PLoS ONE: Variationen in Helicobacter pylori Cytotoxin-assoziierte Gene und deren Einfluss in der Progression zu Magenkrebs: Implikationen für die Prävention

Abstrakt

Helicobacter pylori
(HP) ist ein Bakterium, das den menschlichen Magen kolonisiert und kann eine langfristige Infektion der Magenschleimhaut etablieren. Persistent Hp-Infektion induziert häufig Gastritis und ist mit der Entwicklung von Magengeschwüre, atrophische Gastritis, und Adenokarzinom des Magens assoziiert. Virulente HP isoliert die cag (Cytotoxin-assoziierte Gene) Pathogenitätsinsel (cagPAI) Hafen, ein 40-kb-DNA-Abschnitt, die Komponenten eines Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) kodiert. Diese T4SS bildet eine Pilus für die Injektion von Virulenzfaktoren in Wirtszielzellen, wie beispielsweise die CagA Onkoprotein. Wir analysierten die genetische Variabilität in cagA Karten und andere ausgewählte Gene des HP cagPAI ( CAGC
, CAGE
, CAGL
, CAGT
, cagV
und cag Gamma
) unter Verwendung von DNA aus gefrorenem Magen-Biopsien entnommen oder aus klinischen Isolaten. Studienteilnehmer waren 95 CagA + Patienten, die mit histologisch diagnostiziert wurden, chronische Gastritis oder Magenkrebs in Venezuela und Mexiko, in Gebieten mit hoher Prävalenz der Hp-Infektion. Sequenzierungsreaktionen wurden sowohl von Sanger und nächsten Generation Pyrosequenzierung (454 Roche) Verfahren durchgeführt. Wir fanden insgesamt 381 Varianten mit eindeutigen Anrufe in mindestens 10% der ursprünglich getesteten Proben und Referenzstämmen beobachtet. Wir verglichen die Frequenzen dieser genetischen Varianten zwischen Magenkrebs und chronischer Gastritis Fällen. Sechsundzwanzig SNPs (11 nicht synonym und 14 auch) zeigte statistisch signifikante Unterschiede (P < 0,05) und zwei SNPs, in Position 1039 und 1041 von CAGE
, eine hoch signifikante Assoziation mit Krebs zeigte (p -Wert = 2,07 × 10 ^{-6), und die Variante Codon wurde in der VirB3 Homologie-Domäne von Agrobacterium
befindet. Die Ergebnisse dieser Studie vorläufigen Informationen liefern Antibiotika-Behandlung zu Personen mit hohem Risiko zu zielen, wenn Auswirkungen dieser Varianten in weiteren Untersuchungen bestätigt werden}

Citation. Rizzato C, Torres J, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S, Camorlinga-Ponce M, et al. (2012) Variationen in Helicobacter pylori Cytotoxin-assoziierte Gene und deren Einfluss in der Progression zu Magenkrebs: Implikationen für die Prävention. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10.1371 /journal.pone.0029605

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Empfangen: 6. Oktober 2011; Akzeptiert: 1. Dezember 2011; Veröffentlicht am: 3. Januar 2012

Copyright: © 2012 Rizzato et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. JT ist ein Empfänger einer Ausschließlichkeit Stipendium Fundacion IMSS, Mexiko. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Helicobacter pylori
(HP) ist eine der häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen beim Menschen. Es wurde geschätzt, dass mehr als die Hälfte der erwachsenen Bevölkerung in der Welt mit diesem Organismus infiziert ist [1]. Unter diesen sind etwa 10-15% der infizierten Personen geschätzt klinisch negativen Folgen zu erleben, Magengeschwüre, Adenokarzinom des Magens und Magenschleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe-Lymphom (MALT) einschließlich [2]. Bis heute trotz umfangreicher Bemühungen weltweit, was diese Variable klinischen Ergebnisse bestimmt, nicht vollständig aufgeklärt worden, aber angenommen, dass Kombinationen von Umwelt (zB Rauchen und Ernährung) [3], Host-Genetik und HP Virulenzfaktoren [3] zu sein, [4 ], [5]. Arbeit von uns [6] und andere unterstützen, dass bakterielle Faktoren sind wahrscheinlich die entscheidende Rolle [7] zu spielen, [8].

Das am besten charakterisierte HP Virulenzmarker ist das Cytotoxin-assoziierte Gen Pathogenitätsinsel (cagPAI ), ein 40 kb-Region der chromosomalen DNA, kodierend etwa 31 Gene, die einen Typ IV-Sekretionssystem (T4SS) bildet bakterielle Produkte in die Wirtszelle zu translozieren. cagA
liegt innerhalb cagPAI und ist verantwortlich für die meisten der HP-assoziiertes maligne Phänotypen: löst IL-8-Sekretion eine Entzündungsreaktion Grundieren, fördert die Zellproliferation, Streu- und Migration entweder durch Phosphorylierung-abhängige und unabhängige Mechanismen [ ,,,0],9], [10]. Die cagPAI ist in etwa 95% der ostasiatischen isoliert und es ist weniger häufig bei Isolaten aus niedrigem Risiko westlichen Ländern [11], [12], [13].

Viele der CagA-Funktionen befinden sich innerhalb einer C-terminal tandemartig angeordneten sich wiederholenden Motiv der Aminosäuren Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (Epiya Motive A, B, C und D) enthält. Die Stämme mehrere Kopien westlicher Art Epiya-C oder östlichen Typ Epiya-D beherbergen, werden vorgeschlagen, mehr mit Magenkrebs und mit einem erhöhten CagA in Verbindung gebracht werden In-vitro-Aktivität
[14], obwohl dies umstritten [15] ist . Bis heute, trotz der bekannten Variabilität in der N-terminalen cagA
Gen und andere Gene cagPAI Insel hat es sehr begrenzte Informationen über die klinische Relevanz von genetischen Varianten außerhalb des EPIYAs. Somit wird in diesem Papier versuchen wir, Varianten in den cagPAI Gene zu identifizieren CAGC
( HP0546
), CAGE
( HP0544
), CAGL
( HP0539
), cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
) und cag Gamma
( HP0523
) Gene, die als wichtige funktionelle Komponenten des Modells bakterielle T4SS benannt wurden, und sind dafür bekannt, extrazellulär für cagPAI Translokation Funktion oder Gegenwart von entscheidender Bedeutung sein, was auf eine mögliche Wechselwirkungen mit Wirtszellen; und in CagA,
deren Epiya Region wurde konsequent mit dem klinischen Ergebnis (Magenkrebs) korreliert [16].

cagA
Status allein reicht nicht aus, um vorherzusagen klinische Ergebnisse. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass HP Tilgung nur Magenkrebsinzidenz reduziert, ohne präkanzerösen Läsionen bei Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie können wertvolle Informationen Antibiotika-Behandlung zu Individuen mit hohem Risiko zu zielen, wenn Auswirkungen dieser Varianten in weiteren Untersuchungen bestätigt werden.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle Teilnehmer unterzeichnet eine fundierte schriftliche Zustimmung. Die Studie wurde von den ethischen Begutachtungsverfahren der Organe verantwortlich für Rekrutierungs in jeder der Rekrutierungszentren zugelassen.

Für mexikanische Proben, die Studie von Ethikkommissionen des Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) genehmigt wurde und General Hospital der Secretaria de Salud (SS), Mexiko-Stadt, Mexiko.

für venezolanischen Proben, ethischen Freiraum für die Studie wurde von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) Ethikkommission in Lyon erhalten, Frankreich und die Cancer Control Center in San Cristobal, Venezuela.

Studienpopulation

Venezuela.

Wir haben 11-DNA-Proben von Magen-Biopsien von Patienten mit chronischer Gastritis betroffen ohne Atrophie in einer Chemoprävention Studie in Venezuela rekrutiert [17], [18]. Die Probanden (Alter 35-69) in dieser Studie wurden von den Teilnehmern in der Magenkrebs-Kontrollprogramm von Tachira Staat eingestellt, die durch eine Gastroskopie Untersuchung folgte auf einem Magen-Doppelkontrast-Röntgen beruhte. Probanden mit jeder Krebs Magenkrebs einschließlich, oder mit anderen schweren Krankheiten wie Herz, Lunge, Niere oder Leberversagen und schwangere Frauen waren nicht förderfähig. Sieben Magen-Biopsien wurden aus vordefinierten Websites genommen, fünf für die histologische Auswertung und zwei wurden eingefroren für H pylori
DNA-Isolierung oder Kultur. Experten Pathologen in Neoplasien des Magens lesen histologischen Schnitten.

Mexiko.

84 Proben von Patienten waren die Gastroenterology Unit der México General Hospital (Secretaría de Salud) und der Onkologie Krankenhaus besucht ( Instituto Mexicano del Seguro Social), beide Krankenhäuser in Mexiko-Stadt. Fünfunddreißig Patienten wurden mit chronischer Gastritis und 49 mit Magenkrebs betroffen. Die Patienten waren älter als 30 Jahre, konsultiert wegen gastro-Symptome (General Hospital) oder wegen eines wahrscheinlichen Magenkrebs (Onkologie Hospital) und wurden für die Endoskopie und Biopsie für diagnostische Zwecke programmiert. Probanden, die zuvor Krebsbehandlung erhielten, wurden auf Antibiotika, Anti-HP-Therapie oder nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente zwei Wochen vor der Studie, oder hatten andere schwere chronische Erkrankungen wurden ausgeschlossen. Magen-Biopsien wurden in sterile 0,9% ige Kochsalzlösung gegeben, homogenisiert und auf Blut-Agar-Basis geimpft (BBL, MD) Platten, ergänzt mit 5% Schafblut für HP-Kultur. Die Platten wurden bei 37 ° C in einer 9% CO _{2 -Atmosphäre für 5 Tage inkubiert. HP wurde durch Kolonie und mikroskopische Morphologie und durch positive Oxidase, Katalase und Urease-Tests identifiziert. Von jedem primären Wachstum, 7 bis 10 jeweils einzelne Kolonien wurden aus dem Antrum und Corpus und vermehrt auf Blut-Agar-Medium isoliert. Für diese Studie untersuchten wir 43 Proben aus gezüchteten Stämmen und 41 direkt aus gefrorenen Biopsien.}

Die wichtigsten Merkmale der Bevölkerung sind in der Tabelle 1 beschrieben

DNA-Extraktion

Für venezolanischen und mexikanische Biopsie-Proben wurde die DNA aus gefrorenem Gewebe extrahiert mit QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für kultivierten Stämme wurde DNA unter Verwendung des Guanidinthiocyanat-EDTA-Sarkosyl (GES) Verfahren [19] gereinigt.

Primer-Design

Wir Ausrichtungen von HP-Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken verwendet, um Sequenzen zu identifizieren geeignet für Design von PCR-Primern. Wir beschränken unsere Datenbank sucht nach West Stämme von HP, die eher auf die gefundenen Stämme in unserer Studie Proben ähnlich. Wir haben geflieste Amplikons in einer Größe von 312 bis 876 bp. Die durchschnittliche Größe der Sequenz mit 454 liest Sequenzierungstechnologie 450 bp ist daher vorwärts liest und Rückwärts liest zumindest teilweise überlappen, wodurch die Zuverlässigkeit des Ausgangssignals zu verbessern. Fünf der cagA
Amplimere verwendet wurden bisher veröffentlicht [20], [21]. Alle verwendeten Primer für cagA
, CAGC, CAGE, CAGL, cagV, CAGT
und cag gamma
wurden zunächst in PCR-Reaktionen auf eine kleine Anzahl von Studie getesteten Proben ( n = 16) und die verstärkten Regionen mit Sanger-Technologie auf den gleichen Proben sequenziert wurden die Spezifität der Amplifikation (siehe Zusatz Tabelle S1 für Primersequenzen und PCR-Amplifikation Bedingungen) zu bestätigen.

Darüber hinaus haben wir, wie Referenz, drei Stämme 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) und G27 (NC_0011333), deren Genome vollständig sequenziert worden ist [22], [23], [24].

454 Sequenzierung

Einmal wurden PCR-Bedingungen optimiert, neu synthetisiert wir die gleichen Primer für die PCR mit Multiplex-Tags verwendet (verwendet Sequenzen aus jeder spezifischen Probe zu identifizieren) und Adapter, und verstärkt die Zielregionen DNAs von Proben verwendet wird. Eine zweite PCR wurde durchgeführt, die markierten Primer verwendet, um die Menge des Materials zu erhöhen. Alle Amplimere PCR wurden dann gereinigt, quantifiziert spektrophotometrisch und in äquimolaren Mengen vereinigt.

In der Bibliothek Generation für 454 FLX Sequenzierung wurde des Herstellers unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA). Kurz gesagt, die für die Verarbeitung und Sequenzierung benötigten Adapter des Herstellers wurden an die Enden von jedem Pool von markierten PCR-Produkte durch Ligatur hinzugefügt. Einzelmoleküle der PCR-Produkte, die richtigen Adapter tragen, wurden auf einzelne Kügelchen hybridisiert, amplifiziert klonal in einer nachfolgenden PCR-Emulsion und jeder Pool geladen auf ein 1/16 eines PicoTiterPlate zur Sequenzierung unter Verwendung des GS 454 FLX Titanium-Technologie. Nach der Verarbeitung und Basis Berufung des Herstellers proprietäre Software (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA, Software-Version 2.0.00 Oktober 2008) die resultierende nach sortiert wurden liest den vorge eingebaut sechs Basis-Tags. Genomic-Sequenzanalyse von 454 Technologie wurde durchgeführt, für diese HP mit >isoliert; 200-fach durchschnittliche Deckungsgrad (mindestens 59x, maximal 580x). Die resultierenden contigs wurden mit der Gensequenz von HP-Stamm 26695 [23] als Gerüst montiert. Wir haben keine wesentlichen Unterschiede in der Qualität der Ausgabe zwischen DNA aus kultivierten Stamm und DNA aus Biopsien beobachtet. Um die Qualitätskontrolle der Daten zu beurteilen, verglichen wir 454-Sequenzierungsdaten des Referenzstamm 26695 und der veröffentlichten Sequenz in NCBI-Datenbank (NC_000915); Konkordanz war über > 99%. Wir haben auch 9 venezolanischen Proben mit dem traditionellen Sanger-Sequenzierungsverfahren sequenziert, eine Konkordanz >beobachtet;. 99% zwischen Methoden

Sanger-Sequenzierung

Die cagA
N-terminal (630bp ), C-terminal (Position 2670 bis 3100) und Epiya Motive Region sowie CAGL
Gen durch das Sanger-Verfahren sequenziert wurden. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung BigDyeR Terminator Cycle Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) unter thermischen Bedingungen wie folgt durchgeführt: 96 ° C für 2 min und anschließend 27 Zyklen bei 96 ° C für 30 s, 54 ° C für 10 s und 60 ° C für 4 min. Die Reaktionsprodukte wurden mit 2-Propanol ausgefällt, mit 75% Ethanol gewaschen, in 25 &mgr; l Wasser verdünnt und auf einem ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Primäre Sequenzierungsdaten wurden unter Verwendung eines Sequenzanalyseprogramm (Applied Biosystems) analysiert.

Die bioinformatische und statistische Methoden

Raw-Sequenzen wurden automatisch mit der 454-Software analysiert und Qualitätswerte zugeordnet wurden. Die sich ergebende Sequenzierung Ausgabe, die er von 454 im SFF-Format und Sanger in abi-Format wurde mit multiplen Sequenz-Alignment-Software (zB die Plattform Geneious Software: http://www.geneious.com/) analysiert, die sich alle auf der zugehörige montiert liest gleiche Probe, dann Sequenzen aller Proben wurden mit einer Referenzsequenz und Single Nucleotide Polymorphismen ausgerichtet sowie kleine Insertionen und Deletionen wurden identifiziert. Um mögliche Artefakte aus Sequenzierung vermeiden und Varianten zu begrenzen, mit klinisch und statistisch aussagekräftige Frequenzen, wählten wir Varianten mit eindeutigen Anrufe in mindestens 10% für die auch beobachtet (N = 175) und 20% für nicht-synonymen (N = 206) Varianten des ursprünglich getesteten Proben und Referenzstämme (Gesamt 381).

SAS Version 9.2 wurde verwendet, um Logit- Odds Ratios (OR) und 95% Konfidenzintervall (CI) für Magenkrebs im Zusammenhang mit jeder Variante sowie zur Berechnung p schätzen -Werten für Unterschiede in der Variante Frequenzen zwischen Magenkrebs und Gastritis durch die exakte Fisher-Test (2-seitig). Bonferroni-Korrektur p-Werte angewendet wurde für multiple Vergleiche angepasst zu berechnen, indem rohe p-Werte mit 381.

Genetische Variabilität in sieben HP cagPAI Gene Dividieren

Eine Zusammenfassung der genetischen Variabilität in der detektierte sieben Gene ist in Tabelle 2 angegeben wie erwartet, stellten wir einen hohen Grad an Variabilität (berechnet als die Anzahl der Seiten eine Variante aus der Gesamtzahl von Seiten in einem Gen darstellt), die beide an der DNA und Aminosäureebene. Die Nukleotid-Variabilität lag im Bereich von 8,03% in cagV
auf 23,92% in CAGC
, während die Aminosäure Variabilität interessanter von 5,69% lag in CAGT
, zeigt den kleinsten Grad Variations, zu 31,01% in cagA
.

Wir verglichen die Frequenzen der 381 ausgewählten genetischen Varianten zwischen Magenkrebs und chronische Gastritis Fälle. Wir stellten fest, dann nicht auch (Tabelle 3) und auch (Tabelle 4) Varianten, die nennenswerte Unterschiede zwischen Gastritis und Krebserkrankungen zeigte, die einer der beiden folgenden Kriterien: (1) absolute Variante Frequenz zwischen Gastritis und Krebs Gruppen von mindestens 25% unterschieden; (2) -Variante Frequenz in Magenkrebs mindestens doppelt so hoch wie bei Gastritis und (3) Variante Frequenz in Gastritis mindestens doppelt so hoch wie in Magenkrebs. Fünfundzwanzig SNPs (11 nicht gleichbedeutend und 14 auch) erreicht statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05, Abbildung 1), befindet sich in cagA
, CAGE
, caggamma
und CAGL
wurden während keiner sich in CAGC
, CAGT oder in cagV
. Wir wendeten dann eine Studie weise Schwelle von p = 1,31 x 10 ^{-4 (0,05 /381) für multiple Vergleiche eingestellt und nur zwei SNPs, in Position 1039 und 1041 in CAGE
zeigte ein p-Wert unter dieser Schwelle. Ein SNP in der CAGE
Gen (Position 1905) zeigt einen p-Wert von 2,55 x 10 -4 sehr nah an der Studie weise statistische Signifikanz.}

cagA
Polymorphismen und Epiya Typen

die C-terminale Region (Positionen 2670 bis 3100) nach dem Schema sehr variabel in der klinischen Isolate war der Epiya Motive (Abbildung 2). Wir beobachteten 524 polymorphen Stellen, von denen wir 148 den Kriterien ausgewählt analysiert zuvor beschrieben (Gesamtkatalog von cagA
SNPs wird im Ergänzungsdatei S1 gezeigt). Interessanterweise zeigen zwei SNPs eine andere Wiederholung zwischen Gastritis und Krebserkrankungen mit p < 0,05, auch wenn sie signifikant aufgrund der großen Anzahl von Tests nicht statistisch betrachtet wurden; man eine nicht gleichbedeutend SNPs ist (A2033G bestimmen eine Änderung Aminosäure T /A, siehe Tabelle 3) und ein Synonym SNPs (A2547G, siehe Tabelle 4).

Die Analyse der Epiya Region bestätigt, dass alle Sequenzen waren von der westlichen Art cagA, dh ABC (82%), ABCC (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) und ABCCC (1%). Wir beobachten, nicht eine andere Verteilung dieser CagA-Typen zwischen den Krebs und Gastritis Fälle (p = 0,2342), detaillierte Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Abbildung 2. Wir beobachteten drei Varianten des Epiya Motiv: eine Gastritis Probe EPIYV hatte in einem ein Motiv, 50% der B-Motive zeigten die EPIYT Variante (keine statistische unterschiedliche Verteilung in der Krebstherapie und Gastritis Fall) und ein C-Motiv eines Krebs Fall eine EPLYA Variante zeigte.

Ergebnisse in den anderen cag
PAI Gene

Genetische Variabilität von CAGC CAGE
, CAGT, cagV
und cag Gamma
wurde durch 454 Sequenzierung beurteilt und von c AGL und Videos Sanger-Sequenzierung. Der gesamte Katalog von Polymorphismen in diesen sieben Gene beobachtet wird im Ergänzungsdatei S1 gezeigt.

Im CAGC
Gen entdeckten wir 83 SNPs, von denen 25 ausgewählt wurden, wie oben beschrieben. Keiner dieser SNPs zeigten eine unterschiedliche Verteilung zwischen Gastritis und Krebserkrankungen.

In der CAGE
Gen wir 308 polymorphen Stellen katalogisiert haben, 97 dieser Polymorphismen analysiert. C1039T und T1041G zeigten eine statistisch signifikante unterschiedliche Rezidiv zwischen Gastritis und Krebserkrankungen mit p = 9,97 x 10 ^{-6. Des Weiteren zeigte ein weiterer SNP T1905C eine andere Wiederholung mit einem p-Wert von 2,55 x 10 -4, die an der Studie weise Schwelle sehr nahe kommt. Neun weitere SNPs zeigen eine andere Wiederholung zwischen Gastritis und Krebserkrankungen mit p < 0,05, sechs auch Polymorphismen (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A und A2286G) und 3 nicht auch Varianten: A76C (Aminosäure-Wechsel von Lysin zu Glutamin), T1853C (Aminosäure-Änderung von Valin zu Alanin) und A2032G (Aminosäure-Änderung von Asparagin zu Asparaginsäure).}

Die C1039T Variante, wenn sie als einzige Änderung analysiert, sagt eine Aminosäureänderung von Lysin zu phenilalanine (Codonveränderung von CTT TTT), während die SNP T1041G an der dritten Position des gleichen Codon liegt, und wenn als einzige Änderung analysiert vorhergesagt eine Synonym-Variante (Codon CTT zu CTG ändern). Jedoch in allen Proben, die wir die beiden Allele Variante analysiert wurden zusammen beobachtet wird, beobachtet, daher wir nur zwei Variante Codons (CTT und TTG) kodierend für die gleiche Aminosäure, Lysin. Der T1905C Polymorphismus ist ein Synonym für Variante an der dritten Position des GTT-Codon (Variante Codon GTC), die Codes für Valine.

Im CAGL
Gen beobachteten wir 74 Polymorphismen und 24 davon wurden analysiert, 4 zeigte eine differentielle Verteilung zwischen den Fällen von Krebs und Gastritis (P < 0,05). Zwei von ihnen waren nicht synonym: G166A (Aminosäure-Änderung von Alanin zu Threonin) und A172G (Aminosäure-Änderung von Asparagin zu Asparaginsäure) und zwei synonym:. (A228G und C516T)

Im CAGT
Gen analysierten wir 23 der 81 Polymorphismen beobachtet, während in der cagV
Gen wir 11 der 61 Polymorphismen analysiert, und in beiden Genen keine der Polymorphismus eine unterschiedliche Verteilung zwischen Gastritis und Krebs Fälle zeigten.

im cag Gamma
Gen beobachteten wir 111 Polymorphismen, 53 davon wurden weiter analysiert und 4 synonym (A195TorC, T207A, C264T und A468G) und fünf nicht gleichbedeutend (A38G, C47G, A200 /201T, A367C und G457A) zeigte eine p <. 0,05 für die unterschiedliche Verteilung zwischen Gastritis und Krebserkrankungen (Abbildung 1)

Diskussion

Seit seiner Entdeckung im Jahr 1996 [25], die cagPAI, die die Virulenz-Gene von HP birgt, wurde wahrscheinlich am intensivsten Teil des HP-Genoms untersucht. Der Typ IV-Sekretionssystem codiert Proteine, die in das Zytoplasma der epithelialen Magenzelle eine nadelartige Struktur verbindet HP bilden die onkogene CagA Protein und Peptidoglycane einzuspritzen. Komponenten dieser Struktur umfassen a) pilus Komponenten CAGC (Homolog des Agrobacterium tumefaciens
VirB2) die Hauptextrazelluläre Struktur bilden, an dem die Spitze CAGL angebracht ist, mit β-1 Integrin zu interagieren; b) Kern komplexe Proteine, CagW (VirB6) CAGT (VirB7) CagV (VirB8) CagX (VirB9) und cagy (VirB10), die den inneren Kern des Pilus bilden; c) energetische Faktoren Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) und CAGE (VirB3 /VirB4), ATPasen Energie für das System liefern zu arbeiten [26]. In dieser Studie haben wir sequenziert CAGC
( HP0546
), CAGL
( HP0539
) von der Pilus, cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
) und cag Gamma
( HP0523
) aus dem Kernkomplex, und CAGE
( HP0544
) von der Energieversorgung Enzyme aus HP-Stämme isoliert von Gastritis und Magenkrebs-Patienten. Diese Gene wurden ausgewählt, weil ihre Produkte bekannt sind, für T4SS Funktion wesentlich zu sein und einige werden vorgestellt extrazellulär von H. pylori
(CagA, CAGL, CAGC), was darauf hindeutet, mögliche Wechselwirkungen mit der Wirtszelle [27].

Wir fanden die kleinste Variante, sowohl bei Nukleotid und Aminosäure-Ebene, in den inneren Kern T4SS Komponenten (CAGT , CagV und CAGE; 5,7%, 5,9% und 5,9% Aminosäurevariation, jeweils), und die größte Veränderung in den exponierten Komponenten: Integrin bindende Protein CAGL, extrazelluläre Pilus Hauptkomponente CAGC und sekretierte Protein CagA (12,2%, 23,5% und 31%, Aminosäurevariation, respectively). Diese Ergebnisse stützen, dass die genetische Variation in cagPAI Komponenten hauptsächlich durch ihre Lokalisation im T4SS beeinflusst wird, mit einer höheren Variation in Proteinen in der Bakterienoberfläche exponiert, vielleicht als Antwort auf immunologische Druck. Interessanterweise war Cag Gamma eine Ausnahme (19,5% Aminosäure variation), dieses Protein wurde vorgeschlagen, innerhalb der HP Periplasma zu befinden, in dem sie als Peptidoglycan-Hydrolase wirkt, Einstechen in die HP äußeren Membran und damit helfen, die T4SS Pilus an das externe Medium zu belichten [28]. Es ist möglich, dass Cag Gamma diese Funktion erfüllt auch als eine strukturelle Komponente des belichteten pilus, wo er auch über die Wirtszellmembran handeln könnte.

Studien aus Afrika [21], Italien [14], USA [ ,,,0],8] und Brasilien [29] haben einen Zusammenhang zwischen dem Anstieg der Zahl der Epiya C Motive und HP damit verbundenen Erkrankungen vorgeschlagen. Weiterhin Sicinschi et al. [30] beobachtet einen Zusammenhang zwischen erhöhten Epiya C-Segment und das Vorhandensein von Magen präkanzerösen Läsionen. Im Gegensatz dazu Studien in Kolumbien [8], [31], Mexiko (J. Torres, persönliche Mitteilung) und Korea [32] haben nicht eine solche Assoziation gefunden. In unserer Studie mehr als 80% aller Proben aus Mexiko und Venezuela waren vom Typ ABC, und keine Assoziation war offensichtlich zwischen Magenkrebs Progression und eine höhere Anzahl von Epiya C-Motive. Darüber hinaus haben die Bedeutung von Wertänderungen in Epiya B-Motiv für die Aktivität auf Epithelzellen neuere Studien [15] gezeigt, beobachteten wir vier nicht auch Variationen in diesem Motiv, aber diese Polymorphismen keinen Zusammenhang mit Magenkrebs zeigen.

Jüngste Studien haben berichtet, wichtige proinflammatorische und pro-onkogenen Aktivitäten von CagA, die der Epiya Motive unabhängig sind und die vielleicht genauso wichtig sein für Krankheit [30]; Diese Erkenntnisse könnten den Mangel an Vereinigung von C-Motive mit Krebs berichtet hier und in früheren Studien erklären. Der C-Anschluß des CagA Protein enthält auch das C-MET Motiv, das mehrere Funktionen zu haben, wurde vorgeschlagen: vermitteln CagA Multimerisierung und Membran-Targeting [33], [34], die Interaktion mit der Kinase Par1b /MARK2 [35], und alle diese Aktivitäten sind CagA-Phosphorylierung unabhängig [36]. Jedoch in unserer Studie haben wir keine signifikanten Unterschiede zwischen Gastritis und Magenkrebs, entweder in Sequenz oder in der Anzahl der Multimerisierung Motive finden.

Die C-terminalen und N-terminalen Domänen von CagA sind beide erforderlich auszunutzen die volle Aktivität des Proteins, obwohl sie unterschiedliche Funktionen. Kürzlich wurde gezeigt, daß der N-Terminus von CagA mit dem Tumorsuppressor Wechselwirkung tritt Apoptose-stimulierende Protein von p53 (ASPP2) [37].

Das Vorhandensein all dieser Wechselwirkungen zwischen CagA und Bakterien- und menschlicher Proteine ​​legen nahe, dass es könnte sehr schwierig sein, für das Bakterium das gesamte Spektrum der biologischen Aktivität in Gegenwart von hohen Mutationen zu erhalten, von denen die meisten vermutlich zum Verlust oder Dämpfung der Funktion führen.

Obwohl cagA
ist die beste etablierte cagPAI Virulenzmarker, cagA
Status allein reicht nicht aus, die klinischen Ergebnisse in Hochrisikogruppen vorherzusagen, wo die Mehrheit der HP sind cagA
-positiver Stämme. In diesem Zusammenhang Identifizierung neuer HP Molekular Virulenzmarker vorherzusagen Risiko von Magenkrebs wird sehr wichtig sein. Die jüngsten Fortschritte in der Genotypisierung Methodik ermöglicht es uns, DNA von Magen-Biopsien zu verwenden HP-Sequenz microvariabilities zu studieren, die in gezüchteten Stämmen untersucht fast ausschließlich wurden. Genotypisierung von einer höheren Anzahl von Magenproben erlaubt uns cagPAI Genvariante Erkennung zu anderen potentiell wichtige T4SS Gene zu erweitern. Dies ist relevant, da frühere Studien konzentrierten sich vor allem auf cagA
und die Nützlichkeit von anderen cagPAI Gene als Marker für das Krankheitsrisiko ist kaum untersucht. Nur wenige Studien haben für die Vereinigung der Anwesenheit von cagPAI Gene und Krankheit sah, und niemand untersucht Polymorphismen in cagPAI Gene, andere als CagA.

CAGE
ist eine einzigartige Gen, das zwei T4SS Komponenten VirB3 (N-terminal) und B4 (C-terminal) als ein Fusionsprotein [38] und B4 kodiert ist die größte ATPase unter mehreren T4SS Komponenten. Er erzeugt Energie für die Sekretion Verfahren, wodurch für die Substrat Translokation erforderlich ist [39] und interagiert mit vielen anderen Proteinen, einschließlich T4SS VirB2 [40]. Trotz seiner relativ inneren Lokalisierung, ihre zentrale Rolle bei der IL-8-Induktion wurde gut dokumentiert [41], [42], [43]. Interessanterweise beobachteten wir eine starke Assoziation zwischen zwei SNPs (C1039T und T1041G) des CAGE
und Magenkrebs, ein Befund bisher nicht berichtet. Diese SNPs sind in der Position eins und drei des gleichen Codon und wir beobachteten immer diese beiden Variante Codons (CTT und TTG), die für die gleiche Aminosäure kodieren, Lysin. Diese Variante wird in der Codon-Homologie-Domäne mit VirB3 von Agrobacterium
befindet. Die zweitstärkste Verein wurde in einem anderen Synonym SNP in Position 1905 und in diesem Fall die beiden möglichen Codons waren GTT und GTC, die für Valin nachgewiesen. Es hat sich für eine lange Zeit, dass alternative synonymen Kodons nicht verwendet werden mit der gleichen Frequenz und Muster der Codon-Nutzung variieren zwischen den Arten [44] bekannt. Codonverwendung ist vorgespannt in Genen in höheren Mengen exprimiert [45], [46]. Die Verwendung von optimalen Codons ermöglicht eine effizientere Verwendung von Ribosomen und führt zu einer schnelleren Wachstumsrate [47]. Obwohl das Genom von HP wurde berichtet für hoch exprimierte Gene keine Codon Bias enthalten [48], Kloster und Tang [49], um eine Vorspannung in der Expression von Genen identifiziert, in denen TTG-Codon über dem CTT-Codon bevorzugt ist, sowie das GTC-Codon über die GTT. Daher auf der Grundlage dieser Daten konnten wir diesen Unterschied in der Codon-Nutzung spekulieren können einen Einfluss auf die Höhe der Expression eines Gens mit einer starken funktionelle Bedeutung für das System T4SS Sekretion haben wie CAGE
.

CAGL ist eine spezialisierte Pilus-Protein, das bindet und aktiviert Integrin α5β1-Rezeptor auf Magenepithelzellen in erster Linie durch seine Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) -Motiv, richtige Positionierung der T4SS Führung und Erleichterung der Translokation von cagA [9], [50 ]. CAGL aktiviert auch die Wirtszelle Kinasen focal adhesion kinase (FAK) und Src CagA Phosphorylierung an der Stelle der Injektion zu gewährleisten, während β1 Integrin für CagA-induzierten Wirtszelle Motilität und Dehnung erforderlich ist [51]. CAGL kann auch für HP-induzierte hypochlorhydria durch Aktivierung eines Disintegrin und Metalloproteinase 17 und von NFkB [52] verantwortlich. Von den beiden CAGL
SNPs wir mit Magenkrebs assoziiert gefunden wird, wird die A172G SNP (N58D) in der gleichen Position, in der Yeh et al [53] haben gezeigt, dass die gleichzeitige Anwesenheit von Tyrosin in der Aminosäureposition 58 und Glutaminsäure in Position 59 (Y58E59) im Vergleich mit der Kombination Asparaginsäure (D58) und Lysin (K59), induziert effizienter einen corpus Verschiebung von Magen Integrin α5β1, die mit Magen-Karzinogenese bezogen wurde. Wir nicht beobachten die Tyrosin (Y) Aminosäure in Position 58 in jeder Probe, obwohl wir festgestellt, dass Träger von Asparaginsäure (D) an dieser Position bei niedrigeren Risiko von Magenkrebs im Vergleich mit dem Asparagin (N) Träger. Darüber hinaus beobachteten wir den Polymorphismus in Aminosäure 59 bei niedrigeren Frequenz und ohne irgendeinen Unterschied zwischen Krebs und Gastritis Proben.

In früheren Studien [54] Sequenzanalyse von cagGamma
Gen zeigte, dass es birgt eine typische SLT katalytische Domäne zwischen den Resten 33 und 165, deren "ES" und "AVGAY" Motive wurden unter den ortholog Enzyme hoch konserviert. Wir beobachteten fünf nicht-synonymen Varianten mit einer anderen Verteilung in der Krebstherapie und Gastritis Fälle. Drei dieser Karte in der katalytischen Domäne, doch keines von ihnen in den am stärksten konservierten Teile der Domäne befindet.

Obwohl diese Studie Einschränkungen in Probengröße hat, ist es die größte bisher in Bezug auf die Anzahl der cagPAI Gene für eine tiefe Sequenz untersucht analysiert. Einige Proben wurden aufgrund eines Fehlers in der PCR-Amplifikation verloren, was zu microvariabilities von HP-Sequenz zurückzuführen sein kann.

• PLoS ONE: Wirkungen von Interleukin-10 Polymorphismen, Helicobacter-pylori-Infektion und Rauchen auf das Risiko von noncardia Magenkrebs
• PLoS ONE: Die DNA-Reparatur-Gene APE1 T1349G Polymorphismus und Risiko von Magenkrebs in einem chinesischen Population