PLOS ONE: Identification de hsa-miR-335 en tant que Signature Prognostic dans Gastric Cancer

Résumé

Contexte

Le cancer gastrique (GC) est l'un de la tumeur maligne la plus fréquente et la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer chinois. Récurrence est un facteur majeur qui conduit à l'échec du traitement et le faible niveau des taux de survie à 5 ans chez les patients du GC après résection chirurgicale. Par conséquent, l'identification de biomarqueurs ayant un potentiel pour prédire le risque de récidive est le problème essentiel du pronostic chez les patients du GC.

Patients et méthodes

Un total de 74 patients du GC ont été sélectionnés pour une analyse systématique, consistant de 31 patients avec récidive et 43 patients sans récidive. Tout d'abord, les méthodes miARN de microréseaux et de la bioinformatique ont été utilisés pour caractériser différentielles miARN exprimés à partir d'échantillons de tumeurs primaires. Après, nous avons utilisé une méthode ROC pour sélectionner la signature avec la meilleure sensibilité et la spécificité. Enfin, nous avons validé la signature dans les échantillons de GC (échantillons frais et congelés sanguins) par PCR quantitative.

Résultats

Nous avons identifié 12 miARN différentielles dont 7 régulés à la hausse et 5 miARN régulés vers le bas dans le groupe récidive. En utilisant la méthode ROC, nous avons encore apprîmes hsa-miR-335 comme une signature à reconnaître les cas de récidive et de non-récurrence dans les échantillons de formation. De plus, nous avons validé cette signature en utilisant la méthode de PCR quantitative dans 64 échantillons d'essai avec un résultat cohérent avec l'ensemble de la formation. Une récidive de fréquence élevée et faible taux de survie ont été observés dans les cas de GC avec un haut niveau de hsa-miR-335 ( P
< 0,001). En outre, nous avons évalué que hsa-miR-335 ont été impliqués dans la régulation de gènes cibles dans plusieurs signaux-voies oncogéniques, tels que p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, Toll-like receptor et adhésion focale.

Conclusion

Nos résultats indiquent que le hsa-miR-335 a le potentiel de reconnaître le risque de récurrence et se rapportent au pronostic des patients du GC

Citation:. Yan Z, Xiong Y, W Xu, Gao J, Cheng Y, Wang Z et al. (2012) Identification de hsa-miR-335 en tant que Signature Prognostic dans le cancer gastrique. PLoS ONE 7 (7): e40037. doi: 10.1371 /journal.pone.0040037

Editeur: Alfons Navarro, Université de Barcelone, Espagne

Reçu le 21 Février 2012; Accepté: 30 mai 2012; Publié 3 Juillet, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Yan et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ces auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:.. les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent

introduction

Actuellement, la chirurgie est encore la principale option pour le traitement le cancer gastrique (GC), cependant, même après avoir effectué une résection curative, environ 40-65% des patients du GC connaîtront une récurrence de la maladie éventuellement englobant récidive locale, la diffusion péritonéale ou la métastase hématogène [1], [2]. Pour cette raison, le taux de survie à 5 ans des patients GC était encore un faible niveau. Un défi majeur pour l'amélioration des résultats cliniques est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et reconnaître les signatures robustes pour le pronostic de la GC.

Plusieurs facteurs de risque, y compris l'état de séreuse pathologique, état de la marge, les changements de densité des microvaisseaux de la tumeur et l'expression des gènes en rapport avec récurrence ont été rapportés [3], [4]. En outre, quelques méthodes de prévision ou de diagnostic ont été utilisées pour évaluer le risque de récurrence sur la base de profils d'expression génique ou d'un ensemble de variables cliniques [5] - [8]. Cependant, ces observations multiples, y compris plusieurs altérations des gènes ou de protéines peuvent entraver leur application clinique. marqueurs moléculaires fiables et pratiques pour les praticiens cliniques sont nécessaires pour le pronostic en GC.

A récemment découvert des miARN sont hautement conservés dans les génomes des invertébrés, des vertébrés et des plantes. Ils remplissent des fonctions critiques dans plusieurs processus biologiques [9] y compris le calendrier de développement, la structuration et de l'embryogenèse, la différenciation, l'organogenèse et l'apoptose [10]. Compte tenu de ses multiples fonctions biologiques essentielles, il est peu surprenant que l'expression des miARN anormales va conduire à la maladie et même le cancer [11].

miARN ont été présentés comme des biomarqueurs potentiels efficaces pour tracer l'origine des tissus dans les tumeurs malignes origine primaire inconnue [12]; profils miARN d'expression sont en mesure de refléter la lignée du développement et de l'état différencié des tumeurs [11]. L'analyse systématique sur la stabilité des miARN ainsi que des conditions optimisées pour l'analyse d'expression en utilisant des échantillons de paraffine et fixés au formol sang ont été rapportés précédemment [13] - [15], mettant en lumière leur potentiel diagnostique imprévue. Il existe un nombre limité de miARN [16] dans le génome humain qui sont connus pour réguler environ 30% des gènes [17]. Ces attributs de miARN peuvent nous fournir une méthode simple pour prédire le risque de récidive chez les patients atteints de cancer.

Dans cette étude, nous avons identifié un miARN (hsa-miR-335) ayant un potentiel pour prédire le risque de récurrence du GC sur la base de puces à ADN et les données cliniques d'un échantillon de petite taille chez les patients du GC chinois. Nos résultats ont montré que hsa-miR-335 pourrait être agir comme une signature pronostique clinique pour GC.

Méthodes

Des échantillons cliniques

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de Wuhan Hôpital général du commandement de Guangzhou, PLA. Tous les patients gastriques de cancer et les patients non cancéreux souffrant de maladies digestives donné leur consentement éclairé par écrit dans notre étude.

Les patients subissant une gastrectomie pour GC potentiellement curable à l'hôpital général de Wuhan de commandement militaire de Guangzhou étaient des sujets dans cette étude. L'admissibilité à l'inclusion dans cette étude inclus histologiquement confirmé adénocarcinome de l'estomac ou gastroesophageal jonction. Tous les patients avaient reçu des résections complètes, y compris une tentative de suppression complète de la tumeur avec inclusion de larges marges négatives et lymphadénectomie rétropéritonéale étendue (type D2). Information sur clinicopathologique, thérapeutique, et les paramètres issus de patients à partir de mai 2005 à février 2012 ont été recueillies rétrospectivement. La stadification du cancer a été réalisée selon la cinquième édition de la Commission mixte américaine sur des critères Cancer TNM.

La récidive a été définie comme toute récidive du cancer, y compris les ganglions lymphatiques, de l'estomac reste, local, péritonéale et des métastases hématogènes. Tous les patients qui ont connu la récurrence du cancer ont été diagnostiqués cliniquement ou radiologiquement, et confirmé par une biopsie par endoscope gastro-intestinal supérieur ou ponction percutanée. La norme radiographique pour le diagnostic de récurrence inclus CT ou IRM de la poitrine, l'abdomen, le bassin, la tête et scintigraphie osseuse, ou d'autres tests de diagnostic qui ont été utilisées que dans des circonstances spéciales. Tous les échantillons ont été obtenus à partir d'échantillons chirurgicaux de patients atteints d'un adénocarcinome gastrique et tous les patients ont donné leur consentement écrit pour l'utilisation de ces tissus à des fins de recherche. Nous avons sélectionné des échantillons (y compris les échantillons frais et congelés) sanguins de 74 patients avec et sans GC récidive.

miRNA Microarray

L'analyse des microréseaux miRNA a été réalisée comme décrit en détail sur le site de CapitalBio ( http://www.capitalbio.com) et aussi selon la procédure de Hua [18]. En bref, 50-100 ug d'ARN total a été utilisé pour extraire miARN en utilisant un kit d'isolement miRNA AM1560 (Ambion, États-Unis). miARN fluorescéine marqué ont été utilisés pour l'hybridation sur Affymetrix miRNA Chip contenant 1075 sondes. Le signal de fluorescence ont été scannées par GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix, États-Unis). Les données brutes ont été normalisées et analysées dans Command Console GeneChip 1.1 logiciel (Affymetrix, États-Unis).

Extraction de l'ARN à partir Congelé Frais et échantillons de sang

L'ARN a été extrait des tissus congelés GC frais en utilisant une norme Trizol protocole (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pour les échantillons de sang, miRNA ont été extraites en utilisant le kit miRNease (Qiagen). En bref, 700 ul de réactif QIAzol ont été ajoutés à 200 pi d'échantillon de plasma et on fait incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, 140 ul de chloroforme ont été ajoutés, vortexés pendant 15 secondes et mises en incubation pendant 3 min à température ambiante. Ceci a été suivi par une centrifugation à 14.000 tours par minute de à 4 ° C pendant 15 min. La phase aqueuse supérieure a été retirée et 1,5 fois son volume ajouté dans 100% d'éthanol. 700 ul de chaque mélange ont été placés dans une colonne et on centrifuge à 13.000 tours par minute à la température ambiante pendant 15 sec. Suivant, 500 ul de tampon RLP a été ajouté à la colonne et on centrifuge à 13.000 tours par minute à la température ambiante pendant 2 min. La colonne a été ensuite centrifugé à 13000 tours par minute à température ambiante pour le sécher. Ce qui suit est l'étape d'élution avec 20 pi d'eau sans nucléase. L'ARN élue a été stocké à -70 ° C.

en temps réel
PCR quantitative

séquences de miARN matures ont été acquis auprès de la base de données Sanger Institute miRBase Sequence (http://microrna.sanger.ac .uk /séquences /). Tige-boucle transcription inverse (RT) amorces ont été conçues selon Chen [19]. Les conditions de réaction RT utilisés incubations impliqués à 16 ° C pendant 30 min; 37 ° C pendant 30 min puis 72 ° C pendant 10 min. Le protocole de cyclage thermique pour la PCR implique une étape de dénaturation initiale à 95 ° C pendant 5 minutes suivie de 40 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 57 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s. Les courbes de fusion pour chaque PCR ont été analysés afin de déterminer soigneusement toute amplification non spécifique. L'expression de chaque miARN a été calculé en utilisant le ^{-ΔΔ C
_{formule 2 T et normalisée à l'expression U6 snRNA [20].}}

Unsupervised Algorithme

SAM [21] a été utilisé pour effectuer le calcul de la classification non supervisée. La valeur seuil de signification a été déterminée par un delta de paramètre de réglage choisi par l'utilisateur en se basant sur le taux de faux positif et représenté par la valeur de q. Nous avons choisi un facteur de variation supérieur à 2, et q = 0 comme les critères de sélection pour l'expression différentielle des miARN.

ROC et analyse de Kaplan-Meier Survival Curve

ROC analyse de la courbe a été réalisée à l'aide les progiciels MedCalc (verison 8.2.1.0; Mariakerke, Belgique). Les courbes AUC ont fourni une mesure de la performance globale d'un test de diagnostic. Le rapport des miRNA intensités du signal et la valeur Ct de chaque miARN ont été utilisés pour le calcul ROC dans les échantillons. Les analyses de survie ont également été réalisées par le logiciel MedCalc.

Analyse statistique

Les données cliniques ont été analysées en utilisant le test du chi carré. La courbe de survie cumulative a été comparée par le test du log-rank. Pour toutes les analyses, une différence avec P
<. 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

miRNA ciblée Prediction Gene et Analyses Signal Pathway

Nous avons utilisé une cible base de données de prédiction de gènes miRNA TargetScan (http://www.targetscan.org) pour sélectionner des cibles plausibles des miARN différentielles exprimé. Une base de données de l'ontologie système d'annotation moléculaire intégrée du gène (MAS3.0, http://www.capitalbio.com) a été utilisé pour étudier les gènes miRNA ciblés et leur implication dans diverses voies de signalisation.

Résultats

Caractéristiques cliniques des patients
GC

Un total de 74 patients avec /sans récidive ont été sélectionnés pour une analyse systématique. 31 patients avaient récurrent GC qui a été prouvé pathologiquement par biopsie sur les sites d'anastomose par endoscopie. 43 patients sans récidive ont été sélectionnés en tant que groupe de contrôle avec des allumettes dans le sexe, l'âge au moment du diagnostic, la classification TNM, le traitement et le nombre de ganglions lymphatiques impliqués (tableau 1).

Il n'y avait pas de différence significative dans le sexe ( P
= 0,469), l'âge ( P
= 0,502), l'emplacement de la tumeur ( P
= 0,299), Différenciation ( P
= 0,511) , ganglionnaire résection ( P
= 0,217) et le statut de la chimiothérapie adjuvante ( P
= 0,214). Il y avait des différences significatives au stade UICC ( P
= 0,108) et le taux de survie /mort noté (8/23 dans la récurrence groupe vs 34/9 dans le groupe non-récurrence, P
<0,001), avec un temps de survie médiane de 18,9 mois en récidive contre 43,9 mois dans le groupe non-récurrence respectivement ( P
<. 0,001) (tableau 1)

miRNA expression Profils associés avec GC récurrence

Nous avons utilisé une puce miARN microarray pour mesurer miARN niveaux d'expression dans 10 échantillons de GC avec /sans récidive (5/5) comme un ensemble de formation. Lorsque l'on compare l'expression miRNA entre les groupes, 7 up-régulé et 5 miARN régulés vers le bas ont été trouvés qui étaient statistiquement significatives dans le groupe GC récurrente (tableau 2). Ces 12 miARN pourraient être utilisés pour discriminer entre GC avec et sans récidive basée sur une analyse de classification hiérarchique (Figure 1).

hsa-miR-335 est le meilleur Signature pour Classifier GC avec et sans Récurrence dans la formation Set

Nous avons utilisé la méthode ROC pour analyser la sensibilité et la spécificité des biomarqueurs candidats basés sur des données de biopuces miARN. Nous avons obtenu 2 miARN hsa-miR-335 et hsa-miR-128b avec la meilleure sensibilité et la spécificité de la classification des échantillons de GC avec et sans récidive (figure 2, tableau 3). Combiné avec la valeur FC (FC _{hsa-miR-335 = 4,675; FC hsa-miR-128b = 1.453) de chaque biomarqueur, nous choisissons hsa-miR-335 pour une étude plus approfondie}

validation de la signature dans les échantillons de test par
PCR en temps réel

le niveau de hsa-miR-335 expression a été détectée par PCR en temps réel dans 64 échantillons de GC de test par rapport au tissu adjacent appariés comme témoin. Les résultats ont montré que, dans 26 cas avec récidive, 21 cas (21/26, 80,8%) étaient élevés exprimé des hsa-miR-335; et dans 38 cas sans récidive, 29 cas (29/38, 76,3%) étaient à faible exprimé des hsa-miR-335 (Figure 3). Les mêmes résultats ont été observés dans des échantillons de sang en utilisant un échantillon de sang mêlé de 20 patients non cancéreux souffrant de maladies digestives que le contrôle: Dans 26 cas avec récidive, 19 cas (19/26, 73,1%) étaient élevés exprimé des hsa-miR -335; et dans 38 cas sans récidive, 30 cas (30/38, 78,9%) étaient à faible exprimé des hsa-miR-335 (Figure 3). Il y avait 11 cas (11/64, 17,2%) ne correspond pas au niveau de l'expression de hsa-miR-335 en comparaison des résultats entre les échantillons frais et congelés sang.

En outre, nous avons détecté le niveau d'expression de hsa-miR-128b dans 64 échantillons de sang de GC en utilisant la PCR en temps réel. Les résultats ont montré que, dans 26 cas avec récidive, 18 cas (18/26, 69,2%) étaient élevés exprimé des hsa-miR-128b; et dans 38 cas sans récidive, 27 cas (27/38, 71,1%) étaient à faible exprimé des hsa-miR-128b. La valeur FC de hsa-miR-128b et hsa-miR-335 étaient 1.647 et 3.589 lorsque la récidive par rapport aux échantillons non-récurrence, respectivement (figure 4A). Nous avons également analysé la sensibilité et la spécificité de hsa-miR-335, hsa-miR-128b et hsa-miR-335 /128b (combiné avec miR-335 et miR-128b comme une signature) sur la base du temps réel des données de PCR. Les résultats ont montré que hsa-miR-335 était plus sensible et spécifique avec une valeur AUC de 0,88 que hsa-miR-128b (AUC = 0,79) et hsa-miR-335 /128b (AUC = 0,84) dans la classification récurrence et non échantillons de récurrence (figure 4B, tableau 3).

hsa-miR-335 en tant que Signature Progression de la maladie pour prédire le risque de récurrence chez les patients
GC

Les 74 patients du GC ont été divisés en deux groupes, y compris 31 patients avec récidive en tant que groupe et 43 patients sans récidive en tant que groupe. Les patients qui ont subi une récidive de GC avaient un taux médian de survie significativement réduite ( P
< 0,001; la figure 5A). Nous avons détecté des niveaux de hsa-miR-335 expression dans tous les 74 échantillons de GC. Une différence significative est observée dans les deux groupes qui représentent la haute exprimée SAH-miR-335 et le groupe à faible exprimée hsa miR-335-groupe comme suit: miR-335 (+) et miR-375 (-). patients du GC (n = 35) avec miR-335 (+) ont réduit de manière significative la médiane de survie par rapport à ceux (n = 39) avec miR-375 (-) ( P
< 0,001; la figure 5B).

voie de signalisation et Gene Ontology Analyses de hsa-miR-335 gènes ciblés

afin d'étudier les mécanismes de régulation possibles de la hsa-miR-335 dans le processus de GC récidive, nous avons utilisé une base de données de bioinformatique pour sélectionner des cibles plausibles de ce miARN. Un total de 255 gènes ont été prédit que les gènes cibles de hsa-miR-335. La voie de signalisation des analyses ont montré que la plupart des gènes ciblés qui ont été réglementées par hsa-miR-335 ont été impliqués dans les mêmes voies, telles que p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, récepteur Toll-like, adhésion focale ( Le tableau 4, figure 6). Nous avons proposé que ces multiples altérations de la voie pourraient être impliqués dans les caractéristiques pathologiques cliniques et le résultat de patients du GC. Pendant ce temps, nous avons utilisé une base de données de l'ontologie génétique intégrée pour annoter la fonction moléculaire des gènes miRNA ciblés. Les résultats ont montré que les gènes régulés par hsa-miR-335 ont participé à la plupart des processus biologiques importants associés au cancer humain (tableau 5).

Discussion

Récurrence est fréquente chez les patients de GC après une chirurgie; il est donc important d'identifier les cas présentant un risque élevé de récidive. clinique traditionnel facteurs pathologiques sont parfois insuffisants pour la prédiction de la récidive chez les personnes et de nombreux groupes de recherche ont tenté d'identifier des biomarqueurs en utilisant les nouvelles technologies qui pourraient distinguer ces cas à risque élevé. Un certain nombre d'études récentes ont documenté des modifications miARN qui sont impliqués dans l'initiation et la progression des cancers humains. expression de miRNA profilage des tumeurs humaines ont identifié des signatures d'expression associés à un diagnostic, la mise en scène, la progression, le pronostic et la réponse au traitement.

Dans cette étude, nous avons analysé les cas de GC primaires afin de prédire la récurrence de la maladie et défini non récurrent cas que ceux sans GC pendant au moins un an après résection curative. Nous avons identifié hsa-miR-335 comme une signature pronostique plausible de GC sur la base des données de biopuces à partir de 10 échantillons de GC comme ensemble d'apprentissage. En outre, nous avons validé cette signature sur 64 échantillons de test ayant plus d'une moyenne de 85% de sensibilité et de spécificité. Les analyses de survie résultats ont montré que les patients avec des niveaux élevés d'expression de hsa-miR-335 ont réduit le taux de survie globale par rapport à ceux qui ont de faibles niveaux d'expression de hsa-miR-335. Ces résultats indiquent que cette signature avait le potentiel pour prédire la récurrence du GC.

La technologie des biopuces a développé considérablement et devenir une méthode complète et utile pour nous aider à mieux comprend les cancers [22]. Il est maintenant largement utilisé pour étudier les rôles fonctionnels des miARN dans de nombreux types de cancer [23], avec plusieurs effets miRNA significatifs sur oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur identifiés. Sur les 12 miARN identifiés dans cette étude, hsa-miR-373 était l'un des miARN régulés à la baisse dans le groupe récurrent. Cela peut être un oncogène fonctionnant par la voie p53 bien connue qui est impliquée dans la carcinogenèse [24]. Certains miARN, comme hsa-miR-19a et hsa-miR-32, sont situés dans des régions génomiques associées au cancer, qui pourraient être impliqués dans des tumeurs malignes par la suppression, l'amplification, ou mécanismes de modification épigénétiques [25]. En outre, hsa-miR-429 étaient régulés à la hausse dans les cas récurrents et regroupés sur le chromosome 1, confirmant que certains miARN tels que hsa-miR-200b sont regroupés avec hsa-miR-429 et en mesure de co-réguler leurs gènes cibles [26 ].

Jusqu'à présent, le miARN désigné dans cette étude pour prédire le risque de récidive GC n'a pas été bien caractérisée. hsa-miR-335, qui est transcrit à partir de la région du chromosome 7q32.2 génomique, a été rapportée à une différence exprimée dans les tumeurs bénignes et malignes [27]. Surtout, il est également démontré que miR-335 régule Rb1 et le contrôle de la prolifération cellulaire d'une manière dépendante de p53 [28]; participe au développement du cancer du sein [29]; régule la croissance et l'invasion des cellules malignes [30]. La dernière recherche indique que miR-335 pourrait fonctionner comme un suppresseur de métastases dans le GC en ciblant la protéine Bcl-2 et SP1, et pourrait encore être développé comme un facteur pronostique potentiel [31]. Pour résumer les points de vue ci-dessus, la fonction de miR-335 a été controversée. Nos résultats montrent que hsa-miR-335 a été régulée à la hausse dans les échantillons GC de récurrence et impliqués dans la plupart des voies de signalisation oncogènes, tels que p53, MAPK, TGF-β, Wnt, erbB, mTOR, récepteur Toll-like, adhésion focale . Ces multiples altérations de la voie de signal, en particulier, y compris la voie p53, pourraient raisonnablement affecter les résultats cliniques, y compris le risque de récurrence GC [32]. Bien que le rôle pronostique de hsa-miR-335 dans le cancer gastrique est inconnue, nos résultats sont encourageants.

Le sang est l'échantillon le plus accessible dans les hôpitaux. La signification clinique de l'identification de biomarqueurs qui pourraient être facilement détectés comme hsa-miR-335 est évidemment. En outre, les spécimens enrobés de paraffine archivées sont aussi l'un des matériaux facilement disponibles dans les hôpitaux, qui sont souvent conservés avec des données clinico bien documentées. Ils représentent d'excellentes sources pour l'application pronostique dans la recherche fondamentale et les études cliniques. miARN varient en taille de 19-25 nt et ils sont protégés par le complexe de silençage induit par l'ARN, ce qui peut les rendre moins sensibles à la dégradation de l'ARN par rapport à l'ARNm dans ces tissus [33]. Ainsi, nous avons pu détecter l'expression des miARN dans des échantillons de paraffine et concentrés sur l'analyse systématique en utilisant cette signature pour la valeur pronostique pertinente. Par conséquent, la méthode de classification basée sur la PCR semble nous fournir un moyen, en utilisant des échantillons cliniques facilement disponibles, pour prédire la récidive de la maladie.

En résumé, nous avons identifié un miRNA lié pronostic, qui peut prédire le risque de récurrence de les patients atteints de GC. En combinant cette signature avec des facteurs clinicopathologiques classiques, nous devrions être en mesure de prédire la maladie de résultats d'un patient avec plus de précision. En outre, l'identification des patients à risque élevé conduirait à l'examen de l'intervention thérapeutique supplémentaire et peut ainsi informer le médecin d'un meilleur programme de suivi.

Remerciements

Nous remercions le Dr Li Wang (Institut national des sciences de la santé environnementale, États-Unis) pour les commentaires de la perspicacité et l'édition de manuscrits.

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