PLoS ONE: variações nos genes Helicobacter pylori Citotoxina-Associados e sua influência na progressão para o câncer gástrico: implicações para a prevenção

Abstract

Helicobacter pylori
(HP) é uma bactéria que coloniza o estômago humano e pode estabelecer uma infecção a longo prazo da mucosa gástrica. A infecção persistente Hp frequentemente induz gastrite e está associada com o desenvolvimento da doença de úlcera péptica, gastrite atrófica, e o adenocarcinoma gástrico. Virulenta HP isola abrigar a patogenicidade ilha cag (genes associados a citotoxina) (cagPAI), um estiramento de 40 kb de ADN que codifica para os componentes de um sistema de secreção de tipo IV (T4SS). Este T4SS forma um pilus para a injecção de factores de virulência em células alvo do hospedeiro, tais como CagA oncoproteína. Analisou-se a variabilidade genética em cagA
e outros genes selecionados da HP cagPAI ( CAGC
, gaiola
, CAGL
, cagT
, cagV
e cag Gamma
), utilizando DNA extraído de biópsias gástricas congelados ou a partir de isolados clínicos. Os sujeitos do estudo foram 95 pacientes cagA + que foram histologicamente com diagnóstico de gastrite crônica ou câncer gástrico na Venezuela e no México, áreas com alta prevalência de infecção por Hp. As reacções de sequenciação foram realizadas por ambos Sanger e pyrosequencing de próxima geração (454 Roche) métodos. Encontrámos um total de 381 variantes com chamadas inequívocas observadas em pelo menos 10% das amostras testadas inicialmente e estirpes de referência. Foram comparadas as frequências destas variantes genéticas entre câncer gástrico e casos de gastrite crônica. Vinte e seis SNPs (11 não-sinônimos e 14 sinónimo) mostrou diferenças estatisticamente significativas (P < 0,05), e dois SNPs, na posição 1039 e 1041 da gaiola
, mostrou uma associação altamente significativa com câncer (p -valor = 2,07 × 10 ^{-6), e o códon variante foi localizado no domínio de homologia VirB3 de Agrobacterium
. Os resultados deste estudo podem fornecer informações preliminares para direcionar o tratamento antibiótico para indivíduos de alto risco, se os efeitos dessas variantes são confirmados em outras investigações}

Citation:. Rizzato C, Torres J, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S, Ponce Camorlinga-H, et al. (2012) as variações nos genes Helicobacter pylori Citotoxina-Associados e sua influência na progressão para o câncer gástrico: implicações para a prevenção. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10.1371 /journal.pone.0029605

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 06 de outubro de 2011; Aceito: 01 de dezembro de 2011; Publicação: 03 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Rizzato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. JT é um destinatário de uma bolsa de exclusividade a partir Fundacion IMSS, México. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori
(HP) é um dos infecção bacteriana crônica mais comum em humanos. Estima-se que mais de metade da população adulta no mundo está infectado com este organismo [1]. Entre estes, aproximadamente 10-15% dos indivíduos infectados são estimados para experimentar sequelas clinicamente adverso, incluindo úlceras pépticas, o adenocarcinoma gástrico e linfoma do tecido linfóide associado à mucosa gástrica (MALT) [2]. Até à data, apesar de extensa esforço mundial, o que determina esses resultados clínicos variáveis ​​não foi completamente esclarecida, mas acredita-se ser combinações de ambiente (por exemplo, tabagismo e dieta) [3], a genética do hospedeiro e HP fatores de virulência [3], [4 ], [5]. Trabalho por nós [6] e outros defendem que os fatores bacterianos são susceptíveis de desempenhar o papel mais decisivo [7], [8].

A melhor virulência marcador caracterizado HP é a ilha de patogenicidade gene associado a citotoxina (cagPAI ), uma região de 40 kb de ADN cromossómico que codifica cerca de 31 genes que forma um sistema de secreção de tipo IV (T4SS) para translocar produtos bacterianos para a célula hospedeira. cagA
reside dentro cagPAI e é responsável pela maioria dos fenótipos malignas HP-associados: ele dispara IL-8 secreção priming uma resposta inflamatória, promove a proliferação celular, espalhamento e migração seja através de mecanismos de fosforilação dependentes e independentes [ ,,,0],9], [10]. O cagPAI está presente em aproximadamente 95% do leste asiático isola e é menos frequente em isolados de países ocidentais de baixo risco [11], [12], [13].

Muitas das funções cagA residem dentro de um em tandem C-terminal dispostas motivo repetitivo contendo os aminoácidos Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (Epiya motifs a, B, C e D). Estirpes albergando várias cópias de tipo ocidental Epiya-C ou do tipo oriental Epiya-D são sugeridos para ser mais associado ao câncer gástrico e com um aumento da cagA in vitro
actividade [14], embora isso seja controverso [15] . Até à data, apesar da conhecida variabilidade no N-terminal de gene e outros genes da ilha cagPAI cag
, tem havido pouca informação acerca relevância clínica de variantes genéticas fora da EPIYAs. Assim, neste trabalho buscamos identificar variantes nos genes cagPAI CAGC
( HP0546
), gaiola
( HP0544
), CAGL
( HP0539
), cagV
( HP0530
), cagT
( HP0533
) e cag Gamma
( HP0523
) genes, que foram designados como componentes funcionais importantes de T4SS bacteriana modelo, e são conhecidos por ser crucial para a função cagPAI translocação ou presentes no meio extracelular, sugerindo um possível interações com células hospedeiras; e em cagA,
cuja região Epiya tem sido consistentemente mostrado correlação com a evolução clínica (câncer gástrico) [16].

cagA
estatuto por si só não é suficiente para predizer os resultados clínicos. Além disso, existem indicações de que a HP erradicação reduz a incidência de câncer gástrico apenas em indivíduos sem lesões pré-cancerosas. Os resultados deste estudo podem fornecer informações valiosas para orientar o tratamento antibiótico para indivíduos de alto risco, se os efeitos dessas variantes são confirmados em futuras investigações.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os participantes assinaram um consentimento informado por escrito. O estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão ética das instituições responsáveis ​​pelo recrutamento de sujeitos em cada um dos centros de recrutamento.

Para amostras de mexicanos, o estudo foi aprovado pelos comitês de ética do Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) e Hospital Geral da Secretaria de Saúde (SS), Cidade do México, México.

para amostras da Venezuela, a depuração ética para o estudo foi obtido a partir da Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC) Comitê de ética em Lyon, França, e o Centro de Controle do Câncer, em San Cristobal, Venezuela.

população do estudo

Venezuela.

Foram utilizados 11 amostras de DNA de biópsias gástricas de indivíduos afetados com gastrite crônica, sem atrofia recrutados em um julgamento quimioprevenção na Venezuela [17], [18]. Os sujeitos do estudo (idade 35-69) neste estudo foram recrutados a partir de participantes do Programa de Controle do Câncer Gástrico de Estado Tachira, que foi baseado em um raio X-gástrica duplo contraste seguido por um exame gastroscópico. Indivíduos com qualquer tipo de câncer, incluindo câncer gástrico, ou com quaisquer outras doenças graves, tais como coração, pulmão, insuficiência renal ou hepática e as mulheres grávidas não eram elegíveis. Sete biópsias gástricas foram tomadas a partir de sites pré-definidos, cinco para avaliação histológica e dois foram congelados por H pylori
isolamento de ADN ou cultura. patologistas especialistas em lesões neoplásicas do estômago ler lâminas histológicas.

México.

84 amostras eram de pacientes atendidos na Unidade de Gastroenterologia do Hospital Geral México (Secretaría de Salud) e do Hospital de Oncologia ( Instituto Mexicano del Seguro social), dois hospitais na Cidade do México. Trinta e cinco pacientes foram afetados com gastrite crônica e 49 com câncer gástrico. Os pacientes tinham mais de 30 anos, consultou por causa dos sintomas gastroduodenais (Hospital Geral) ou por causa de um câncer gástrico provável (Oncologia Hospital), e foram programados para endoscopia e biópsia para fins de diagnóstico. Indivíduos que tinham recebido previamente tratamento contra o cancro, foram em antibióticos, a terapia anti-HP ou drogas anti-inflamatórias não esteróides duas semanas antes do estudo, ou tinham outras doenças crónicas graves foram excluídos. espécimes de biópsia gástrica foram colocados em solução salina estéril a 0,9%, homogeneizada, e inoculadas em placas suplementadas com 5% de sangue de ovelha para a cultura HP blood agar base (BBL, MD). As placas foram incubadas a 37 ° C num CO 9% _{2 para a atmosfera até 5 dias. A HP foi identificado por colónia e morfologia microscópica e pela oxidase positiva, catalase, e testes de urease. De cada um crescimento primário, 7 e 10 colónias individuais foram isolados cada um a partir do antro e do corpus e propagados em meio de agar de sangue. Para este estudo, foram analisadas 43 amostras de cepas cultivadas e 41 diretamente a partir de biópsias congeladas.}

As principais características da população estão descritas na tabela 1.

DNA extração

para as amostras de biópsia da Venezuela e mexicanos o DNA foi extraído de tecidos congelados usando QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Para as estirpes cultivadas DNA foi purificado usando o EDTA tiocianato-Sarkosyl método de guanidina (GES) [19].

projeto Primer

Foram utilizados alinhamentos de sequências HP de bases de dados públicas para identificar sequências adequadas para concepção de iniciadores de PCR. Nós limitado nossas pesquisas de banco de dados de estirpes ocidentais da HP, que são mais propensos a ser semelhante às cepas encontradas nas amostras de estudo. Nós projetamos amplicons de azulejos que variam em tamanho 312-876 pb. O tamanho médio da sequência lê com 454 tecnologia de sequenciação é de 450 pb, portanto, para a frente lê e reverso lê sobreposição, pelo menos parcialmente, melhorando assim a fiabilidade dos resultados. Cinco dos cagA
amplímeros utilizados foram previamente publicados [20], [21]. Todos os primers utilizados para cagA
, CAGC, gaiola, CAGL, cagV, cagT
e cag gamma
foram testados em reações de PCR em um pequeno número de amostras de estudo ( n = 16) e as regiões amplificadas foram sequenciados com tecnologia Sanger nas mesmas amostras para confirmar a especificidade da amplificação (ver quadro suplementar S1 para as sequências de iniciadores de amplificação e as condições de PCR).

Além disso, utilizou-se, como de referência, três estirpes 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) e G27 (NC_0011333) cujos genomas foram completamente sequenciado [22], [23], [24].

454 sequenciamento

Uma vez que as condições de PCR foram otimizados, nós resynthesized os mesmos iniciadores utilizados para PCR com etiquetas multiplex (usados ​​para identificar sequências de cada amostra específica) ou adaptadores, e amplificados das regiões de destino usando DNAs de amostras. Um segundo PCR foi realizada, utilizando os iniciadores marcados, a fim de aumentar a quantidade de material. Todos os amplimeros da PCR foram purificados, quantificadas espectrofotometricamente, e reunidas em quantidades equimolares.

Biblioteca de geração para 454 FLX sequenciação foi levada a cabo usando protocolos padrão do fabricante (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, EUA). Em suma, os adaptadores do fabricante necessários para o processamento e a sequenciação foram adicionados aos terminais de cada conjunto de produtos de PCR marcados por ligação. moléculas únicas de produtos de PCR que transportam os adaptadores corretos foram hibridadas com os grânulos individuais, amplificado por clonagem numa emulsão subsequente PCR e cada piscina carregado numa 1/16 de um picotiterplate para sequenciação usando a tecnologia 454 GS FLX titânio. Após o processamento e base de chamada usando o software proprietário do fabricante (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, EUA, Software versão 2.0.00 outubro de 2008) a resultante leituras foram classificadas de acordo com as seis marcas de base pré-incorporados. análise da sequência genômica de 454 tecnologia foi realizada para estes HP isolados com > 200 vezes cobertura média (mínimo 59x, 580X máximo). Os contigs resultantes foram montados usando a sequência do gene da HP estirpe 26695 [23] como um andaime. Não observamos diferenças substanciais na qualidade da saída entre o DNA da estirpe culta e DNA de biópsias. A fim de avaliar o controle da qualidade dos dados foram comparados 454 de dados de sequenciamento da estirpe de referência 26695 e na sequência publicada na base de dados NCBI (NC_000915); concordância foi mais de > 99%. Nós também sequenciaram 9 amostras venezuelanos com o método tradicional seqüenciamento Sanger, observando-se uma concordância >. 99% entre os métodos

seqüenciamento Sanger

O cagA
N-terminal (630bp ), C-terminal (posição 2670-3100) e Epiya motifs região, bem como CAGL
gene foram sequenciados pelo método de Sanger. As reacções de sequenciação foram realizadas utilizando o kit BigDyeR Terminator Cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) sob condições térmicas como segue: 96 ° C durante 2 min, e depois 27 ciclos a 96 ° C durante 30 s, 54 ° C durante 10 s e 60 ° C durante 4 min. Os produtos reaccionais foram precipitados com 2-propanol, lavado com etanol a 75%, diluiu-se em 25 ul de água e carregado numa ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). dados de sequenciamento primários foram analisados ​​utilizando um programa de análise de sequenciação (Applied Biosystems).

bioinformática e métodos estatísticos

sequências em bruto foram analisados ​​automaticamente com o software 454, e índices de qualidade foram atribuídos. A saída sequenciamento resultante, tanto no formato 454 sff e Sanger em formato abi, foi analisada com o software de alinhamento de sequências múltiplas (por exemplo, a plataforma de software Geneious: http://www.geneious.com/), que reuniu todas as leituras pertencentes à mesma amostra, em seguida, as sequências de todas as amostras foram alinhadas com uma sequência de referência e polimorfismos de base única, bem como pequenas inserções e deleções foram identificados. Para evitar potenciais artefactos a partir da sequenciação e para limitar variantes com frequências significativas clinicamente e estatisticamente, foram selecionados variantes com chamadas inequívocas observadas em pelo menos 10% para sinónimo (N = 175) e 20% para nonsynonymous (N = 206) variantes do originalmente amostras testadas e cepas de referência (total 381).

SAS versão 9.2 foi utilizado para estimar odds ratio logit (OR) e intervalo de confiança de 95% (CI) para o cancro gástrico associado a cada variante, bem como para calcular p -Valores para diferenças nas freqüências variantes entre câncer gástrico e gastrite por teste exato de Fisher (2 lados). correção de Bonferroni foi aplicado para calcular os valores de p ajustado para comparações múltiplas, dividindo os valores de p matérias com 381.

Variabilidade genética em sete genes HP cagPAI

Um resumo da variabilidade genética detectados na sete genes é relatada na tabela 2. como esperado, observou-se um elevado grau de variabilidade (calculado como o número de sítios que mostram uma variante de um total de sítios num gene), tanto ao nível do ADN e de aminoácidos. A variabilidade de nucleótidos variou de 8,03% no cagV
para 23,92% no CAGC
, enquanto que a variabilidade de aminoácidos curiosamente variou de 5,69% no cagT
, apresenta o menor grau de variação, para 31,01% no cagA
.

Foram comparadas as frequências dos 381 variantes genéticas selecionados entre câncer gástrico e casos de gastrite crônica. Nós, então, determinado não sinónima (tabela 3) e (Tabela 4) variantes sinônimas que apresentaram diferenças significativas entre os casos de gastrite e câncer, encontrando um dos seguintes critérios: (1) a frequência variante absoluta diferiu, pelo menos, 25% entre os grupos gastrite e câncer; (2) frequência variante no cancro gástrico, pelo menos, duas vezes tão elevada como na gastrite e (3) frequência na gastrite variante, pelo menos, duas vezes tão elevada como no cancro gástrico. Vinte e cinco SNPs (11 não-sinônimas e 14 sinônimas) atingiu diferença estatisticamente significativa (p < 0,05, figura 1), localizado na cagA
, gaiola
, caggamma
e CAGL
, enquanto nenhum foi localizado em CAGC
, cagT
ou cagV
. Nós então aplicado um limiar estudo-wise de p = 1,31 × 10 ^{-4 (0,05 /381) ajustado para comparações múltiplas, e apenas dois SNPs, na posição 1039 e 1041 no gaiola
, mostrou uma p-valor inferior a esse limite. Um SNP no gaiola
gene (posição de 1905) mostra um valor de p de 2,55 × 10 -4 muito próximo da significância estatística estudo-wise.}

cagA
polimorfismos e tipos Epiya

a região C-terminal (posições 2670 a 3100) foi altamente variável em isolados clínicos de acordo com o padrão dos motivos Epiya (figura 2). Observamos 524 sítios polimórficos dos quais analisados ​​148 selecionados com os critérios descritos anteriormente (o catálogo completo de cagA
SNPs é mostrado na S1 arquivo suplementar). Curiosamente, dois SNPs mostrar uma recorrência diferentes entre gastrite e câncer casos com p < 0,05, mesmo se eles não foram considerados estatisticamente significativa, devido ao grande número de testes; Um deles é um SNPs não-sinônimas (A2033G determinar uma alteração de aminoácido T /A, ver tabela 3) e um SNPs sinónimo (A2547G, ver tabela 4).

A análise da região de Epiya confirmou que todas as sequências eram do tipo cag Ocidental, ou seja, a ABC (82%), ABCC (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) e ABCCC (1%). Nós não observamos uma distribuição diferente destes tipos cagA entre o câncer e gastrite casos (p = 0,2342), os resultados detalhados são apresentados na Tabela 5 e Figura 2. Observamos 3 variantes do motivo Epiya: uma amostra gastrite tiveram EPIYV em um um motivo, 50% de motivos B mostrou a variante EPIYT (sem distribuição estatística diferente no caso do cancro e gastrite) e um motivo C de um caso de cancro mostrou uma variante EPLYA.

resultados obtidos na outra cag genes
PAI

variabilidade genética de CAGC gaiola
, cagT, cagV
e cag Gamma
foi avaliada por 454 sequenciação e de c AGL
pelo seqüenciamento Sanger. O catálogo completo de polimorfismos observadas nesses sete genes é mostrado na S1 arquivo suplementar.

CAGC
gene detectamos 83 SNPs, 25 dos quais foram selecionados como descrito acima. Nenhum desses SNPs mostraram uma distribuição diferencial entre casos de gastrite e câncer.

gaiola
gene temos catalogados 308 sítios polimórficos, foram analisadas 97 destes polimorfismos. C1039T e T1041G mostraram uma recorrência diferente estatisticamente significativa entre os casos de gastrite e de cancro com p = 9,97 × 10 ^{-6. Além disso outra T1905C SNP mostraram uma recorrência diferente, com um valor p de 2,55 × 10 -4, que é muito próximo do limiar de estudo-wise. Nove outros SNPs mostrar uma recorrência diferentes entre os casos de gastrite e de cancro com p < 0,05, seis polimorfismos sinônimas (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A e A2286G) e 3 variantes não sinónimas: A76C (mudança de aminoácidos de lisina para glutamina), T1853C (mudança de aminoácidos de valina para alanina) e A2032G (mudança de aminoácidos de asparagina a ácido aspártico).}

a variante C1039T, quando analisado como única alteração, prevê uma mudança de aminoácidos de lisina para fenilalanina (mudança códon de CTT para TTT), enquanto o SNP T1041G está na terceira posição do mesmo códon e se analisados ​​como única alteração que previa uma variante sinónimo (códon mudar CTT para CTG). No entanto, em todas as amostras que analisámos os dois alelos variantes foram observados em conjunto, por conseguinte, observou-se apenas dois codões de variantes (e CTT TTG) que codificam para o mesmo aminoácido, lisina. O polimorfismo T1905C é uma variante sinónimo na terceira posição do GTT códon (variante códon GTC), que codifica para Valina.

CAGL
gene observamos 74 polimorfismos e 24 dos quais foram analisados, quatro apresentaram uma distribuição diferencial entre casos de cancro e gastrite (P < 0,05). Dois deles eram não-sinónimo: G166A (mudança de aminoácidos de alanina por treonina) e A172G (mudança de aminoácidos da asparagina a ácido aspártico) e dois sinónimo:. (A228G e C516T)

cagT
gene foram analisados ​​23 dos 81 polimorfismos observadas, enquanto que no cagV
gene foram analisados ​​11 dos 61 polimorfismos, e em ambos os genes nenhum dos polimorfismos mostrou uma distribuição diferencial entre casos de gastrite e câncer.

cag Gamma
gene observamos 111 polimorfismos, 53 dos quais foram posteriormente analisadas e 4 sinónimo (A195TorC, T207A, C264T e A468G) e cinco não-sinónimo (A38G, C47G, A200 /201T, A367C e G457A) mostrou uma p <. 0,05 para a distribuição diferencial entre casos de gastrite e câncer (figura 1)

Discussão

Desde a sua descoberta em 1996 [25], o cagPAI, que abriga os genes de virulência de HP, foi provavelmente a parte mais intensamente estudados do genoma HP. O sistema de secreção de tipo IV codifica proteínas, que formam uma estrutura em forma de agulha de ligação da HP para o citoplasma da célula epitelial gástrica para injectar a proteína oncogénica CagA e os peptidoglicanos. Os componentes desta estrutura incluem: a) componentes de pilus, CAGC (homólogo do Agrobacterium tumefaciens
VirB2) que formam a estrutura principal extracelular, em que a ponta está ligado CAGL para interagir com β-1 integrina; b) proteínas centrais complexos, CagW (VirB6), CagT (VirB7), CagV (VirB8), CagX (VirB9) e cagy (virB10) que formam o núcleo interior do pilus; c) fatores energéticos Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) e Cage (VirB3 /VirB4), ATPases que fornecem energia para o sistema funcionar [26]. Neste estudo, foram seqüenciados CAGC
( HP0546
), CAGL
( HP0539
) do pilus, cagV
( HP0530
), cagT
( HP0533
), e cag Gamma
( HP0523
) do complexo central, e gaiola
( HP0544
) das enzimas de fornecimento de energia a partir de cepas HP isolados de gastrite e pacientes com câncer gástrico. Estes genes foram escolhidos porque os seus produtos são conhecidos como sendo essencial para a função T4SS e alguns são apresentados extracelularmente por H. pylori
(CagA, CAGL, CAGC), sugerindo possíveis interacções com a célula hospedeira [27].

Nós encontramos a menor variação, tanto no nucleótido e nível de aminoácidos, nas componentes do núcleo T4SS internas (CagT , CagV, e Cage; 5,7%, 5,9% e 5,9% de variação de aminoácidos, respectivamente), ea maior variação nos componentes expostos: integrina proteína de ligação CAGL, pilus extracelular CAGC componente principal e CagA proteína secretada (12,2%, 23,5% e 31%, a variação de aminoácidos, respectivamente). Estes resultados confirmam que a variação genética em componentes cagPAI é influenciado principalmente pela sua localização no T4SS, com maior variação em proteínas expostas na superfície bacteriana, talvez como uma resposta a pressão imunológica. Curiosamente, Cag gama foi uma excepção (19,5% variação de aminoácido), foi proposto esta proteína para residir dentro do periplasma HP onde actua como uma hidrolase de peptidoglicano, a perfuração da membrana externa HP e assim ajudando a expor o pilus T4SS para o meio externo [28]. É possível que Cag Gama cumpre esta função também como um componente estrutural do pilus exposta, onde também pode actuar sobre a membrana da célula hospedeira.

Estudos da África [21], Itália [14], EUA [ ,,,0],8] e no Brasil [29] têm sugerido uma associação entre o aumento do número de motivos Epiya C e doenças associadas HP. Além disso, Sicinschi et ai. [30] observaram uma associação entre o aumento segmentos Epiya C ea presença de lesões pré-cancerosas gástricas. Em contraste, os estudos na Colômbia [8], [31], México (J. Torres, comunicação pessoal), e Coréia [32] não encontraram tal associação. Em nosso estudo, mais de 80% de todas as amostras do México e da Venezuela foram do tipo ABC, e nenhuma associação foi evidente entre a progressão do cancro gástrico e maior número de motivos Epiya C. Além disso, estudos recentes [15] mostraram a importância das variações pontuais em Epiya B motivo para a atividade em células epiteliais, observamos quatro variações não sinônimas neste motivo, mas esses polimorfismos não mostrou uma associação com câncer gástrico.

estudos recentes têm relatado importantes atividades pró-inflamatórios e pró-oncogênicos de CagA que são independentes dos motivos Epiya e que pode ser tão importante para a doença [30]; essas descobertas podem explicar a falta de associação de motivos C com câncer relatados aqui e em estudos anteriores. O terminal C da proteína CagA também contém o motivo C-MET, que tem sido proposto para ter várias funções: mediar CagA multimerização e membrana segmentação [33], [34], interagem com a cinase Par1b /MARK2 [35], e todos estes atividades são CagA-fosforilação independente [36]. No entanto, em nosso estudo não encontrou diferenças significativas entre gastrite e câncer gástrico, quer em sequência ou no número de multimerização motivos.

Os domínios C-terminal e N-terminal de CagA são ambos necessários para explorar a actividade completa da proteína, embora eles têm funções distintas. Recentemente, foi demonstrado que o terminal N de CagA interage com o supressor de tumor-estimular a apoptose de proteína p53 (ASPP2) [37].

A presença de todas estas interacções entre proteínas bacterianas e CagA e humanos sugerem que ela pode ser muito difícil para a bactéria para manter a gama de actividade biológica na presença de elevado nível de mutações, a maioria dos quais presumivelmente levam à perda de função ou de atenuação.

Embora cag
é o marcador de virulência cagPAI melhor estabelecida, cagA
estatuto por si só não é suficiente para prever os resultados clínicos em populações de alto risco, onde a maioria da HP são cagA
-positivas. Neste contexto, a identificação de novos marcadores de virulência molecular HP para prever o risco de cancro gástrico irá ser muito importante. Os progressos recentes na metodologia de genotipagem nos permite usar o DNA de biópsias gástricas para estudar microvariabilities sequência da HP, que foram estudadas quase exclusivamente em cepas cultivadas. Genotipagem de um maior número de amostras gástricas nos permite expandir a detecção variante genética cagPAI a outros genes T4SS potencialmente importantes. Isso é relevante uma vez que estudos anteriores têm-se centrado principalmente na cagA
ea utilidade de outros genes cagPAI como marcadores para o risco de doença é pouco estudada. Poucos estudos têm procurado a associação da presença de genes cagPAI e doenças, e nenhum estudaram polimorfismos em genes cagPAI, excepto cagA.

gaiola
é um exclusivo gene que codifica dois componentes T4SS, VirB3 (N-terminal) e B4 (C-terminal) como uma proteína de fusão [38], e B4 é o maior entre os vários componentes de ATPase T4SS. Ele gera energia para o processo de secreção, assim, é necessária para a translocação de substrato [39] e interage com muitas outras proteínas, incluindo T4SS VirB2 [40]. Apesar da sua localização relativamente interna, o seu papel central na indução de IL-8 foi bem documentada [41], [42], [43]. Curiosamente, observou-se uma forte associação entre dois SNPs (C1039T e T1041G) do gaiola
e câncer gástrico, um achado não relatado anteriormente. Estes SNPs estão na posição um e três do mesmo códon e sempre observados estes dois códons variantes (CTT e TTG) que codificam para o mesmo aminoácido, lisina. Este códon variante está localizado no domínio de homologia com VirB3 de Agrobacterium
. A associação mais forte foi detectada segundo noutro SNP sinónimo na posição 1905 e neste caso os dois codões possíveis foram GTT GTC e, que codificam para a valina. Foi conhecido há muito tempo que os codões alternativos não são sinónimas usado com frequências e padrões de utilização de codões iguais variar entre espécies [44]. a utilização de codões é mais tendenciosa em genes expressos em níveis mais elevados [45], [46]. A utilização de codões óptimos permite um uso mais eficiente de ribossomas e leva a taxa de crescimento mais rápida [47]. Apesar de o genoma de HP foi relatado para conter nenhum desvio de codões para os genes altamente expressos [48], Kloster e Tang [49] identificou uma polarização no nível de genes onde TTG codão é preferido sobre o CTT codão, expressão, bem como de o codão GTT GTC através da. Por isso, com base nestes dados pode-se especular que a diferença na utilização de codões pode ter um impacto sobre o nível de expressão de um gene com um forte relevância funcional para o sistema de secreção de tais como T4SS gaiola
.

CAGL é uma proteína de pilus especializado que se liga e activa integrina α5β1 receptor em células epiteliais gástricas principalmente através do seu arginina-glicina-aspartato (RGD), que guiam o posicionamento adequado do T4SS e que facilitam a translocação de cag [9], [50 ]. CAGL também activa o quinases da célula hospedeira quinase de adesão focal (FAK) e Src para assegurar fosforilação CagA no local da injecção, enquanto que a integrina β1 é necessário para a motilidade celular induzida pelo hospedeiro CagA e alongamento [51]. CAGL também pode ser responsável por hipocloridria-HP induzida através da activação da Proteína Adam 17 e de NFkB [52]. Dos dois CAGL
SNPs que se encontram associados com o cancro gástrico, o A172G SNP (N58D) está na mesma posição em que Yeh et al [53] demonstraram que a presença simultânea de tirosina na posição do aminoácido 58 e ácido glutâmico na posição 59 (Y58E59) em comparação com a combinação de ácido aspártico (D58) e lisina (K59), induz uma mudança de forma mais eficiente do corpus α5β1 integrina gástrico que tem sido relacionada com a carcinogénese gástrica. Nós não observamos a tirosina (Y) aminoácido na posição 58 em qualquer amostra, embora nós achamos que os portadores de ácido aspártico (D) nesta posição estão em menor risco de câncer gástrico em comparação com a asparagina (N) portadores. Além disso, observou-se o polimorfismo no aminoácido 59 com menor freqüência e sem qualquer diferença entre amostras de câncer e gastrite.

Em estudos anteriores [54] análise da sequência do gene cagGamma
mostrou que abriga um domínio típico SLT catalítica entre os resíduos 33 e 165, cujo "ES" e motivos "AVGAY" foram altamente conservado entre as enzimas ortólogos. Observamos cinco variantes nonsynonymous com uma distribuição diferente nos casos de câncer e gastrite. Três desses mapa do domínio catalítico, no entanto, nenhuma delas está localizada nas partes mais conservadas do domínio.

Embora este estudo tenha limitações no tamanho da amostra, que é o maior até agora em termos de número de genes cagPAI estudada para uma sequência profunda analisa. Algumas amostras foram perdidos devido a uma falha na amplificação por PCR, o que pode ser devido a microvariabilities sequência de HP.

• PLOS ONE: Efeitos de Interleucina-10 polimorfismos, Helicobacter pylori infecção e fumar sobre o risco de Noncardia gástrica Cancer
• PLOS ONE: O reparo de DNA Gene APE1 T1349G Polimorfismo e risco de câncer gástrico em uma população chinesa