para validar experimentalmente estas previsões via GC principal, foi aplicado o algoritmo de previsão caminho para um painel de linhas celulares 25 GC (GCCLs) ( A Figura 3). Semelhante ao GC primário, 'proliferação /células-tronco "e os agregados da via de sinalização' oncogênico 'também foram observados nos GCCLs. Além disso, as assinaturas representando o mesmo caminho, mas obtida a partir de diferentes estudos, como as duas assinaturas derivada-Myc independentes [9], [24] também agrupados nas linhas celulares GC após sem supervisão de agrupamento hierárquico (suportes roxas na Figura 3). Guiados por as previsões da via, identificamos linhas celulares GC específicos que apresentam padrões de atividade da via oncogénica espelhamento GCs primário. A confiança na selecção de linhas de células específicas como in vitro
modelos também foi alcançada repetindo o procedimento predição sete vezes usando uma variedade de perfis de referência, que vão desde o perfil GCCL mediana para perfis independentes, como não malignas normais perfis de estômago (ver Materiais e Métodos e Tabela S4). comparações de pares confirmaram que quaisquer dois perfis de referência eram mais propensos a produzir concorrendo previsões da via do que as previsões conflitantes (Texto S1 e Tabela S4). Alguns exemplos de linhas representativas incluem AZ521 e MKN28 células, o que a ativação exposição de proliferação /haste vias celulares, células YCC3 e AGS para vias de Wnt /β-catenina, e MKN1 e células SNU5 para a via NF-kB.

em primeiro lugar, nós medimos diretamente as taxas de proliferação de 22 GCCLs e correlacionados os dados da taxa de proliferação com a pontuação de ativação média de assinaturas na proliferação /haste de cluster via celular. Houve uma associação significativa entre as taxas de proliferação determinadas experimentalmente e as pontuações ativação da via (R = 0,4688, p = 0,0278) (Figura 4A). Apoiando a noção de que as assinaturas pathway oncogénicos são preditores superiores de actividade da via em comparação com a expressão de genes de vias principais individuais, foram observadas nenhumas associações significativas para qualquer MYC ou expressão E2F1 (p = 0,48 e 0,38 para MYC e E2F1, respectivamente) (Figura S1 ).

em segundo lugar, a fim de validar as previsões da via Wnt /β-catenina, analisamos a expressão de vários componentes da via Wnt (β-catenina, TCF4) e níveis relativos de TCF /LEF transcricional atividade em GC linhas celulares previsto para ser Wnt /activado β-catenin- ou Wnt /β-catenina não activado. Dos sete linhas de células seleccionadas pela sua tratabilidade experimental (por exemplo, facilidade de transfecção e condições de crescimento convenientes), verificou-se que tanto β-catenina e o TCF /LEF factor de transcrição TCF4 (também conhecido como TCF7L2), os principais componentes da via de sinalização Wnt, foram expressas em linhas celulares GC previstos pela ativação da via analisa a ter alta atividade /β-catenina Wnt (AGS, YCC3, Kato III, e NCI-N87), mas não expressa em duas das três linhas (SNU1 e SNU5) associados com pontuações de activação de Wnt /p-catenina ou inconsistentes baixas (Figura 4B). Além disso, a fim de ensaiar directamente a actividade via Wnt, determinou-se TCF /LEF transcricional actividade nas linhas celulares, utilizando GC Topflash, uma luciferase expressando plasmídeo que contêm locais de ligação multimerizada TCF. O ensaio Topflash confirmada alta TCF /LEF transcricional actividade em três de quatro linhas celulares de GC previsível que tenha uma elevada actividade de Wnt /β-catenina (AGS, YCC3, e Kato III), mas pouca ou nenhuma actividade Topflash em linhas celulares GC associado com pontuações de ativação /β-catenina inconsistentes ou baixas Wnt (SNU1, SNU5 e SNU16). Além disso, as pontuações ativação da via β-catenina foram significativamente maiores em GCCLs com mais de duas vezes TCF /LEF transcricional atividade (AGS, YCC3, Kato III, e NCI-N87) do que em GCCLs com menor TCF /LEF transcricional atividade (p = 0,007, Figura 4B). Quando comparado com genes individuais, associações superiores aos TCF /LEF transcricional actividade foram novamente observadas utilizando o marcador de ativação média de Wnt assinaturas /β-catenina em comparação com qualquer β-catenina ou TCF4 (aka TCF7L2) expressão sozinho (p = 0,038 para assinaturas vs. p = 0,31 e 0,58 para β-catenina e TCF4, respectivamente) (Figura S1).

em terceiro lugar, para validar as previsões da via NF-kB, foram selecionados 11 GCCLs consistentemente previu tanto como NF-κB- ativado ( "NF-kB /on ', seis GCCLs) ou NF-kB-não activado (" NF-kB /off', cinco GCCLs) (Figura S2). O aumento da expressão do gene de p50 e p65, as subunidades heterodiméricas de NF-kB, foi observada no NF-kB /em linhas celulares de GC em comparação com NF-kB /desligar linhas celulares GC (p = 0,0002 para a p50, p = 0,046 para o p65, Figura 4C) e, ao nível da proteína p65 expressão foi observada em grande parte no NF-kB /em linhas (Figura 4C). Usando imunocitoquímica em parafina linhas celulares GC formol fixa, a expressão da proteína p65 foi mais frequentemente observada em NF-kB /em linhas de células GC em comparação com /off linhas celulares GC NF-kB em termos de sublocalização nuclear, percentagens de células com coloração (quer intensidade nuclear ou citoplásmico), e coloração (Tabela S5, Figura S3). Para determinar se NF-kB /em linhas de células de GC apresentaram expressão diferencial de genes regulados por p65 em comparação com /off linhas celulares GC NF-kB, combinamos a lista de genes diretamente ligados pelo factor de p65 transcrição [25] com listas de genes regulados ao nível do ARNm por TNF-α [26], um conhecido indutor da activação de NF-kB. Usando Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA, [27]), descobrimos que genes alvo p65 upregulated por tratamento TNF-α foram significativamente sobre-expressos em NF-kB /em linhas celulares GC em comparação com /off linhas celulares GC NF-kB (enriquecimento normalizada pontuação, NES = 1,86; taxa de detecção falsa, FDR < 0,001, mais inferior do painel, Figura 4C). Por outro lado, os genes alvo p65 regulada negativamente por TNF-α foram significativamente underexpressed no NF-kB /em linhas de células em comparação com GC NF-kB /off linhas celulares GC (NES = -1,56, FDR = 0,019, mais inferior do painel, a Figura 4C). Finalmente, para confirmar directamente a presença de elevada actividade de NF-kB, que transfectadas três NF-kB /em linhas celulares e GC /desligar linhas celulares GC duas NF-kB com um repórter de luciferase contendo um gene repórter de NF-kB. Como mostrado na Figura 4D, a três NF-kB /GC em linhas celulares exibiram elevada actividade de transcrição NF-kB em comparação com as linhas celulares de /desligar dois GC NF-kB (p = 0,0084).

Tomadas em conjunto, estes resultados suportam o conceito de que in silico
previsões da via usando perfis de expressão gênica estão associados com a activação da via relevante in vitro
.

Combinações caminho prever a sobrevida do paciente Câncer gástrico

para avaliar a relevância clínica dos subgrupos da via identificados, investigamos se os padrões de co-ativação da via como ilustrado nos mapas térmicos dos diferentes grupos pode estar relacionada à sobrevida do paciente. Foram utilizados dados de sobrevida global de coorte 1 e coorte 2 e os pacientes estratificados por seus padrões previstos de ativação da via. Um perfil de GC primário foi definido como mostrando alto nível de ativação de uma via quando o placar ativação foi acima de zero - ou seja, ser positivamente associado à assinatura via. Os grupos de pacientes estratificados por tanto a proliferação /haste ativação da via celular marcar sozinho ou a pontuação ativação da via NF-kB por si só não diferiram significativamente em relação à sua sobrevivência global (p > 0,05 para a proliferação /células-tronco e NF-kB em ambas as coortes, Figura 5A e 5B). No entanto, quando as pontuações activação da via foram combinadas, os pacientes com níveis elevados de activação de ambos NF-kB e proliferação /haste vias celulares tinha sobrevivência significativamente mais curta em comparação com os pacientes com baixos níveis de activação de ambos NF-kB e proliferação /haste vias celulares (p = 0,0399 e p = 0,0109 para as coortes 1 e 2 respectivamente, Figura 5D).

a activação da via /β-catenina Wnt foi significativamente associada à sobrevida do paciente na coorte 1, (p = 0,0056, Figura 5C) mas não na coorte 2 (p = 0,0693, Figura 5C). No entanto, os pacientes em coortes 1 e 2 com níveis elevados de activação de ambos Wnt /β-catenina e a proliferação /haste vias celulares tinha sobrevivência significativamente pior em comparação com os pacientes com níveis de baixa activação de ambas as vias (p = 0,0073 e p = 0,0086, Figura 5E ). Para aferir as contribuições das combinações da via com base em critérios histopatológicos conhecidos, foi realizada uma análise multivariada incluindo previsões da via combinados e estágio do tumor patológico (classificação TNM: Estágios 1-4), o fator prognóstico mais importante no GC [28]. Em ambos os grupos, a activação combinada de proliferação /célula estaminal e vias de NF-kB provou ser um factor independente de prognóstico de fase do tumor (p = 0,003 e 0,048 para as coortes 1 e 2, respectivamente) (Tabela S6). Da mesma forma, a ativação combinada de proliferação /Stem Cell e Wnt /β-catenina vias foi um fator prognóstico independente na coorte 1 e alcançou significância limítrofe na coorte 2 (p < 0,001 e p = 0,058, Tabela S7). Estes resultados demonstram que a avaliação do estado de ativação da via combinado é clinicamente relevante e, além disso, pode fornecer informação prognóstica adicional além e acima do padrão ouro atual de previsão prognóstico do paciente, o TNM com base estadiamento do tumor.

Discussão

neste estudo, buscou-se subdividir GCs em subgrupos molecularmente homogêneas como um primeiro passo para individualizar tratamentos de pacientes e melhorar os resultados. Importante, ao contrário de estudos GC microarray anteriores relativas padrões de expressão genética para histologia ou tipo anatômico [10], [11], optamos por basear nossas subdivisões GC sobre os padrões de atividade da via oncogénica. Depois de desenvolver e validar essa abordagem de classificação novela, fomos capazes de descrever, pela primeira vez, uma taxonomia genômico de GC com base em padrões de atividade da via oncogénica. A nossa abordagem é particularmente adequada para micromatrizes de expressão génica, uma vez que estas plataformas interrogar milhares de transcritos de ARNm em cada amostra, permitindo assim a avaliação de várias vias simultaneamente numa única experiência. Em contraste, uma tal abordagem não é actualmente possível ao nível da proteína, devido à falta de plataformas adequadas. Usando essa estratégia, foram identificadas três vias dominantes que mostram a ativação na maioria (> 70%) dos GC: a proliferação /célula estaminal, Wnt /β-catenina, e sinalização de NF-kB

A capacidade de executar. como "high-throughput via profiling" abre muitos caminhos interessantes. Por exemplo, vários estudos têm relatado anteriormente resultados inconsistentes sobre o impacto prognóstico das diferentes vias oncogênicas no GC - as implicações prognóstico dos antígenos relacionadas com a proliferação, tais como Ki-67 no GC não estão firmemente estabelecidas [29], e de alta activação de NF-kB em GC tem sido associada com bom e mau resultado GC paciente em diferentes estudos [7], [30]. É perfeitamente possível que algumas destas inconsistência pode ter sido devido a um foco no histórico utilizando métodos convencionais e análise de vias quer individuais ou componentes da via individuais (genes /proteínas). A nossa observação de que as combinações da via são preditivos de resultado para o paciente sugere que combinações caminho, em vez de percursos individuais sozinho, pode desempenhar um papel crítico em influenciar o comportamento do tumor.

Outra vantagem de high-throughput caminho perfil é a capacidade de definir relações de ordem superior entre vias distintas oncogénicos. No presente estudo, observou-se consistentemente a ativação concomitante de E2F, MYC, p21 (-repression), e haste percursos celulares em tumores (a '/célula estaminal proliferação "de fragmentação via). Isto é provavelmente devido a um aumento da proliferação celular nas células tumorais, como E2F é importante no controlo da proliferação celular e MYC é um tanto p21-repressora e indutor da ciclina D2 e ​​dependente de ciclina de ligação proteína-quinase CksHs2 [31]. Além disso, as células, particularmente células estaminais embrionárias (CES) haste, também são conhecidos por apresentar elevadas taxas de proliferação de células [32]. Mais intrigante, também observamos estreita associação entre aparentemente funcionalmente diferentes vias, tais como β-catenina e SRC, bem como a inibição de HDAC e BRCA1. Tais padrões de co-ativação da via pode sugerir interações funcionais entre estas vias, que merecem ser mais estudada. Por exemplo, é possível que activado c-Src pode melhorar a expressão da via de sinalização Wnt [33]. Explorando as relações entre as vias que mostram a co-activação pode assim proporcionar informação valiosa em relação à capacidade de a célula cancerosa para coordenar a actividade de vias múltiplas.

Um terceiro benefício da abordagem via perfilamento é que facilita a identificação de grande vias relacionadas com a doença. Das vias analisados ​​neste estudo, a constatação de que a sinalização de NF-kB pode ser elevado em uma proporção significativa dos GCs merece alguma atenção como esta via tem sido relativamente pouco explorada em GC. Curiosamente, enquanto observamos uma diferença significativa em ambos p50 e p65 (as subunidades NF-kB) expressão genética entre /off GCCLs NF-kB /on e NF-kB, não observamos a expressão da proteína p50 diferencial ostensiva nestas linhas, em contrastar a p65 (Figura 4C). Isto pode ser devido a uma combinação de três razões. Em primeiro lugar, o intervalo absoluto da expressão do gene p65 ao longo das linhas de células é marcadamente maior do que o intervalo absoluto da expressão do gene p50 (> 3 ×, Figura S4). Em segundo lugar, o ensaio de Western blotting usado para realizar estas medições de proteína é conhecida por ser altamente não-quantitativa, o que pode mascarar diferenças subtis na expressão. Em terceiro lugar, além da expressão de genes, a expressão de p50 também está sujeita a uma variedade de mecanismos de regulação pós-transcricional, tais como clivagem de precursor que pode afectar o nível final de proteína p50, enquanto que o p65 não é gerada a partir de uma proteína precursora da [34]. NF-kB foi mostrado para ser activado por H. pylori
[35], um carcinogénio conhecido GC, e a sinalização de NF-kB também aberrante tem sido implicada em vários cancros ligados a inflamação, tais como CG [36]. NF-kB tem sido sugerido para ser constitutivamente activado em cancros gástricos primárias em alguns estudos [7]. Alvejados NF-kB inibidores estão actualmente a ser desenvolvido ativamente em muitos programas de desenvolvimento de drogas anticâncer e um subconjunto de pacientes do GC (ou seja, aqueles com elevada actividade de NF-kB) pode representar uma subclasse apropriada para avaliar a eficácia destes compostos.

o in silico
método utilizado em nosso estudo é conceitualmente similar ao trabalho do Bild et al, que usou um modelo de regressão binária para classificar os tumores com base na atividade prevista de cinco vias oncogênicas [9]. Ao contrário de regressão binária, a nossa abordagem, que faz uso de uma métrica conectividade baseada em classificação [37], não requer nenhum processo de formação elaborada em cada assinatura via e também não requer a disponibilidade de dados de expressão de matérias, facilitando o uso dos muitos disponíveis publicamente assinaturas pathway na literatura [27]. No entanto, a abordagem baseada na expressão do gene tem limitações. Primeiro, porque as nossas previsões da via são baseados na expressão de genes em vez de proteínas, tais previsões são substitutos reconhecidamente moleculares da atividade de sinalização da via verdade. Em segundo lugar, estamos atualmente limita a analisar conhecido vias oncogênicas previamente identificados na literatura. Em terceiro lugar, embora nós fomos capazes de utilizar assinaturas via de contextos muito diferentes de tecido para prever o estado de ativação da via, um exame dos exemplos do cancro da mama de prova de princípio iniciais revelaram que a associação do estado ER ao estrogênio capacidade de resposta como previsto utilizando a assinatura osteosarcoma , embora significativo, foi marcadamente mais fraca em comparação com a associação do estado de ER a sensibilidade tamoxifeno previsto utilizando uma assinatura derivada do mesmo tipo de tecido (ou seja, da mama). Este resultado implica que também podem existir diferenças específicas de tecidos em vias assinaturas que possam afectar a precisão da previsão. Em quarto lugar, em comparação com nosso estudo que incidiu sobre as vias de relevância biológica conhecida no GC, não está claro se este método pode ser aplicado para doenças onde o conhecimento prévio das vias envolvidas podem não estar disponíveis. No entanto, deve notar-se que uma grande quantidade de assinaturas da via (> 1000) associada com diversas vias bioquímicas e de sinalização já existe na literatura, o que pode ser acedido a partir de bases de dados públicas tais como MSigDB (http://www.broad.mit .edu /GSEA /msigdb /genesets.jsp? collection = CGP). Uma vez que a abordagem pode ser aplicado a praticamente qualquer conjunto de dados de doença para a qual a expressão do gene de informação está disponível, testando cada assinatura de um modo de elevado rendimento para a evidência de desregulação via é tanto concebível e possível. Em tais casos, caminho exibindo altas frequências de desregulamentação, então, representam caminhos candidatos envolvidos na doença em questão, que pode, então, ser alvo de investigação concentrada e experimentação. Abordar estas questões irão formar a base para muita pesquisa futura.

Em conclusão, temos demonstrado neste trabalho que as vias de assinaturas pode ser utilizado com sucesso para prever o estado de activação de vias de sinalização celular, mesmo em entidades biológicas tão complexos GC como um humano. Uma aplicação imediata óbvia de tais taxonomias baseadas em vias podem estar relacionados com o uso de terapias direcionadas. ensaios iniciais que avaliam o papel das terapias-alvo em GC demonstraram resultados modestos [38]; no entanto, a maioria desses estudos foram realizados sem que os pacientes pré-estratificação usando critérios moleculares ou histopatológicos.

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