PLoS Genetics: Onkogene Pathway Kombinationer forudsige klinisk Prognose i Gastric Cancer

Abstrakte

Mange solide kræftformer er kendt for at udvise en høj grad af heterogenitet i deres deregulering af forskellige onkogene veje. Vi søgte at identificere store onkogene veje i gastrisk cancer (GC) med betydelige relationer til patient overlevelse. Brug genekspression underskrifter, vi udtænkt en i silico
strategi for at kortlægge mønstre af onkogen-aktivering i 301 primære gastrisk kræft, den næsthøjeste årsag til den globale dødelighed af kræft. Vi identificerede tre onkogene pathways (proliferation /stamcelle, NF-KB, og Wnt /β-catenin) dereguleret i størstedelen (> 70%) af gastriske cancere. Vi funktionelt valideret disse pathway forudsigelser i et panel af gastriske cancercellelinier. Patient stratificering efter onkogene pathway kombinationer viste reproducerbare og signifikante overlevelse forskelle i flere kohorter, hvilket tyder på, at pathway interaktioner kan spille en vigtig rolle i at påvirke sygdommen adfærd. Individuelle GCS kan med held taxonomized af onkogen pathway aktivitet i biologisk og klinisk relevante undergrupper. Forudsigelse pathway aktivitet ved ekspression signaturer tillader således studiet af flere kræftrelaterede veje interagerende samtidigt i primære kræftformer, på en skala i øjeblikket ikke kan opnås ved andre platforme.

Author Summary

mavekræft er næsthyppigste årsag til den globale dødelighed af kræft. Med de nuværende behandlinger, mindre end en fjerdedel af patienterne overlever længere end fem år efter operationen. Individuelle gastrisk kræft er meget uensartede i deres cellulære egenskaber og reaktioner på standard kemoterapeutiske stoffer, hvilket gør mavekræft en kompleks sygdom. Pathway tilgange, snarere end enkelt gen studier, kan hjælpe med at opklare denne kompleksitet. Her vil vi gøre brug af en beregningsmæssige tilgang til at identificere forbindelser mellem molekylære veje og kræft profiler. I en storstilet undersøgelse af mere end 300 patienter, vi identificeret undergrupper af gastrisk kræft skelnes ved deres mønstre af kørsel molekylære veje. Vi viser, at disse identificerede undergrupper er klinisk relevant forudsige overlevelse varighed og kan være nyttig i at lede valget af målrettede behandlinger udformet til at interferere med disse molekylære veje. Vi identificerede også specifikke gastrisk cancer cellelinjer spejling disse pathway undergrupper, som skal lette den præ-kliniske vurdering af svarene til målrettede behandlinger i hver undergruppe

Henvisning:. Ooi CH, Ivanova T, Wu J, Lee M, Tan IB, Tao J, et al. (2009) onkogenisk Pathway Kombinationer forudsige klinisk Prognose i Gastric Cancer. PLoS Genet 5 (10): e1000676. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000676

Redaktør: Jason G. Mezey, Cornell University, USA

Modtaget den 22. april 2009; Accepteret: 3. september 2009; Udgivet: 2 okt 2009

Copyright: © 2009 Ooi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til PT fra BMRC 05/1/31/19/423, Singapore Cancer Syndicate SCS-BS0001, NMRC giver TCR /001/2007, og en hertug-NUS core tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den næststørste årsag til den globale kræft dødelighed [1]. Særligt udbredt i Asien, er de fleste GC patienter diagnosticeret med fremskreden sygdom [2]. Deregulering af kanoniske onkogene veje såsom E2F, K-RAS, p53, og Wnt /β-catenin signalering vides at forekomme med varierende frekvenser i GC [3] - [6], hvilket indikerer, at GC er en molekylært heterogen sygdom. Tidligere undersøgelser beskriver GC mangfoldighed i primære tumorer har typisk fokuseret på enkelte veje, måle kun en eller nogle få biomarkører pr eksperiment [4], [6], [7]. I modsætning hertil viser eksperimentelle beviser, at de fleste kræft fænotyper (ukontrolleret vækst, modstand til apoptose, osv) i høj grad styres ikke bare ved en enkelt veje, men komplekse samspil mellem flere pro- og anti-onkogene signalsystemer kredsløb [8]. Indsnævring denne kløft mellem de kliniske og eksperimentelle arenaer vil kræve strategier kan måle og vedrører aktivitet mønstre af flere onkogene veje samtidigt i primære tumorer.

Tidligere undersøgelser har foreslået at bruge genekspression signaturer til at forudsige aktiviteten af ​​oncogene veje i cancere [9] - her, vi den hypotese, at mønstre af oncogen-aktivering kunne anvendes til at udvikle et genomisk taksonomi af GC. Vigtigere er det, denne vej-centreret strategi adskiller sig væsentligt fra tidligere microarray studier beskriver udtryk ændringer i forbindelse med morfologiske og vævstype forskelle i GC [10], [11], som pathway underskrifter (snarere end individuelle gener) anvendes som grundlag for klassificering kræft . Vi udviklede en i silico
metode til at kortlægge aktivering niveauer af forskellige veje i kohorter af komplekse primær tumor profiler og valideret denne vej-rettet klassificering tilgang med proof-of-concept eksempler fra brystkræft. Vi anvendte derefter denne metode end GC at evaluere elleve onkogene pathways tidligere impliceret i gastrisk carcinogenese [3] - [7], [12] - [17]. I alt har vi analyseret over 300 primære GCS stammer fra tre uafhængige patientkohorter, udfører til vores bedste overbevisning den største genomisk analyse af GC til dato. Vi identificerede tre onkogene veje (nuklear faktor-KB (NF-KB), Wnt /β-catenin, og proliferation /stamcelle), der blev dereguleret i langt de fleste (> 70%) af GC'er og funktionelt valideret pathway forudsigelser in vitro
anvendelse af et panel af GC cellelinier. Selvom patienten lagdeling på de enkelte veje ikke konsekvent demonstrere væsentlige forskelle i kliniske resultater, patient lagdeling ved onkogene pathway kombinationer (f.eks høj spredning /høj NF-KB vs. lav spredning /lav NF-KB) viste reproducerbare og signifikante overlevelse forskelle i flere uafhængige patientkohorter, hvilket tyder på en kritisk rolle for pathway kombinationer påvirke GC klinisk adfærd. Vores resultater dermed vise, at GC'er held kan taxonomized hjælp onkogen pathway aktivitet i biologisk, funktionelt, og klinisk relevant undertyper.

Resultater

Forudsigelse Pathway Aktivering i Cancer Gene Expression Profiles

Vores strategi til at forudsige niveauer af onkogen-aktivering i kræft involverer fire trin (figur 1A). Først, vi definerede 'pathway underskrifter "- sæt af gener udviser ændret ekspression efter funktionel forstyrrelse af en bestemt vej i en veldefineret in vitro
eller in vivo
eksperimentelle system. For det andet, vi kortlagt pathway underskrifter onto genekspressionsprofiler fra en heterogen række kræftformer. For det tredje, ved hjælp af en ikke-parametrisk, rang-baserede mønstertilpasning procedure, blev aktivering scores tildelt individuelle kræft baseret på styrken af ​​foreningen til vejen signatur. Endelig blev de enkelte kræftformer sorteres på deres vej aktivering scoringer.

Før du anvender denne tilgang til GC, vi fandt det vigtigt at validere dette i silico
strategi i en serie af proof-of -princippet eksperimenter. Vi valgte eksempel for brystkræft, en malignitet, hvor der er rigeligt med beviser på vej heterogenitet og diskrete 'molekylære undertyper "[18]. For at udføre denne validering, vi først spurgte, om tidligere beskrevne pathway signaturer forbundet med nedsat østrogen signalering kunne bruges til at identificere brystkræft cellelinier udviser høje niveauer af østrogen receptor (ER) aktivitet. Vi analyserede en genekspression panel af 51 brystcancercellelinier oprindeligt beskrevet i Neve et al. [18] med en 11-gen "tamoxifen følsomhed" pathway signatur stammer fra en liste af gener udtrykkes differentielt mellem MACA 3366, en tamoxifen-sensitive human mammae carcinoma xenograft, og MACA 3366 /TAM, en tamoxifen-resistent sublinie af samme xenograft [19]. Vi fandt, at brystkræft cellelinier positivt associeret med tamoxifen følsomhed signatur udviste signifikant højere ekspressionsniveauer af ESR1
, østrogenreceptoren og molekylære mål af tamoxifen, sammenlignet med linjer viser negative pathway aktivering score (p = 2,12 × 10 ^{-7, Accuracy 84,3%, Følsomhed 100%, Specificitet 75%) (figur 1B og tabel S1).}

For det andet, vi testede, om en sti signatur i forbindelse med østrogen signalering men stammer fra ikke- brystvæv kunne også anvendes til at lagdele det samme panel af brystcancercellelinier. Vi forespørges brystcancercellelinie panel med en 41-gen "østrogen respons" signatur stammer fra en liste af gener opregulerede ved estradiol i U2OS humane osteosarcomceller [20]. Trods signaturen stammer fra en anden vævstype (f.eks osteosarcom), vi igen konstateret, at når sorteret baseret på deres forudsagte østrogen lydhørhed, brystcancercellelinier grupperet sammen ved deres niveau af ESR1
(østrogenreceptor) ekspression (p = 0,0035, Nøjagtighed 62,7%, Sensitivity 94,7%, Specificitet 43,8%) (figur 1C og tabel S1). Disse resultater viser, at det faktisk er muligt at forudsige mønstre af-aktivering i en bestemt cancer af interesse (mavekræft i vores tilfælde) ved hjælp af udtryk underskrifter opnået fra forskellige eksperimentelle betingelser og endda forskellige vævstyper.

Mønstre af oncogen pathway Aktivering i GC

Efter validering denne vej forudsigelse tilgang, vi fortsatte med at anvende den strategi til primær GC. Stedet for at teste alle mulige vej, valgte vi elleve onkogene og tumor suppressor pathways tidligere impliceret i gastrisk carcinogenese, ved anvendelse i analysen RAS [4], p53 [5], BRCA1 [12], p21 [13], Wnt /β-catenin [6], E2F [3], SRC [14], MYC [15], NF-KB [21], histondeacetylering (HDAC) [16], og stamceller relaterede signaturer [17]. Når det er muligt, vi har forsøgt at vælge flere signaturer for hver vej, fortrinsvis fra uafhængige offentliggjorte undersøgelser. For eksempel af de to E2F aktivering underskrifter, der anvendes i vores tilgang, blev én signatur opnået ved at inducere E2F1-aktivitet i rotte-fibroblast-celler [22], mens den anden signatur blev opnået under anvendelse af et osteosarkom-afledt cellelinje indeholdende en inducerbar ER-E2F1-fusionsprotein [23]. Endelige pathway forudsigelser for yderligere analyser blev typisk opnås ved at kombinere de enkelte signaturer tilhører samme vej (se materialer og metoder).

Vi beregnede aktivering scorer for de elleve veje repræsenteret ved 20 pathway signaturer på tværs af tre uafhængige grupper af primær GCS afledt fra Australien (Kohorte 1-70 tumorer), Singapore (Kohorte 2-200 tumorer), og det Forenede Kongerige (Kohorte 3-31 tumorer). At visualisere mønstre af baneaktivering, vi afbildet hver kohorte som Heatmap, hvor Heatmap farve repræsenterer den forudsagte styrken af ​​aktivering for hver pathway i den enkelte GC'er. Vi observerede en betydelig heterogenitet pathway aktivering mellem individuelle GC patienter (figur 2A-2C). Men underskrifter afledt af uafhængige undersøgelser, der repræsenterer tilsvarende veje ofte gav tilsvarende forudsigelse mønstre (f.eks NF-KB (hud) og NF-KB (livmoderhalsen)), og en chi-square test bekræftede en betydelig grad af lighed i de overordnede mønstre af sti aktivering mellem Australien og Singapore kohorter (p = 0,00038), og mellem Australien og UK kohorter (p = 0,00051, se tabel S2) tyder på, at GC pathway forudsigelser ikke er bundet til en bestemt patient kohorte. Vi identificerede to store klynger af co-aktiverede veje, som blev fuldstændigt bevarede i Kohorter 1 og 2 (figur 2A og 2B) og for det meste konserveret i Cohort 3 (figur 2C). Disse omfattede (i) en "proliferation /stamcelle 'pathway klynge (brun lodret streg i figur 2) omfatter veje, der er forbundet med forskellige cellecyklus regulatorer (fx MYC, E2F, p21) og stamceller signaturer; og (ii) en »onkogen signalering 'pathway klynge (grå lodret streg i figur 2), mange forskellige onkogene veje (BRCA1, NF-KB, p53, Wnt /β-catenin, SRC, RAS, og HDAC pathways).

In vitro
Validering af pathway Forudsigelser

Ved at analysere GC pathway heatmap i figur 2, valgte vi tre onkogene veje (NF-KB, Wnt /β-catenin, og spredning /stamcelle), der blev identificeret aktiveret i en væsentlig del af GC'ers (≥35%), og når de kombineres forudsat dækning af hovedparten (> 70%) af GC'ers. Spredning /stamcelle-pathways blev aktiveret i 40% af GCS i hver kohorte (interval: 38 til 43%), blev Wnt /β-catenin pathways aktiveret i 46% af GCS (interval: 43 til 48%), og NF- KB-pathway blev aktiveret i 39% af GC'ers (interval: 35 til 41%) (farve søjler under hver heatmap i figur 2). Disse frekvenser og andre ofte deregulerede veje (f.eks p53) er anført i tabel S3.

For at eksperimentelt validere disse primære GC pathway forudsigelser, vi anvendte vejen forudsigelse algoritme til et panel af 25 GC cellelinier (GCCLs) ( figur 3). Svarende til primær GC, blev 'proliferation /stamcelle "og" onkogen signalering' pathway klynger også observeret i GCCLs. Endvidere signaturer repræsenterer den samme vej, men fremstillet af forskellige undersøgelser, såsom de to uafhængige MYC-afledte signaturer [9], [24] også grupperet sammen i GC cellelinier efter ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse (lilla parenteser i figur 3). Styret af vejen forudsigelser, vi identificeret specifikke GC cellelinjer udviser mønstre af onkogen pathway aktivitet spejling primær GC'ers. Tilliden til valg af bestemte cellelinier som in vitro
modeller blev også opnået ved at gentage forudsigelse procedure syv gange ved hjælp af forskellige referenceprofiler, der spænder fra medianen GCCL profil til uafhængige profiler såsom ikke-malign normal mave profiler (se Materialer og Metoder og tabel S4). Parvise sammenligninger bekræftede, at to referenceprofiler var mere tilbøjelige til at producere samstemmende pathway forudsigelser end modstridende forudsigelser (Tekst S1 og Tabel S4). Nogle eksempler på repræsentative linjer omfatter AZ521 og MKN28 celler, som udviser aktivering af proliferation /stamceller veje, YCC3 og AGS celler for Wnt /β-catenin veje, og MKN1 og SNU5 celler til NF-KB-vejen.

først vi direkte målte de proliferative satser på 22 GCCLs og korreleret proliferationshastigheden data med middelværdien aktivering score fra underskrifter i proliferation /stamcelle pathway klynge. Der var en signifikant sammenhæng mellem de eksperimentelt bestemte proliferative satser og de-aktivering scores (R = 0,4688, p = 0,0278) (Figur 4A). Støtte til forestillingen om, at onkogene pathway signaturer er overlegne prædiktorer for pathway aktivitet sammenlignet med ekspression af enkelte vigtige pathway gener, blev ingen signifikante associationer observeret for enten MYC eller E2F1 udtryk (p = 0,48 og 0,38 for MYC og E2F1 henholdsvis) (Figur S1 ).

for det andet, for at validere de Wnt /β-catenin pathway forudsigelser, vi analyserede udtryk for forskellige Wnt pathway komponenter (β-catenin, TCF4) og relative niveauer af TCF /LEF transkriptionsaktivitet i GC cellelinjer forventes at være Wnt /β-catenin- aktiveret eller Wnt /β-catenin-ikke-aktiverede. Af syv cellelinier udvalgt for deres eksperimentelle sporbarhed (f.eks nem transfektion og bekvem vækstbetingelser), fandt vi, at både β-catenin og TCF /LEF transkriptionsfaktor TCF4 (også kendt som TCF7L2), væsentlige komponenter i Wnt signalvejen, blev udtrykt i GC cellelinjer forudsagt af vejen aktivering analyser at have høj Wnt /β-catenin aktivitet (AGS, YCC3, Kato III, og NCI-N87), men ikke til udtryk i to ud af tre linjer (SNU1 og SNU5) forbundet med inkonsistente eller lave Wnt /p-catenin aktivering scorer (figur 4B). Endvidere med henblik på direkte analyse Wnt pathway aktivitet, bestemte vi TCF /LEF transskriptionel aktivitet i GC cellelinjer under anvendelse Topflash, en luciferase udtrykkende plasmid indeholdende multimeriserede TCF-bindingssteder. Den Topflash assay bekræftede høj TCF /LEF transkriptionsaktivitet i tre ud af fire GC cellelinjer forudsiges at have høj Wnt /β-catenin-aktivitet (AGS, YCC3, og Kato III), men minimal eller ingen Topflash aktivitet i GC-cellelinier forbundet med inkonsistente eller lav Wnt /β-catenin aktivering scores (SNU1, SNU5, og SNU16). Derudover β-catenin-aktivering scoringer var signifikant højere i GCCLs med mere end to-fold TCF /LEF transkriptionelle aktivitet (AGS, YCC3, Kato III, og NCI-N87) end i GCCLs med lavere TCF /LEF transkriptionel aktivitet (p = 0,007, figur 4B). Sammenlignet mod enkelte gener, overlegen foreninger til TCF /LEF transkriptionsaktivitet blev igen observeret anvendelse af den gennemsnitlige aktivering score fra Wnt /β-catenin underskrifter i forhold til enten β-catenin eller TCF4 (aka TCF7L2) udtryk alene (p = 0,038 for underskrifter vs p = 0,31 og 0,58 for β-catenin og TCF4 henholdsvis) (Figur S1).

for det tredje, at validere NF-KB pathway forudsigelser, valgte vi 11 GCCLs konsekvent forudsagt som enten NF-κB- aktiveret ( 'NF-KB /om', seks GCCLs) eller NF-KB-ikke-aktiverede ( 'NF-KB /off', fem GCCLs) (Figur S2). Forøget genekspression af p50 og p65, de NF-KB heterodimere underenheder, blev observeret i NF-KB /på GC cellelinjer sammenlignet med NF-KB /off GC cellelinjer (p = 0,0002 for p50, p = 0,046 for p65, figur 4C) og på proteinniveau p65 ekspression blev observeret i vid udstrækning i NF-KB /på strækninger (figur 4C). Brug immunocytokemi på formalin fast paraffin indlejret GC cellelinjer, blev p65 protein-ekspression observeret hyppigere i NF-KB /på GC cellelinjer i forhold til NF-KB /off GC cellelinjer i form af nukleare sublokalisering, procentdele af celler med farvning (enten nukleare eller cytoplasmatisk), og farvning intensitet (tabel S5, figur S3). For at bestemme om NF-KB /på GC-cellelinier udviste også differentiel ekspression af p65-regulerede gener sammenlignet med NF-KB /off GC cellelinjer, vi kombinerede listen af ​​gener direkte bundet af p65 transkriptionsfaktor [25] med lister over gener reguleret på mRNA-niveauet af TNF-α [26], en kendt inducer af NF-KB-aktivering. Brug Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, [27]), fandt vi, at p65 målgener opreguleres af TNF-α behandling var signifikant overudtrykt i NF-KB /på GC cellelinjer sammenlignet med NF-KB /off GC cellelinjer (normaliseret berigelse score, NES = 1,86; falsk opdagelse sats, FDR < 0,001, bund mest panel, figur 4C). Omvendt blev p65 målgener nedreguleres af TNF-α betydeligt underexpressed i NF-KB /på GC cellelinjer i forhold til NF-KB /off GC cellelinjer (NES = -1,56, FDR = 0,019, bund mest panel, figur 4C). Endelig direkte at bekræfte tilstedeværelsen af ​​forhøjet NF-KB-aktivitet, transficerede vi tre NF-KB /på GC cellelinjer og to NF-KB /off GC cellelinier med en luciferase reporter indeholdende et NF-KB-reportergenet. Som vist i figur 4D, de tre NF-KB /på GC-cellelinier udviste forhøjet NF-KB transkriptionel aktivitet sammenlignet med de to NF-KB /off GC cellelinier (p = 0,0084).

Taget under et, disse resultater understøtter det koncept, at i silico
pathway forudsigelser ved hjælp genekspressionsprofiler er forbundet med aktivering af den relevante sti in vitro
.

pathway Kombinationer Forudsige Gastric Cancer Patient overlevelse

for at vurdere den kliniske relevans af de identificerede pathway undergrupper, undersøgte vi, hvis mønstre af sti co-aktivering som illustreret i heatmaps de forskellige årgange kan være relateret til patientens overlevelse. Vi brugte overordnede overlevelsesdata fra Kohorte 1 og Kohorte 2 og lagdelte patienter ved deres forudsagte mønstre af-aktivering. En primær GC profil blev defineret som viser højt aktivering niveau af en sti, når aktiveringen score var over nul - dvs. bliver positivt associeret med vejen signatur. Patientgrupper stratificeret ved enten spredning /stamcelle-aktivering score alene eller NF-KB-aktivering score alene ikke adskiller sig væsentligt med hensyn til deres samlede overlevelse (p > 0,05 for proliferation /stamcelle og NF-KB i begge kohorter, 5A og 5B). Men når baneaktivering scoringer blev kombineret, patienter med høje aktivering niveauer af både NF-KB og proliferation /stamcelle veje havde signifikant kortere overlevelse end patienter med lave aktivering niveauer af både NF-KB og proliferation /stamcelle pathways (p = 0,0399 og p = 0,0109 for Kohorter 1 og 2, figur 5D).

Aktivering af Wnt /β-catenin pathway var signifikant associeret med patientens overlevelse i Cohort 1, (p = 0,0056, figur 5C) men ikke i Cohort 2 (p = 0,0693, figur 5C). Patienter i Kohorter 1 og 2 med høje aktivering niveauer af både Wnt /β-catenin og proliferation /stamcelle veje havde signifikant dårligere overlevelse end patienter med lave aktivering niveauer af begge pathways (p = 0,0073 og p = 0,0086, figur 5E ). Til benchmark bidragene fra de pathway kombinationer mod kendte histopatologiske kriterier, vi udførte en multivariat analyse, herunder kombineret pathway forudsigelser og patologisk tumor stadie (TNM klassifikation: iscenesætter 1-4), den vigtigste prognostiske faktor i GC [28]. I begge kohorter, kombineret aktivering af proliferation /stamcelle og NF-KB veje viste sig at være en prognostisk faktor uafhængig af tumor stadie (p = 0,003 og 0,048 for Kohorter 1 og 2, henholdsvis) (tabel S6). Ligeledes kombineret aktivering af proliferation /stamcelle og Wnt /β-catenin veje var en uafhængig prognostisk faktor i Kohorte 1 og opnåede borderline signifikans i Kohorte 2 (p < 0,001 og p = 0,058, tabel S7). Disse resultater viser, at vurderingen af ​​den kombinerede vej aktivering status er klinisk relevant og desuden kan give yderligere prognostisk information ud over den nuværende guldstandarden af ​​patientens prognose forudsigelse, TNM baseret tumor iscenesættelse.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi søgte at opdele GC'er ind molekylært homogene undergrupper som et første skridt til at individualisere patientbehandling og forbedre resultaterne. Vigtigere er det, i modsætning til tidligere GC microarray undersøgelser vedrørende genekspression mønstre til histologi eller anatomiske form [10], [11], valgte vi at basere vores GC underafdelinger på mønstre af onkogen pathway aktivitet. Efter at udvikle og validere denne roman klassifikation tilgang, var vi i stand til at beskrive, for første gang, en genomisk taksonomi af GC baseret på mønstre af onkogen pathway aktivitet. Vores tilgang er særlig egnet til genekspression microarrays, da disse platforme afhøre tusindvis af mRNA-transkripter i hver prøve, hvilket tillader vurdering af flere veje samtidigt i et enkelt eksperiment. I modsætning hertil vil en sådan fremgangsmåde er ikke i øjeblikket muligt på proteinniveauet grund af mangel på egnede platforme. Ved hjælp af denne strategi, vi identificeret tre dominerende veje viser aktivering i de fleste (> 70%) af GCS: celle, Wnt /β-catenin, og NF-KB-signalering proliferation /dæmme

Evnen til at udføre. sådanne "high-throughput pathway profilering" åbner mange interessante muligheder. For eksempel har flere undersøgelser tidligere rapporteret inkonsistente resultater med hensyn til prognostiske virkning af forskellige onkogene pathways i GC - de prognostiske implikationer af spredningsrelaterede antigener, såsom Ki-67 i GC er ikke fast etableret [29], og high NF-KB-aktivering i GC er blevet forbundet med både gode og dårlige GC patient resultat i forskellige undersøgelser [7], [30]. Det er meget muligt, at nogle af denne uoverensstemmelse kan have været på grund af en historisk fokus på at anvende konventionelle fremgangsmåder og analysere enten enkelte veje eller individuelle pathway komponenter (gener /proteiner). Vores observation, at pathway kombinationer er prædiktive for patientresultatet antyder, at pathway kombinationer, snarere end enkelte veje alene kan spille en kritisk rolle i at påvirke tumor adfærd.

En anden fordel ved high-throughput pathway profilering er evnen til at definere højere orden relationer mellem distinkte oncogene pathways. I den aktuelle undersøgelse, vi konsekvent observeret samtidig aktivering af E2F, MYC, p21 (-repression), og stamceller veje i tumorer (den "proliferation /stamcelle 'pathway klynge). Dette er mest sandsynligt på grund af forøget cellulær proliferation i tumorceller, som E2F er vigtig i celleproliferation kontrol og MYC er både en p21-repressor og inducer af cyclin D2 og cyclin-afhængig kinase protein CksHs2 [31]. Endvidere stamceller, især embryonale stamceller (EKSF), er også kendt for at udvise høj celledeling satser [32]. Flere interessante, vi også observeret nære forbindelser mellem tilsyneladende funktionelt forskellige veje, såsom β-catenin og SRC, samt HDAC-inhibering og BRCA1. Sådanne vej co-aktivering mønstre kan foreslå funktionelle interaktioner mellem disse veje, som fortjener at blive undersøgt yderligere. For eksempel er det muligt, at aktiveret c-SRC kan øge ekspressionen af ​​Wnt signalvejen [33]. Exploring forholdet mellem veje viser co-aktivering kan således tilvejebringe værdifulde oplysninger om evne cancercellen at koordinere aktiviteten af ​​flere veje.

En tredje fordel ved pathway profilering tilgang er, at det letter identifikationen af ​​større sygdomsrelaterede pathways. Af de analyserede i denne undersøgelse veje, konstateringen af, at NF-KB-signalering kan være forhøjet i en betydelig del af GC'ers fortjener en vis opmærksomhed, da denne vej er blevet relativt mindre udforsket i GC. Interessant, mens vi observeret en signifikant forskel i både p50 og p65 (NF-KB-underenheder) genekspression mellem NF-KB /on og NF-KB /off GCCLs, vi ikke observere åbenlys differentiel p50-proteinekspression i disse linjer, i kontrast til p65 (figur 4C). Dette kan skyldes en kombination af tre grunde. Først, den absolutte vifte af p65-genekspression tværs cellelinierne er væsentlig større end den absolutte vifte af p50-genekspression (> 3 ×, fig S4). For det andet er Western blotting assay anvendt til at udføre disse protein målinger kendt for at være særdeles ikke-kvantitativ, som kan maskere subtile forskelle i ekspression. For det tredje, ud over genekspression, p50 udtryk er også genstand for en bred vifte af post-transkriptionelle reguleringsmekanismer som forløber spaltning, der kan påvirke det endelige niveau for p50 protein, mens p65 ikke er genereret fra en forløber protein [34]. NF-KB er blevet vist at blive aktiveret af H. pylori
[35], en kendt GC carcinogen, og afvigende NF-KB-signalering har også været impliceret i flere inflammations-linked cancere, såsom GC [36]. NF-KB er blevet foreslået at være konstitutivt aktiveret i primære gastriske cancere i et par undersøgelser [7]. Målrettede NF-KB-hæmmere i øjeblikket aktivt udviklet i mange udviklingsprogrammer anticancer narkotika og en delmængde af GC patienter (dvs. dem med forhøjet NF-KB-aktivitet) kan udgøre en egnet underklasse til at evaluere effekten af ​​disse forbindelser.

i silico
anvendte metode i vores undersøgelse er begrebsmæssigt ligner arbejde Bild et al, som anvendte en binær regressionsmodel at klassificere tumorer baseret på den forudsagte aktivitet af fem onkogene veje [9]. I modsætning til binær regression, vores tilgang, som gør brug af en rang-baserede konnektivitet metriske [37], kræver ingen detaljeret uddannelse proces på hver vej underskrift og også ikke kræver tilgængeligheden af ​​rå udtryk data, fremme brugen af ​​de mange offentligt tilgængelige pathway signaturer i litteraturen [27]. genekspression tilgang har dog begrænsninger. Først, fordi vores pathway forudsigelser er baseret på genekspression snarere end proteiner, sådanne forudsigelser er ganske vist molekylære surrogater for sand pathway signaleringsaktivitet. For det andet, er vi i øjeblikket begrænset til at analysere kendte onkogene veje tidligere identificerede i litteraturen. For det tredje, selv om vi var i stand til at bruge pathway signaturer fra meget forskellige væv sammenhænge til at forudsige pathway aktivering status, en undersøgelse af de indledende brystkræft eksempler proof-of-princippet afslørede, at foreningen af ​​ER status til østrogen lydhørhed som forudsagt ved hjælp af osteosarkom signatur er den betragtelige var markant svagere i forhold til foreningen af ​​eR status til tamoxifen følsomhed forudsiges ved hjælp af en signatur afledt af den samme vævstype (dvs. bryst). Dette resultat indebærer, at der også kan eksistere vævsspecifikke forskelle i pathway signaturer, der kan påvirke forudsigelse nøjagtighed. Fjerde, i forhold til vores undersøgelse, som fokuserede på veje med kendt biologisk relevans i GC, er det uklart, om denne metode kan anvendes på sygdomme, hvor forudgående kendskab involverede veje måske ikke er tilgængelige. Dog skal det bemærkes, at et væld af pathway signaturer (> 1000) i forbindelse med diverse biokemiske og signalveje allerede findes i litteraturen, som kan tilgås fra offentlige databaser såsom MSigDB (http://www.broad.mit .edu /gsea /msigdb /genesets.jsp? kollektion = CGP). Da vores tilgang kan anvendes på praktisk talt ethvert sygdoms datasæt for hvilken genekspression oplysninger, afprøve hvert signatur i en high-throughput måde for tegn på vej deregulering er både tænkeligt og muligt. I sådanne tilfælde vil pathway udstiller høje frekvenser af deregulering derefter repræsentere kandidat veje er involveret i den pågældende sygdom, som derefter kan målrettes til målrettet efterforskning og eksperimenter. Håndtering af disse spørgsmål vil danne grundlag for megen fremtidig forskning.

Som konklusion, vi har vist i dette arbejde, som veje signaturer med held kan anvendes til at forudsige aktivering status af cellulære signalveje, selv i biologiske enheder som kompleks som en menneskelig GC. En oplagt øjeblikkelig anvendelse af sådanne pathway-baserede taksonomier kan vedrøre brugen af ​​målrettede behandlinger. Indledende forsøg vurdering rolle målrettede behandlinger i GC har vist kun beskedne resultater [38]; Men de fleste af disse undersøgelser er blevet udført uden pre-stratificering patienter ved hjælp af molekylære eller histopatologiske kriterier.

• PLoS ONE: Silencing af Claudin-11 er forbundet med øget invasivitet af mavekræft Cells
• PLoS ONE: afvigende ekspression af Cx43 er forbundet med peritoneal Metastase af mavekræft og Cx43-medieret Gap Junction Forbedrer Gastric Cancer Cell Diapedese fra Peritoneal Mesothelium