PLoS ONE: Vaihtelut Helicobacter pylori Sytotoksiini liittyvien geenien ja vaikutusvaltaansa Eteneminen syöpään: Implications for Prevention

tiivistelmä

Helicobacter pylori
(HP) on bakteeri, joka colonizes ihmisen vatsassa ja voi luoda pitkän aikavälin infektio mahalaukun limakalvon. Pysyvät Hp infektio aiheuttaa usein gastriitti ja liittyy kehittämiseen ulkustauti atrofinen gastriitti ja mahalaukun adenokarsinoomaa. Elinvoimaiset HP isolaattien satama CAG (Sytotoksiini liittyvien geenien) patogeenisyyssaarekkeen (cagPAI), 40 kb venyttää koodaavan DNA komponentteja tyypin IV eritystä järjestelmä (T4SS). Tämä T4SS muodostaa pilus injektoimiseksi virulenssitekijöiden isäntäsoluihin kohdesoluihin, kuten CagA onkoproteiini. Analysoimme geneettinen vaihtelu Caga
ja muiden valittujen geenien HP cagPAI ( Cagc
, häkki
, CAGL
, CAGT
, cagV
ja CAG Gamma
) käyttämällä DNA uutetaan jäädytetty mahalaukun koepaloja tai kliinisistä isolaateista. Oppiaineista oli 95 Caga + potilaista, jotka histologisesti diagnosoitu krooninen gastriitti tai mahasyövän Venezuelassa ja Meksikossa, joilla on suurta esiintyvyys Hp infektio. Sekvenssointireaktiot harjoittavat sekä Sanger ja seuraavan sukupolven pyrosekvensointi (454 Roche) menetelmiä. Löysimme yhteensä 381 variantteja yksiselitteinen puheluita havaittiin vähintään 10%: n alun perin tutkitut näytteet ja viite kantoja. Vertasimme taajuudet näiden geneettisten varianttien välillä mahasyövän ja krooninen gastriitti tapauksissa. Kaksikymmentäkuusi SNP (11 ei-synonyymejä ja 14 synonyymejä) osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (P < 0,05), ja kaksi SNP, asemassa 1039 ja 1041 häkki
, osoitti erittäin merkittävää yhteyttä syöpä (p -arvo = 2,07 x 10 ^{-6), ja muunnelma kodoni sijaitsi VirB3 homologian verkkotunnus Agrobacterium
. Tulokset Tämän tutkimuksen voi antaa ennakkotiedon kohdistaa antibioottihoitoa korkean riskin yksilöitä, jos vaikutukset Näiden varianttien varmistuneet lisätutkimuksiin.}

Citation: Rizzato C, Torres J, Plummer M, Muñoz N, Franceschi S, Camorlinga-Ponce M, et al. (2012) Vaihtelut Helicobacter pylori Sytotoksiini liittyvien geenien ja vaikutusvaltaansa Eteneminen syöpään: Implications for Prevention. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10,1371 /journal.pone.0029605

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 06 lokakuu 2011; Hyväksytty: 01 joulukuu 2011; Julkaistu: 03 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Rizzato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: JT on saaja yksioikeuslauseke apurahan Fundacion IMSS, Meksiko. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori
(HP) on yksi yleisimmistä kroonisista bakteeri-infektion ihmisillä. On arvioitu, että yli puolet aikuisväestöstä maailmassa on tartunnan tämän organismin [1]. Näistä noin 10-15% tartunnan yksilöiden arvioidaan kliinisesti haitallisia jälkitauteja, kuten mahahaava, mahalaukun adenokarsinooman ja mahan limakalvoa liittyvä imukudoksen lymfooman (MALT) [2]. Vaikka tähän mennessä on paljon työtä kaikkialla maailmassa, mikä ratkaisee nämä muuttuja kliinisiä tuloksia ei ole täysin selvitetty, mutta uskotaan olevan yhdistelmiä ympäristön (esim tupakointi ja ruokavalio) [3], isäntä genetiikan ja HP ​​virulenssitekijät [3], [4 ], [5]. Työ meille [6] ja muut tukevat, että bakteerien tekijät ovat todennäköisesti pelata kaikkein ratkaiseva rooli [7], [8].

Paras tunnettu HP virulenssi merkki on Sytotoksiini liittyvä geeni patogeenisyyssaarekkeen (cagPAI ), 40 kb: n alueen kromosomaalisen DNA: n, joka koodaa noin 31 geeniä, jotka muodostavat tyypin IV eritystä järjestelmän (T4SS) ja translokoida bakteeri-tuotteita isäntäsoluun. Caga
oleskelee cagPAI ja on vastuussa suurimmasta osasta HP liittyvän pahanlaatuisen fenotyypit: se laukaisee IL-8 eritystä imevä tulehdusvastetta, edistää solujen lisääntymistä, sironta ja muuttoliike joko fosforylaation riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien [ ,,,0],9], [10]. CagPAI on läsnä noin 95% Itä-Aasian isolaattien ja se on harvemmin isolaateissa alhaisen riskin länsimaissa [11], [12], [13].

Monet Caga toimintojen sijaita C-terminaalinen peräkkäin järjestetty toistuvia motiivi, joka sisältää aminohapot Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (EPIYA motiiveja A, B, C ja D). Kannoissa useita kopioita länsimaalaiset EPIYA-C tai Itä tyypin EPIYA-D ehdotetaan olevan enemmän liittyy mahasyövän ja kasvaneen Caga in vitro
toimintaa [14], vaikka tämä on kiistanalainen [15] . Vaikka tähän mennessä tunnetut vaihtelua N-päätteen Caga
geenin ja muiden cagPAI saari geenejä, on ollut hyvin vähän tietoja kliinistä merkitystä geneettisiä variantteja ulkopuolella EPIYAs. Täten tässä paperissa pyrimme tunnistamaan variantit cagPAI geenien Cagc
( HP0546
), Cage
( HP0544
), CAGL
( HP0539
), cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
), ja CAG Gamma
( HP0523
) geenejä, jotka on nimetty merkittäviä toiminnallisia osia mallin bakteerien T4SS, ja tiedetään olevan ratkaiseva cagPAI translokaatio toiminto tai läsnä solun ulkopuolelle, mikä viittaa mahdolliset yhteisvaikutukset isäntäsolujen kanssa; ja Caga,
jonka EPIYA alue on johdonmukaisesti osoitettu korreloi kliinisten tutkimusten tulosten (mahalaukun syöpä) [16].

Caga
tila ei yksin riitä ennustamaan kliinisiä tuloksia. Lisäksi on viitteitä siitä, HP hävittämiseksi vähentää mahasyövän esiintyvyys vain yksilöille syövän esiasteita. Tulokset Tämän tutkimuksen voi antaa arvokasta tietoa kohdistaa antibioottihoitoa korkean riskin henkilöitä, jos vaikutukset Näiden varianttien varmistuneet lisätutkimuksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki osallistujat allekirjoittivat tietoisen kirjallisen suostumuksen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen tarkastuslautakunta toimielinten vastaavien aihe rekrytointi kussakin rekrytointi keskuksista.

Meksikon näytteissä hyväksyi tutkimuksen eettisten komiteoiden Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) ja yleinen sairaala Secretaria de Salud (SS), Mexico City, Meksiko.

Venezuelan näytteitä, eettinen välys tutkimukselle saatiin International Agency for Research Cancer (IARC) eettinen komitea Lyon, Ranskassa, ja Cancer Control Center San Cristobal, Venezuela.

Tutkimuskanta

Venezuela.

Käytimme 11 DNA-näytteet mahalaukun koepaloja aiheista sairastaa krooninen gastriitti ilman surkastumista palvelukseen kemopreventatiivisesti tutkimuksessa Venezuelan [17], [18]. Tutkimushenkilöt (ikä 35-69) Tässä tutkimuksessa rekrytoitiin osallistujia mahasyövän ohjausohjelma of Tachira State, joka perustui mahalaukun kaksinkertainen kontrasti X-ray seuraa gastroskopisten tutkimus. Potilaat, joilla on syöpä, mukaan lukien mahasyöpä, tai muiden vakavien sairauksien, kuten sydän-, keuhko-, munuais- tai maksan vajaatoiminta ja raskaana olevat naiset eivät olleet oikeutettuja. Seitsemän mahalaukun koepaloja otettiin tietyille sivuille, viisi histologista arviointia ja kaksi jäädytettiin H pylori
DNA eristämistä tai kulttuuriin. Asiantuntija patologeja uudisvaurioiden mahalaukun lukea histologinen dioja.

Meksiko.

84 näytettä olivat potilailta osallistuvat gastroenterologian yksikkö México General Hospital (Secretaría de Salud) ja Oncology Hospital ( Instituto Mexicano del Seguro Social), sekä sairaaloissa Mexico City. Kolmekymmentäviisi potilasta sairastaa krooninen gastriitti ja 49 mahalaukun syöpä. Potilaat olivat vanhempia kuin 30 vuotta, on kuullut koska maha oireet (General Hospital) tai koska todennäköinen mahasyövän (Oncology sairaala), ja ohjelmoitiin endoskopia ja biopsia diagnoosia varten. Koehenkilöt, jotka olivat aiemmin saaneet syövän hoitoon, olivat antibiootit, HP terapia tai steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden kaksi viikkoa ennen tutkimusta, tai oli muita vakavia kroonisia sairauksia suljettiin pois. Mahalaukun biopsianäytteistä pantiin steriiliin 0,9% suolaliuosta, homogenisoitiin, ja inokuloitiin veren agaralustalla (BBL, MD) levyt oli täydennetty 5%: lla lampaan verta HP kulttuuriin. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 9% CO _{2 ilmakehässä enintään 5 päivää. HP oli tunnistetaan pesäke ja mikroskooppinen morfologia ja positiivinen oksidaasin, katalaasi, ja ureaasi testejä. Jokaisesta ensisijainen kasvun, 7- 10 yksittäistä pesäkettä kustakin eristettiin antrum ja corpus ja edenneitä veren agaralustalla. Tätä tutkimusta varten kartoitettiin 43 näytteitä viljellyistä kannoista ja 41 suoraan jäädytetty koepaloja.}

pääpiirteet väestöstä on kuvattu taulukossa 1.

DNA: n eristämiseksi

Venezuelan ja Meksikon biopsianäytteissä DNA uutettiin jäädytetyistä kudoksista käyttäen QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Viljeltyjä kantoja DNA puhdistettiin käyttäen guanidiinitiosyanaatin-EDTA-sarkosyyli (GES) menetelmä [19].

Primer suunnittelu

Käytimme rinnastukset HP sekvenssit julkisista tietokannoista tunnistaa sekvenssien sopivia suunnittelu PCR-alukkeet. Me rajoitettu tietokantaan hakuja Western kantoja HP, jotka ovat todennäköisemmin samanlaisia ​​kantoja löytyy tutkimuksessamme näytteitä. Suunnittelimme kaakeloitu amplikoneja kooltaan 312-876 bp. Keskikoko järjestyksessä lukee 454 sekvensointitekniikan on 450 emäsparia, siis eteenpäin lukee ja käänteinen lukee päällekkäisyyttä ainakin osittain, mikä parantaa luotettavuutta tuotoksen. Viisi Caga
amplimerit käytetty on aiemmin julkaistu [20], [21]. Kaikki käytetyt alukkeet Caga
, Cagc, häkki, CAGL, cagV, CAGT
ja CAG gamma
testattiin ensin PCR-reaktioissa pieni määrä tutkimuksen näytteiden ( n = 16) ja monistettiin alueet sekvensoitiin Sanger-tekniikkaa samalla näytteiden spesifisyyden varmistamiseksi vahvistus (ks täydentävä taulukko S1 alukesekvensseissä ja PCR-monistamisen olosuhteissa).

Lisäksi käytimme, sillä viite, kolme kantaa 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) ja G27 (NC_0011333) joiden genomit on täysin sekvensoitu [22], [23], [24].

454 sekvensointi

Kun PCR-olosuhteet optimoitiin, me uudelleensyntetisoidun samoja alukkeita käytettiin PCR multiplex tageja (käytetään tunnistamaan sekvenssejä kuhunkin näyte) ja adapterit, ja vahvistetaan kohdealueilla käyttämällä DNA: ita näytteistä. Toinen PCR suoritettiin käyttäen merkityt alukkeita, jotta voidaan lisätä materiaalin määrää. Kaikki PCR amplimerit Sitten puhdistettu, määrällisesti spektrofotometrisesti, ja yhdistettiin yhtä suuret moolimäärät.

Kirjasto sukupolven 454 FLX sekvensointi suoritettiin käyttämällä valmistajan standardiprotokollat ​​(454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA). Lyhyesti, valmistajan sovittimia tarvitaan käsittelyyn ja sekvensointia lisättiin päiden kunkin poolin merkitty PCR-tuotteita ligaatiolla. Yksittäisten molekyylien PCR-tuotteita, joissa oikea adapterit hybridisoitiin yksittäisiä helmiä, kloonaamalla monistettiin seuraavassa emulsion PCR, ja kukin allas ladattiin 1/16 picotiterplate sekvensointia käyttäen 454 GS FLX Titanium tekniikkaa. Käsittelyn jälkeen ja pohja calling käyttäen valmistajan oma ohjelmisto (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA, ohjelmiston versio 2.0.00 lokakuu 2008) Tuloksena muodostuneista lukee lajiteltiin mukaan ennalta sisällytetty kuusi pohja tunnisteita. Genomisen sekvenssin analyysi 454 tekniikka suoritettiin näille HP isolaateissa > 200-kertainen keskimääräinen kattavuus (vähintään 59x, maksimi 580x). Saatu jatkumoa koota käyttäen geenisekvenssiä, HP-kannan 26695 [23] tukirakenteena. Emme ole havaittu merkittäviä eroja tuotoksen laadun välisen DNA viljellyistä rasitusta ja DNA koepaloja. Sen arvioimiseksi laadunvalvontaa tietojen vertasimme 454 sekvenointitulosten viitteen kannan 26695 ja julkaistu sekvenssi NCBI-tietokanta (NC_000915); vastaavuutta oli yli > 99%. Olemme myös sekvensoitiin 9 Venezuelan näytteitä perinteisellä Sangerin sekvensoinnin menetelmä, havainnoimalla konkordanssi > 99% niveltyvät.

Sangerin sekvensoinnilla

Caga
N-terminaalista (630bp ), C-terminaalinen (asema 2670-3100) ja EPIYA motiiveja alueella sekä CAGL
geeni sekvensoitiin Sanger-menetelmällä. Sekvensointi suoritettiin käyttäen BigDyeR Terminator Cycle Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) termisissä olosuhteissa seuraavat: 96 ° C 2 min, ja sitten 27 sykliä 96 ° C: ssa 30 s, 54 ° C: ssa 10 s ja 60 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Reaktion tuotteet saostettiin 2-propanolilla, pestiin 75% etanolilla, laimennettiin 25 ul: aan vettä ja ladattiin ABI prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Ensisijainen sekvensointi tiedot analysoitiin käyttämällä Sekvensointianalyysin ohjelman (Applied Biosystems).

bioinformatiikka- ja tilastollisia menetelmiä

Raaka sekvenssit automaattisesti analysoitiin 454 ohjelmisto, ja laatupisteitä määrättiin. Tuloksena sekvensointi ulostulo, sekä 454 SFF muodossa ja Sanger in abi-muodossa, analysoitiin useita sekvenssin rinnastus ohjelmisto (esim Geneious ohjelmistoalusta: http://www.geneious.com/), joka kootaan kaikki lukee kuuluvien samasta näytteestä, niin sekvenssit, kaikkien näytteiden linjattu viittaus sekvenssiin ja yhden nukleotidin polymorfismien sekä pieniä lisäyksiä ja deleetioita havaittiin. Vältetään mahdolliset esineitä sekvensointi ja rajoittamaan variantteja, joilla on kliinisesti ja tilastollisesti merkittävää taajuudet, valitsimme variantit ja yksiselitteiset puheluita havaittiin vähintään 10% synonyymi (N = 175) ja 20% nonsynonymous (N = 206) variantit alunperin tutkitut näytteet ja viite kantoja (Yhteensä 381).

SAS version 9.2 avulla arvioitiin logit kertoimet suhdeluvut (OR) ja 95%: n luottamusväli (CI) mahasyövän liittyvät kunkin variantin sekä laskea p -arvot erot variantin taajuusvälillä mahasyövän ja gastriitti jonka Fisherin testiä (2-puolinen). Bonferroni korjausta käytettiin laskea p-arvot oikaistu monimuuttujille jakamalla raaka p-arvot 381.

Geneettinen vaihtelu seitsemässä HP cagPAI geenien

Yhteenveto geneettistä vaihtelua havaittu seitsemän geenien raportoidaan taulukossa 2. kuten odotettua, havaitsimme suurta vaihtelua (lasketaan sivustojen määrä osoittaa muunnos pois yhteensä sivustoja geenissä), sekä DNA- ja aminohappotasolla. Nukleotidisekvenssi vaihtelevuus vaihteli 8,03%: in cagV
on 23,92% vuonna Cagc
, kun taas aminohappovaihtelussa kiinnostavaa vaihteli 5,69%: in CAGT
, osoittaa pienin aste vaihtelua, jotta 31.01% vuonna Caga
.

Vertasimme taajuudet 381 valitun perimä välillä mahasyövän ja krooninen gastriitti tapauksissa. Sitten määritetään ei-synonyymi (taulukko 3) ja synonyymi (taulukko 4) variantit, jotka osoittivat merkittäviä eroja välillä gastriitti ja syöpätapausta, jotka täyttävät yhden seuraavista kriteereistä, (1) absoluuttinen variantti taajuus erosi vähintään 25% välillä gastriitti ja syövän ryhmien; (2) variantti taajuus mahasyövän vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin gastriitti ja (3) variantti taajuus gastriitti vähintään kaksi kertaa niin korkea kuin mahasyövän. Kaksikymmentäviisi SNP (11 ei-synonyymejä ja 14 synonyymejä) saavutettiin tilastollisesti merkitseviä eroja (p < 0,05, kuva 1), joka sijaitsee Caga
, häkki
, caggamma
ja CAGL
, kun taas yksikään sijaitsi Cagc
, CAGT
tai cagV
. Sitten levitetään tutkimus-viisasta kynnyksen p = 1,31 x 10 ^{-4 (0,05 /381) säätää monimuuttujille, ja vain kaksi SNP, asemassa 1039 ja 1041 vuonna häkki
, osoitti p-arvo pienempi kuin tämän rajan. SNP Cage
geeni (asento 1905) esittää ap arvo 2,55 x 10 -4 hyvin lähellä tutkimuksen-viisasta tilastollista merkittävyyttä.}

Caga
polymorfismit ja EPIYA tyypit

C-pään alueen (asemat 2670-3100) oli erittäin vaihteleva kliinisissä isolaateissa mukaan mallia EPIYA motiivien (kuva 2). Havaitsimme 524 polymorfista sivustoja, joista analysoitiin 148 valitaan kriteerit aiemmin kuvattu (täydellinen luettelo Caga
SNP esitetään täydentäviä tiedosto S1). Kiinnostavaa kyllä, kaksi SNP näyttää eri toistumisen välillä gastriitti ja syöpätapausta kanssa p < 0,05, vaikka niitä ei pidetty tilastollinen merkittävä johtuen suuri määrä testejä; yksi on ei-synonyymi SNP: (A2033G määrittää aminohapon muutos T /A, katso taulukko 3) ja yksi synonyymi SNP: (A2547G, katso taulukko 4).

analyysi EPIYA alueen vahvisti, että kaikki sekvenssit olivat Länsi-tyypin CagA, eli ABC (82%), Abcc (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) ja ABCCC (1%). Emme havainneet erilaista jakautumista näiden Caga tyyppien välillä syövän ja gastriitti tapauksissa (p = 0,2342), yksityiskohtaiset tulokset on esitetty taulukossa 5 ja kuviossa 2. Havaitsimme 3 variantit EPIYA aihe: yksi gastriitti näyte oli EPIYV käytettäessä motiivi, 50% B motiivien osoitti EPIYT variantti (ei tilastollista eri jakelukanavien syövän ja gastriitti tapaus) ja yksi C-motiivi syövän tapaus osoitti EPLYA variantti.

tulokset muissa CAG
PAI geenit

Genetic vaihtelu Cagc häkki
, CAGT, cagV
ja CAG Gamma
arvioitiin 454 sekvensointi ja c AGL
Sangerin sekvensoinnilla. Täydellinen luettelo polymorfismien havaittu näissä seitsemässä geenien esitetään täydentäviä tiedostoon S1.

Cagc
geeni havaitsimme 83 SNP, joista 25 valittiin edellä kuvatulla tavalla. Mikään näistä SNP osoitti ero jakautuminen gastriitti ja syöpätapausta.

häkki
geeni olemme luetteloitu 308 polymorfista sivustoja, 97 näistä polymorfismien analysoitiin. C1039T ja T1041G havaittiin tilastollisesti merkittävä eri toistumisen välillä gastriitti ja syöpätapausta p = 9,97 x 10 ^{-6. Lisäksi toinen SNP T1905C saatiin erilainen toistumisen, jonka p-arvo 2,55 x 10 -4, joka on hyvin lähellä tutkimuksen-viisasta kynnyksen. Yhdeksän muuta SNP näyttää eri toistumisen välillä gastriitti ja syöpätapausta kanssa p < 0,05, kuusi synonyymi polymorfismit (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A ja A2286G) ja 3 ei-synonyymi variantit: A76C (aminoacidic muutos lysiiniä glutamiini), T1853C (aminoacidic muutos valiinista alaniiniksi) ja A2032G (aminoacidic muutos asparagiinin asparagiinihappo).}

C1039T variantti, kun analysoidaan yksi muutos, ennustaa aminohapon muutos lysiinistä phenilalanine (kodonin muutos CTT TTT), kun taas SNP T1041G sijaitsee kolmannessa paikassa saman kodonin ja jos analysoidaan yksittäinen muutos se ennusti synonyymi variantti (kodoni muuttaa CTT CTG). Kuitenkin kaikissa näytteissä, jotka olemme analysoineet kaksi varianttia alleelit havaittiin yhdessä, siksi havaitsimme vain kaksi variantti kodoneja (CTT ja TTG), jotka koodaavat samaa aminohappoa, lysiiniä. T1905C polymorfismi on synonyymi variantti kolmannessa asemaan GTT-kodonin (variantti kodoni GTC), joka koodaa valiini.

CAGL
geeni havaitsimme 74 polymorfismit ja 24, joista analysoitiin, 4 osoitti ero jakautuminen syöpätapausta ja gastriitti (P ​​< 0,05). Kaksi heistä oli ei-synonyymi: G166A (aminoacidic muutos alaniini treoniiniksi) ja A172G (aminoacidic muutos asparagiinin aspartiinihappoon) ja kaksi synonyymi: (A228G ja C516T).

CAGT
geeni analysoimme 23 81 polymorfismien havaittu, kun taas cagV
geeni analysoitiin 11 61 polymorfismien ja molemmat geenit yksikään polymorfismin osoitti ero jakautuminen gastriitti ja syöpätapausta.

CAG Gamma
geeni havaitsimme 111 polymorfismien, 53 joista analysoitiin edelleen ja 4 synonyymi (A195TorC, T207A, C264T ja A468G) ja viisi ei-synonyymi (A38G, C47G, A200 /201T, A367C ja G457A) osoittivat p < 0,05 varten ero jakautuminen gastriitti ja syöpätapausta (kuva 1).

keskustelu

Koska sen löydön vuonna 1996 [25] mukaan cagPAI, joka satamat virulenssigeenit HP, on luultavasti ollut tutkittu intensiivisesti osa HP genomin. Tyyppi IV eritys järjestelmä koodaa proteiineja, jotka muodostavat neulan kaltainen rakenne yhdistää HP sytoplasmaan epiteelin mahalaukun solun pistää onkogeenisen CagA proteiinia ja peptidoglykaaneja. Komponentit tämän rakenteen ovat a) pilus komponentteja, Cagc (homologin Agrobacterium tumefaciensin
VirB2), jotka muodostavat pääasiassa solunulkoisia rakenne, johon kärki CAGL on kiinnitetty vuorovaikutuksessa β-1 integriini; b) ytimen monimutkaisia ​​proteiineja, CagW (VirB6), CAGT (VirB7), CagV (VirB8), CagX (VirB9) ja cagy (VirB10), jotka muodostavat sisemmän ytimen pilus; c) energinen tekijät Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) ja häkki (VirB3 /VirB4), ATPaasit toimittaa energiaa järjestelmä toimisi [26]. Tässä tutkimuksessa olemme sekvensoitu Cagc
( HP0546
), CAGL
( HP0539
) alkaen Pilus, cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
), ja CAG Gamma
( HP0523
) ytimestä monimutkainen, ja Cage
( HP0544
) päässä energiahuollon entsyymien HP eristettyjen kantojen gastriitti ja mahasyöpä potilaita. Nämä geenit valittiin, koska niiden tuotteita, joiden tiedetään olevan olennaisia ​​T4SS funktion ja joitakin on esitetty solun mukaan H. pylori
(CagA, CAGL, Cagc), mikä viittaa mahdolliset vuorovaikutukset isäntäsolun [27].

Olemme löytäneet pienin vaihtelu, sekä nukleotidiin ja aminohappo tasolla sisäpiirillä T4SS komponentit (CAGT , CagV, ja häkki, 5,7%, 5,9% ja 5,9% aminohapon muutos, vastaavasti), ja suurin vaihtelu altistuvat osat: integriinin sitovan proteiinin CAGL, solunulkoinen pilus pääkomponentti Cagc ja erittyvän proteiinin CagA (12,2%, 23,5% ja 31%, aminohappo vaihtelu, vastaavasti). Nämä tulokset tukevat että geneettinen vaihtelu cagPAI komponenttien vaikutetaan ensisijaisesti niiden lokalisointi T4SS, korkeammat vaihtelua proteiinit altistuvat bakteerin pinnalla, ehkä vastauksena immunologisen painetta. Mielenkiintoista, Cag Gamma oli poikkeus (19,5% aminohappo vaihtelu), tämä proteiini on ehdotettu oleskella HP periplasmassa jossa se toimii peptidoglykaania hydrolaasi, lävistyksiä HP ulompi kalvo ja auttaa siten altistaa T4SS Pilus ulkoiseen keskipitkällä [28]. On mahdollista, että Cag Gamma täyttää tämän toiminnon myös rakenteellinen osa altistuu pilus, jossa se voisi toimia myös ympäri isännän solukalvoon.

Studies Afrikasta [21], Italia [14], USA [ ,,,0],8] ja Brasiliassa [29] ovat ehdottaneet yhdistyksen välillä lisääntynyt määrä EPIYA C motiiveja ja HP ​​liittyvien sairauksien. Lisäksi Sicinschi et ai. [30] havaittu yhdistyksen välillä lisääntynyt EPIYA C segmentteihin ja läsnäolo mahalaukun syövän esiasteita. Sen sijaan tutkimuksissa Kolumbiassa [8], [31], Meksiko (J. Torres, henkilökohtainen tiedonanto), ja Koreassa [32] ole löytänyt tällaista järjestöä. Tutkimuksessamme yli 80% kaikista näytteistä Meksikosta ja Venezuelasta olivat tyyppiä ABC, eikä niillä ole ollut ilmeistä välillä mahasyövässä etenemistä ja suurempi määrä EPIYA C motiiveja. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset [15] ovat osoittaneet, että on tärkeää pisteen vaihtelut EPIYA B motiivi aktiivisuuden epiteelisolujen, havaitsimme neljässä ei synonyymi vaihtelut tämän motiivin, mutta nämä polymorfismit ei osoittanut yhteyttä mahalaukun syöpään.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet tärkeitä proinflammatoristen ja pro-onkogeenisiä toiminta CagA jotka ovat riippumattomia EPIYA motiiveja ja jotka voivat olla yhtä tärkeitä taudin [30]; Näiden havaintojen voisi selittää puute yhdistyksen C motiivien syövän raportoitu täällä ja aiemmissa tutkimuksissa. C-terminaali CagA proteiinin sisältää myös C-MET-motiivi, joka on ehdotettu useita toimintoja: välittäjänä CagA multimerisaatio ja kalvon kohdistamista [33], [34], kanssa vuorovaikutuksessa kinaasin Par1b /Mark2 [35], ja kaikki nämä toimet ovat CagA-fosforylaation riippumaton [36]. Kuitenkin tutkimuksessamme emme löytäneet merkittäviä eroja gastriitti ja mahasyöpä, joko peräkkäin tai määrän multimerisaatiodomeenin motiiveja.

C-päätteen ja N-pääaluetta CagA molempia tarvitaan hyödyntää koko proteiinin aktiivisuutta, vaikka ne ovat erillisiä toimintoja. Äskettäin on osoitettu, että N-päähän CagA vuorovaikutuksessa tuumorisuppressorigeenin apoptoosin stimuloiva proteiini p53 (ASPP2) [37].

läsnäolo Kaikkien näiden välisten vuorovaikutusten CagA ja bakteeri- ja ihmisen proteiineja viittaavat siihen, että se voi olla hyvin vaikea bakteerin säilyttää täyden valikoiman biologinen aktiivisuus, kun läsnä on korkea mutaatioiden, joista suurin osa oletettavasti johtaa menetykseen tai vaimennus toiminto.

Vaikka Caga
on paras perustettu cagPAI virulenssi merkki, Caga
tila ei yksin riitä ennustamaan hoitotuloksia riskipotilailla jossa suurin osa HP ovat Caga
-positiivisille kantoja. Tässä yhteydessä yksilöimään uudet HP molekyyli virulenssi markkereita ennustaa mahalaukun syövän riski on erittäin tärkeää. Viimeaikainen edistyminen genotyypitys menetelmiä voimme käyttää DNA mahalaukun koepaloja opiskelemaan HP järjestyksessä microvariabilities, joita on lähes yksinomaan tutkittu viljellyissä kannoissa. Genotyypitys suurempi määrä mahalaukun näytteiden avulla voimme laajentaa cagPAI geneettinen variantti tunnistus muita mahdollisesti tärkeitä T4SS geenejä. Tämä on tärkeää, koska aiemmissa tutkimuksissa on keskitytty pääasiassa Caga
ja hyödyllisyys muiden cagPAI geenejä markkereina tautiriski tuskin tutkittu. Harvat tutkimukset ovat etsineet yhdistyksen läsnäolo cagPAI geenien ja sairauksien, ja kukaan ei ole tutkinut polymorfismien cagPAI geenejä, muita kuin Caga.

häkki
on ainutlaatuinen geeni, joka koodaa kaksi T4SS komponentteja, VirB3 (N-terminaali) ja B4 (C-terminaali) fuusioproteiinina [38], ja B4 on suurin ATPaasi useiden T4SS komponentteja. Se tuottaa energiaa eritystä prosessia, jolloin tarvitaan substraatin translokaatio [39], ja on vuorovaikutuksessa monien muiden T4SS proteiineja, mukaan lukien VirB2 [40]. Huolimatta suhteellisen sisäinen lokalisointi, sen keskeinen rooli IL-8 induktio on hyvin dokumentoitu [41], [42], [43]. Mielenkiintoista, havaitsimme vahvan yhteyden kahden SNP (C1039T ja T1041G) ja Cage
ja mahasyövän, toteaminen ei ilmoiteta aiemmin. Nämä SNP ovat asennossa yksi ja kolme samaa kodonin ja olemme aina noudatettava näitä kahta varianttia kodoneja (CTT ja TTG) joilla kodifioidaan samaa aminohappoa, lysiiniä. Tämä variantti kodoni sijaitsee homologiadomeeni kanssa VirB3 on Agrobacterium
. Toiseksi vahvin yhdistys havaittiin toisessa synonyymi SNP paikalleen 1905 ja tässä tapauksessa kaksi mahdollista kodonia oli GTT ja GTC, jotka koodaavat valiini. On tiedetty jo pitkään, että vaihtoehtoisia synonyymejä kodoneja ei käytetä yhtä taajuuksia ja malleja kodonikäytön vaihtelevat lajien [44]. Kodonin käyttö on enemmän puolueellinen geeneissä ilmentyvät korkeammilla tasoilla [45], [46]. Käyttö optimaalisia kodoneja mahdollistaa tehokkaamman käytön ribosomien ja johtaa nopeampaan kasvuvauhti [47]. Vaikka genomin HP on raportoitu sisällä Kodonivääristymä erittäin ilmaistaan ​​geenien [48], Kloster ja Tang [49] yksilöitiin harhaa ekspressiotaso geenien jossa TTG-kodoni on edullisempi kuin CTT kodoni, sekä GTC kodonin yli GTT. Siksi näiden tietojen perusteella voimme spekuloida, että ero kodonin käyttö saattaa olla vaikutusta tasoon geenin ilmentymisen, jolla on vahva toiminnallinen merkitystä T4SS eritystä järjestelmää, kuten Cage
.

CAGL on erikoistunut pilus proteiini, joka sitoo ja aktivoi integriini α5β1 reseptorin mahalaukun epiteelisolujen ensisijaisesti sen arginiini-glysiini-aspartaatti (RGD) motiivi, ohjaamiseksi oikeaan asentoon ja T4SS ja helpottaa translokaation CagA [9], [50 ]. CAGL aktivoi myös isäntäsolun kinaasien polttoväli adheesiokinaasi (FAK) ja Src varmistaa CagA fosforylaationa injektiokohdassa, kun taas β1 integriiniä tarvitaan CagA aiheuttama isännän solun liikkuvuus ja venymä [51]. CAGL voi myös olla vastuussa HP aiheuttama hypochlorhydria kautta aktivointi disintegriini- ja metalloproteaasi 17 ja NFKB [52]. Kahden CAGL
SNP: t löysimme liittyy mahan Syövän A172G SNP (N58D) on samassa asennossa, jossa Yeh et ai [53] ovat osoittaneet, että samanaikainen läsnäolo tyrosiinin aminohappoasemassa 58 ja glutamiinihappo asemassa 59 (Y58E59) verrattuna yhdistelmä asparagiinihapon (D58) ja lysiini (K59), indusoi tehokkaammin corpus siirtyminen mahalaukun integriini α5β1 joka on liittyy mahasyövän. Emme havainneet tyrosiini (Y) aminohappo asemassa 58 missään näytteessä, vaikka huomasimme, että kantajia asparagiinihappo (D) tässä asemassa ovat alemmilla mahalaukun syövän riski verrattuna asparagiini (N) kantajia. Lisäksi havaitsimme polymorfismi aminohappo 59 harvemmin ja ilman eroa syövän ja gastriitti näytteitä.

Aiemmissa tutkimuksissa [54] sekvenssianalyysi cagGamma
geeni osoitti, että satamat tyypillisessä SLT katalyyttisen domeenin tähteiden 33 ja 165, jonka "ES" ja "AVGAY" kuviot olivat erittäin konservoituneita ortologisista entsyymejä. Havaitsimme viisi nonsynonymous variantteja eri jakelu syövän ja gastriitti tapauksissa. Kolme näistä kartan katalyyttinen domeeni, silti yksikään niistä sijaitsee eniten konservoitunut osista verkkotunnuksen.

Vaikka tässä tutkimuksessa on rajoituksia otoskoko, se on suurin tähän mennessä kannalta määrä cagPAI geenien tutkittu syvälle sekvenssianalyysit. Muutama näytteet menetetään, koska epäonnistuminen PCR-monistus, joka voi johtua microvariabilities HP-sekvenssin.

• PLoS ONE: Effects interleukiini-10 polymorfismit, helikobakteeri-infektion, ja tupakointi on riski Noncardia mahasyövän
• PLoS ONE: DNA Repair Gene APE1 T1349G polymorfismi ja mahalaukun syövän riski on kiinalainen Population