PLoS ONE: Идентификация HSA-MIR-335 в качестве прогностического подписи в рака желудка

Абстрактный

Фон
<р> Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований и основной причиной смерти у китайских больных раком. Рецидив является основным фактором, что приводит к неэффективности лечения и низкий уровень выживаемости 5 лет у больных ГЦ следующей хирургической резекции. Таким образом, идентификация биомаркеров с потенциалом в прогнозировании риск рецидива является ключевой проблемой прогноза у больных ГЦ.

Пациенты и методы
<р> В общей сложности 74 пациентов GC были выбраны для систематического анализа, состоящий из 31 пациентов с рецидивом и 43 больных без рецидива. Во-первых, микроРНК микрочипов и биоинформатики методы были использованы для характеристики дифференциальных выраженных микроРНК из первичных образцов опухолей. После, мы использовали метод ROC, чтобы выбрать подпись с лучшей чувствительностью и специфичностью. Наконец, мы проверены подписи в образцах GC (замороженные свежие и образцы крови) с помощью количественной ПЦР.

Результаты
<р> Мы определили 12 дифференциальных микроРНК в том числе 7 до регулируемой и 5 вниз регулируемых микроРНК в группе рецидивов. Используя метод ROC, мы также констатировали HSA-MIR-335 в качестве подписи, чтобы признать повторения и неповторения случаев в учебных образцов. Кроме того, мы проверены эту подпись с помощью количественного метода ПЦР в 64 образцах с последовательным результата с обучающего набора. Высокая частота рецидивов и бедными выживаемости наблюдались в тех случаях GC с высоким уровнем HSA-MIR-335 ( P
&л; 0,001). Кроме того, мы оценили, что HSA-микроРНК-335 были вовлечены в регуляции генов-мишеней в нескольких онкогенных сигнальными путями, такими как р53, МАРК, TGF-β, Wnt, ErbB, МРМ, Toll-подобный рецептор и фокальные контакты. <Бр>

Вывод изображения

Наши результаты указывают на то, что HSA-микроРНК-335 имеет потенциал, чтобы признать риск рецидива и относятся к прогнозу больных ГХ
<р> Образец цитирования:. Ян Z, Сюн Y, W Сюй, Гао J, Cheng Y, Z Wang и др. (2012) Идентификация HSA-MIR-335 в качестве прогностического подписи в рака желудка. PLoS ONE 7 (7): e40037. DOI: 10.1371 /journal.pone.0040037
<р> Редактор: Alfons Navarro, Университет Барселоны, Испания
<р> Поступило: 21 февраля 2012 года; Принято: 30 мая 2012 года; Опубликовано: 3 Июля, 2012
<р> Copyright: © 2012 Ян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эти авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> в настоящее время операция по-прежнему является основным вариантом для лечения рак желудка (GC), тем не менее, даже после выполнения целебное резекцию, примерно 40-65% пациентов GC будет испытывать рецидив болезни, возможно, охватывающий местный рецидив, перитонеальный распространение или гематогенная метастазирование [1], [2]. По этой причине, 5-летняя выживаемость пациентов ГХ еще в низком уровне. Одной из основных задач для улучшения клинических результатов, чтобы лучше понять молекулярные механизмы и распознавать устойчивые подписи для прогноза GC.
<Р> Несколько факторов риска, в том числе патологические серозной состояние, состояние запаса, изменения плотности опухоли микрососудов и экспрессии генов, связанных с рецидивы сообщалось [3], [4]. Кроме того, несколько прогнозирующие или диагностические методы, которые были использованы для оценки риска рецидива, которая базируется на экспрессии генов профилирование или набор клинических переменных [5] - [8]. Тем не менее, эти многочисленные наблюдения, включая несколько генов или белков изменения могут затруднить их клиническое применение. Надежные и удобные молекулярные маркеры для клинической практике необходимы для прогнозирования в GC.
<Р> Недавно обнаруженная микроРНК высоко консервативны в геномах беспозвоночных, позвоночных животных и растений. Они служат критически важные функции нескольких биологических процессов [9] в том числе времени развития, формирования рисунка и эмбриогенеза, дифференциации, органогенеза и апоптоз [10]. Принимая во внимание его многочисленные существенные биологические функции, это не удивительно, что выражение ненормальные микроРНК приведет к болезни и даже рак [11].
<Р> микроРНК были представлены в качестве эффективных потенциальных биомаркеров для отслеживания происхождения тканей при злокачественных опухолях неизвестно Первоисточник [12]; выражение микроРНК профили могут отражать происхождение с развитием и дифференцированное состояние опухолей [11]. Систематический анализ на устойчивость микроРНК, а также оптимизированные условия для анализа экспрессии с использованием фиксированных формалином погруженных в парафин и образцы крови были ранее сообщалось [13] - [15], чтобы пролить свет на их непредвиденного диагностического потенциала. Есть ограниченное количество микроРНК [16] в геноме человека, которые, как известно, регулируют примерно 30% генов [17]. Эти атрибуты микроРНК могут предоставить нам простой метод для прогнозирования риска рецидивов онкологических больных
. <Р> В этом исследовании мы выявили микроРНК (HSA-MIR-335), имеющий потенциал для прогнозирования рецидивов риск GC основанный на микрочипе и клинических данных образца малогабаритного в китайских пациентов GC. Наши результаты показали, что HSA-микроРНК-335 может быть выступать в качестве клинической прогностической подписи для GC.

методы

Клинические образцы
<р> Это исследование было одобрено Комитетом по этике Ухань больницы общего профиля Гуанчжоу командования НОАК. Все у больных раком желудка и нераковых больных с заболеваниями органов пищеварения дали письменное информированное согласие в нашем исследовании.
<Р> Пациенты, гастрэктомию для потенциально излечимых GC в больнице общего профиля Ухань военного командования Гуанчжоу были предметом данного исследования. Право на участие для включения в исследование было включено гистологически подтвержденный аденокарциномы желудка или желудочно-пищеводного соединения. Все пациенты получили полную резекцию, включая попытку полного удаления опухоли с включением широких отрицательных полей и расширенной забрюшинной лимфаденэктомии (типа D2). Информация о клиникопатологическими, терапевтических и параметров исходов пациентов с мая 2005 года по февраль 2012 года был собран ретроспективно. Рак постановка была выполнена в соответствии с пятым изданием Американской совместной комиссии по критериям рака TNM.
<р> Рецидив был определен как любой рецидив рака, включая лимфатических узлов, желудка остатка, местного, перитонеальный и гематогенных метастазов. Все пациенты, которые испытали рецидив рака были диагностированы клинически или рентгенологически и подтвержден биопсией с помощью верхних отделов желудочно-эндоскопа или чрескожной пункции. Рентгенографический стандарт для диагностики рецидива включены КТ или МРТ сканирование грудной клетки, брюшной полости, малого таза, головы и кости или другие диагностические тесты, которые использовались только при особых обстоятельствах. Все образцы были получены из образцов хирургических больных с аденокарциномой желудка и все пациенты дали письменное согласие на использование этих тканей в исследовательских целях. Мы отобрали пробы (в том числе замороженных свежих и крови) из 74 пациентов с и без GC рецидива.

микроРНК микрочипов
<р> Анализ микрочипов микроРНК проводили, как описано подробно на сайте CapitalBio ( http://www.capitalbio.com), а также в соответствии с процедурой, Хуа [18]. В кратком изложении, 50-100 мкг общей РНК использовали для извлечения микроРНК, используя набор для выделения микроРНК AM1560 (Амбион, США). Меченных флуоресцеином микроРНК использовали для гибридизации на Affymetrix микроРНК чип, содержащий 1075 зонды. Сигнал флуоресценции были отсканированы с помощью сканера GeneChip 3000 7G (Affymetrix, США). Исходные данные были нормализованы и проанализированы в GeneChip Command Console 1.1 программного обеспечения (Affymetrix, США).

Экстракция РНК из замороженных свежих и образцов крови
<р> РНК экстрагировали из замороженных свежих тканей GC с использованием стандартного Trizol протокол (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Для получения образцов крови, микроРНК извлекали с использованием набора miRNease (Qiagen). Вкратце, 700 мкл реагента QIAzol добавляли к 200 мкл образца плазмы, и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 140 мкл хлороформа, встряхивают в течение 15 сек и инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре. За этим последовало центрифугирование 14000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Верхняя, водянистый фазу удаляли и в 1,5 раза его объема добавили в 100% этаноле. Каждые 700 мкл смеси наносили на колонку и центрифугировали при 13000 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 15 сек. После, 500 мкл буфера для РПЛ был добавлен в колонку и центрифугировали при 13000 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 2 мин. Колонку затем центрифугировали при 13000 оборотах в минуту при комнатной температуре, чтобы высушить его. Следующим был стадии элюирования с 20 мкл нуклеазы без воды. Элюированные РНК хранили при -70 ° C.

в режиме реального времени Количественная ПЦР
<р> Зрелые микроРНК последовательности были получены из базы данных Sanger Institute miRBase последовательности (http://microrna.sanger.ac .uk /последовательности /). Стебель-петля обратной транскрипции (RT) праймеры были разработаны в соответствии с Ченом [19]. Условия реакции RT используются вовлеченные инкубацию при 16 ° С в течение 30 мин; 37 ° С в течение 30 мин, а затем 72 ° С в течение 10 мин. Термический протокол велосипедного для ПЦР участвуют начальной стадии денатурации при 95 ° С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 57 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 30 с. Кривые расплава для каждой ПЦР были тщательно проанализированы, чтобы определить, какой-либо неспецифической амплификации. Выражение каждого микроРНК была рассчитана с использованием -ΔΔ C
<суб> T формула 2 и нормализованная к экспрессии U6 мяРНК [20].

неконтролируемой Алгоритм
<р> SAM [21] была использована для выполнения расчета неконтролируемой кластеризации. Отсечка по значимости была определена с помощью параметра настройки дельты, выбранного пользователем на основе ложных срабатываний и представленным значением д. Мы выбрали складка изменение больше 2, и д = 0 в качестве критерия отбора для дифференциальной экспрессии микроРНК.

РПЦ и Каплан-Майера выживания кривой Анализ
<р> анализ кривой ROC проводили с использованием программные пакеты MedCalc (verison 8.2.1.0; Mariakerke, Бельгия). ППК кривые при условии меру эффективности работы диагностического теста. Отношение интенсивностей сигналов микроРНК и значения Ct каждого микроРНК были использованы для расчета ROC в образцах. Анализ выживаемости также были выполнены с помощью программного пакета MedCalc.

Статистический анализ
<р> Клинические данные были проанализированы с помощью теста хи-квадрат. Совокупное кривая выживаемости сравнивали с помощью теста лог-ранга. Для всех анализов, разница с P
&л;. 0,05 считалось статистически значимым

микроРНК целевого гена Прогнозирование и сигнального пути Анализы
<р> Мы использовали целевой базы данных предсказания генов микроРНК TargetScan (http://www.targetscan.org) для выбора вероятных целей дифференциальных выразил микроРНК. Интегрированная база данных генов Онтология молекулярной системы аннотацию (MAS3.0, http://www.capitalbio.com) был использован для изучения микроРНК целевых генов и их участие в различных сигнальных путей.

Результаты

Клинические характеристики GC Пациенты
<р> в общей сложности 74 пациентов с /без рецидива были выбраны для систематического анализа. 31 пациентов были повторяющимися GC, что было доказано с помощью биопсии патологически на анастомоза сайтов через эндоскопии. 43 пациентов без рецидива были выбраны в качестве контрольной группы с матчей в пол, возраст на момент постановки диагноза, TNM постановки, лечения и количества вовлеченных лимфатических узлов (таблица 1).
<Р> Там не было никаких существенных различий в сексе ( P
= 0,469), возраст ( P
= 0,502), Опухоль местоположение ( P
= 0,299), Дифференциация ( P
= 0,511) , лимфоузлов резекция ( P
= 0,217) и статус адъювантной химиотерапии ( P
= 0,214). Были значительная разница в UICC стадии ( P
= 0,108) и коэффициент выживаемости /смерти отмечено (8/23 в группе рецидивов против прогноза 34/9 в неповторения группе, P &
л; 0,001), со средним временем выживания 18,9 месяцев рецидива против 43,9 месяцев в неповторения группе соответственно ( P
&л;. 0,001) (таблица 1)

микроРНК профили экспрессии ассоциированных с GC Recurrence

Мы использовали микросхему микроРНК микрочипов для измерения уровней экспрессии микроРНК в 10 образцах GC с /без рецидива (5/5) в качестве обучающей выборки. При сравнении экспрессии микроРНК между группами, 7 повышающей регуляции и 5 вниз регулируется микроРНК было обнаружено, что было статистически значимым в группе ГК рецидивирующим (таблица 2). Эти 12 микроРНК могут быть использованы для различения между GC и без рецидива на основе иерархического кластерного анализа (рисунок 1).

HSA-микроРНК-335 является лучшим подписи для классифицируя GC с и без Рекурренции в обучающем наборе
<р> Мы использовали метод ROC для анализа чувствительности и специфичности кандидата биомаркеров на основе данных микрочипов микроРНК. Мы получили 2 микроРНК HSA-микроРНК-335 и HSA-микроРНК-128B с лучшей чувствительности и специфичности в классификации образцов GC и без рецидива (рисунок 2, таблица 3). В сочетании со значением FC (FC <суб> HSA-микроРНК-335 = 4,675; FC <суб> HSA-микроРНК-128b = 1,453) каждого биомаркера, мы выбираем HSA-MIR-335 для дальнейшего изучения

Проверка подписи в испытательных образцов с помощью ПЦР в реальном времени

уровень экспрессии HSA-MIR-335 был обнаружен ПЦР в реальном времени в 64 образцах теста GC по сравнению с согласованной смежной ткани в качестве контроля. Результаты показали, что в 26 случаях с рецидивом, 21 случаев (21/26, 80,8%) были высокой выраженности HSA-MIR-335; и в 38 случаях без повторения, 29 случаев (29/38, 76,3%) были низкими выражены АСП-MIR-335 (Рисунок 3). Те же результаты были получены в образцах крови с использованием образца смешанной крови от 20 нераковых больных с заболеваниями органов пищеварения, как контроль: В 26 случаях с рецидивами, 19 случаев (19/26, 73,1%) были высокого выражены АСП-Mir -335; и в 38 случаях без повторения, 30 случаев (30/38, 78,9%) были низкими выражены АСП-MIR-335 (Рисунок 3). Были 11 случаев (11/64, 17,2%), не совпадающая в уровне экспрессии HSA-MIR-335 в сравнении результатов между замороженных свежих и крови.
<Р> Кроме того, мы обнаружили уровень экспрессии АСП-MIR-128b в 64 образцах крови GC с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что в 26 случаях с рецидивом, 18 случаев (18/26, 69,2%) были высокой выраженности HSA-MIR-128b; и в 38 случаях без повторения, 27 случаев (27/38, 71,1%) были низкими выражены АСП-MIR-128b. Значение FC АСП-MIR-128b и HSA-микроРНК-335 были 1,647 и 3,589 по сравнению с образцами, рецидивы неповторения, соответственно (рис 4а). Мы также проанализировали чувствительность и специфичность HSA-MIR-335, HSA-MIR-128b и HSA-MIR-335 /128b (в сочетании с микроРНК-335 и микроРНК-128b в качестве подписи) на основе данных в реальном времени ПЦР. Результаты показали, что HSA-микроРНК-335 был более чувствительным и специфичным с АУК значения 0,88, чем HSA-MIR-128b (AUC = 0,79) и HSA-MIR-335 /128b (AUC = 0,84) при классификации рецидива и не- образцы повторения (рис 4B, таблица 3).

HSA-микроРНК-335 в качестве Прогрессирование заболевания Подпись Предсказывать риск рецидива в GC пациенты

74 пациентов GC были разделены на две группы, в том числе 31 пациентов с рецидивом в качестве группы и 43 пациентов без рецидива в качестве группы. Пациенты, которые испытали рецидив GC была значительно сниженный медиану выживаемости ( P
&л; 0,001; рис 5А). Мы обнаружили, уровни экспрессии HSA-MIR-335 во всех 74 образцах GC. Существенное различие наблюдалось в двух группах, которые представляют собой высоко-выраженный АСП-микроРНК-335 и группы с низким выраженный АСП-микроРНК-335 группы следующим образом: микроРНК-335 (+) и микроРНК-375 (-). GC пациентов (N = 35) с MIR-335 (+) была значительно снижена медианы выживаемости по сравнению с теми, (п = 39) с MIR-375 (-) ( P
≪ 0,001; Фиг.5В).

сигнальным каскадом и Джин Онтология Анализы HSA-микроРНК-335 целевых Гены
<р> для того чтобы исследовать возможные механизмы регуляции HSA-MIR-335 в процессе GC рецидива, мы использовали база данных биоинформатики для выбора вероятных целей этой микроРНК. В общей сложности 255 генов были предсказаны в качестве генов-мишеней АСП-MIR-335. Сигнальный путь анализа показали, что большинство целевых генов, которые регулируются с помощью HSA-микроРНК-335 были вовлечены в одних и тех же путей, таких как р53, МАРК, TGF-β, Wnt, ErbB, МРМ, Toll-подобный рецептор, фокальной адгезии ( В таблице 4, рисунок 6). Мы предположили, что эти многочисленные изменения проводящих путей могут быть вовлечены в клинических патологических особенностей и исхода пациентов ГК. В то же время, мы использовали интегрированную базу данных генов онтологий для аннотирования молекулярную функцию микроРНК целевых генов. Результаты показали, что гены, регулируемые HSA-MIR-335 участвовал в большей части важного биологического процесса, связанного с человеческим раком (таблица 5).

Обсуждение
<р> Рецидив часто у пациентов после операции GC; Поэтому важно выявлять случаи с высоким риском рецидива. Традиционные клиники патологические факторы, иногда недостаточно для прогнозирования рецидивов у лиц и многих исследовательских групп попытались определить биомаркеры с использованием новых технологий, которые могли бы отличить эти случаи с высокой степенью риска. Ряд недавних исследований документально микроРНК изменения, которые участвуют в инициации и развитии злокачественных опухолей человека. выражение микроРНК профилирование опухолей человека определили сигнатуры экспрессии, связанные с диагнозом, постановка, прогрессии, прогноза и реакции на лечение.
<р> В этом исследовании мы проанализировали основные случаи GC для прогнозирования рецидива заболевания и определены единовременные случаи, как те, которые свободны от GC, по крайней мере, одного года после лечебной резекции. Мы определили HSA-MIR-335 в качестве вероятного прогноза подписания GC на основе микрочипов данных из 10 образцов GC как обучающей выборки. Кроме того, мы подтверждено эту подпись на 64 образцах с более чем в среднем на 85% чувствительности и специфичности. Анализ выживаемости Результаты показали, что у пациентов с высокими уровнями экспрессии HSA-MIR-335 уменьшили общую выживаемость по сравнению с теми, с низким уровнем экспрессии HSA-MIR-335. Эти результаты указывают на то, что эта подпись имела потенциал для прогнозирования рецидива GC.
<Р> технология микрочипов значительно разработала и стала всеобъемлющей и полезный метод, чтобы помочь нам лучше понимает рака [22]. В настоящее время широко используется для изучения функциональные роли микроРНК во многих типах рака [23], с несколькими значительными эффектами микроРНК на онкогенов и генов-супрессоров опухолей, выявленных. Из 12 микроРНК выявленных в этом исследовании, HSA-микроРНК-373 был одним из вниз регулируется микроРНК в рецидивирующего группе. Это может быть онкоген функционирует по хорошо известному пути р53, который участвует в процессе канцерогенеза [24]. Некоторые микроРНК, такие как HSA-MIR-19а и HSA-MIR-32, расположены в раковых ассоциированных геномных областей, которые могут быть вовлечены в злокачественные новообразования с помощью делеции, амплификации или эпигенетических механизмов модификации [25]. Кроме того, HSA-микроРНК-429 были до регулируемых в рецидивирующих случаях и кластерный на хромосоме 1, подтверждая, что некоторые микроРНК, такие как HSA-MIR-200b сгруппированы с HSA-MIR-429 и способны совместно регулировать свои целевые гены [26 ].
<р> до сих пор микроРНК назначенный в данном исследовании не предсказать риск рецидива ГК не были хорошо охарактеризованы. HSA-микроРНК-335, которая транскрибируется из геномной области хромосомы 7q32.2, сообщается перепаду выраженная в доброкачественных и злокачественных опухолей [27]. Важно отметить, что также показано, что микроРНК-335 регулирует пролиферацию клеток RB1 и контролирует в р53-зависимым способом [28]; участвует в развитии рака молочной железы [29]; регулирует рост и инвазию злокачественных клеток [30]. Последние исследования сообщает, что микроРНК-335 может функционировать как метастаз подавитель в Генеральном ориентации Bcl-2 и SP1, и может быть дальнейшее развитие в качестве потенциального прогностического фактора [31]. Подводя итог выше точки зрения, функция микроРНК-335 был спорным. Наши результаты показывают, что HSA-микроРНК-335 был до регулируемых в образцах GC рецидива и участвует в большинстве онкогенных сигнальных путей, таких как р53, МАРК, TGF-β, Wnt, ErbB, МРМ, Toll-подобный рецептор, фокальной адгезии , Эти многочисленные изменения сигнального пути, особенно в том числе p53 пути, могут обоснованно повлиять на клинический исход, включая GC риск рецидива [32]. Хотя прогностическая роль HSA-MIR-335 при раке желудка неизвестна, наши результаты обнадеживают.
<Р> Кровь является наиболее доступной выборки в больницах. Клиническая значимость идентификации биомаркеров, которые могут быть легко обнаруживаемых как HSA-MIR-335, очевидно. Кроме того, заархивированные парафином образцы также являются одним из легко доступных материалов в больницах, которые часто хранятся с хорошо документированных данных клинико-патологическими. Они представляют собой отличные источники для прогностического применения как в фундаментальных исследованиях и клинических исследованиях. микроРНК в диапазоне размеров от 19-25 нт и они защищены РНК-индуцированного глушителей комплекса, который может сделать их менее восприимчивыми к деградации РНК по сравнению с мРНК в этих тканях [33]. Таким образом, нам удалось обнаружить экспрессию микроРНК в залитых парафином образцов и сосредоточился на систематическом анализе с использованием этой подписи для соответствующего прогностическое значение. Метод классификации на основе ПЦР поэтому, как представляется, обеспечивает нам способом, используя легко доступные клинические образцы, чтобы предсказать рецидив заболевания.
<Р> Таким образом, мы определили прогноз, связанные с микроРНК, которые могут предсказать риск рецидива в GC пациентов. Объединив эту подпись с обычными клиникопатологическими факторами, мы должны быть в состоянии предсказать исход заболевания пациента более точно. Кроме того, идентификация пациентов с высоким риском привело бы к рассмотрению дополнительного терапевтического вмешательства и может таким образом сообщить врачу о лучшей последующей программы.

Выражение признательности
<р> Мы благодарим доктора Ван Ли (Национальный институт гигиены окружающей среды наук, США) за Инсайт комментарии и рукописи редактирования.

• PLoS ONE: уменьшение экспрессии гена ARID1A ассоциируется с плохим прогнозом в первичном Желудочный Cancer
• PLoS ONE: клинический потенциал метилирования ДНК в желудочном рака: мета-Analysis