Résumé
Contexte
Le cancer gastrique (GC) est associée à des taux élevés de mortalité et un pronostic défavorable à un stade avancé. En outre, il n'y a pas de méthodes efficaces pour le diagnostic du cancer gastrique à un stade précoce ou pour prédire les résultats dans le but de sélectionner les options de traitement spécifiques aux patients. Par conséquent, il est important d'étudier de nouvelles méthodes de diagnostic par GC.
Pour faciliter son utilisation dans un cadre de diagnostic, un groupe de 74 gènes avec des informations de diagnostic et de pronostic a été traduit en une puce personnalisée contenant un ensemble réduit
Méthodologie /Principaux résultats de 1042 sondes appropriées pour le traitement à haut débit. Dans ce rapport, nous démontrons pour la première fois que la coutume mini-réseau peut être utilisé comme un outil de diagnostic fiable dans le cancer gastrique. Avec une valeur AUC de 0,565 (IC à 95% 0,305 au 0,825) indiquant un test parfait, la sensibilité et la spécificité du diagnostic de la courbe ROC ont été calculés à 70% et 80%, respectivement.
Conclusions /Importance
Les données démontrent clairement la reproductibilité et la robustesse de la petite microréseau sur mesure. Le réseau est un excellent outil pour classer et prédire l'issue de la maladie chez les patients atteints de cancer gastrique
Citation:. Yin Y, Zhuo W, Y Zhao, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) Conversion d'une signature dans un test de diagnostic de biopuces: Un essai de Custom 74 Gene tableau pour la clarification et la prévision du pronostic du cancer gastrique. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10.1371 /journal.pone.0081561
Editeur: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, États-Unis d'Amérique
Reçu le 25 Juin 2013; Accepté le 14 Octobre 2013; Publié 3 Décembre, 2013 |
Droit d'auteur: © 2013 Yin et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités
Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation de Chine Natural (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Programme national de recherche de base de la Chine (973 Programme) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit
Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent
Introduction
le cancer gastrique (GC) a une incidence élevée et est la deuxième cause de mortalité par cancer [1,2]. Le pronostic de la GC est fortement dépendante du stade de la maladie au moment du diagnostic et la méthode de traitement [3]. Le taux de survie à 5 ans chez les patients atteints de cancer gastrique avancé est d'environ 20%, alors que dans le cancer gastrique à un stade précoce, il est supérieur à 60% [4-6]. Cependant, il n'y a pas eu de méthodes efficaces et réalisables pour la détection du cancer de stade précoce et pour prédire le pronostic possible de fournir un traitement approprié à chaque patient. Au Japon, bien qu'ils pourraient plus efficacement détecter et traiter le cancer gastrique au début (EGC) grâce à un dépistage étendu, que l'endoscopie pourrait être couramment utilisé pour l'EGC de détection. Ceci est la raison pour laquelle le diagnostic précoce et la capacité de distinguer les lésions malignes et prémalignes sont importantes [7]. Par conséquent, il est important de rechercher de nouvelles méthodes pour GC prédictions de diagnostic ou de pronostic pour des applications cliniques.
Certaines modifications génétiques peuvent être associées à la cancérisation et la progression de GC [8-11]. Par exemple, les données précédentes, nous avons étudié a suggéré que les gènes de collagène pourrait être un biomarqueur potentiel de distinguer malignes des lésions précancéreuses dans l'estomac [12]. Parce que la progression de la maladie à partir des conditions précancéreuses à GC est un processus dynamique [13-15], la détection des altérations des gènes pourrait permettre l'identification de gènes associés à des maladies plus tôt que les examens pathologiques. En outre, l'expression du gène fournit des informations supplémentaires sur l'état d'un patient [16]. Par conséquent, l'analyse des microréseaux peut être une méthode importante et utile pour le diagnostic et la stratification du risque dans le cancer gastrique.
En outre, en utilisant des mini-réseaux personnalisés pour la pratique clinique peut non seulement être moins cher, mais peut également nécessiter moins d'entrée de l'ARN de l'échantillon pour l'étiquetage et l'hybridation, et le temps de traitement des données pourrait être sensiblement réduite par rapport à microarrays normale [17]. Un microréseau personnalisé de 70 gènes pour le pronostic du cancer du sein, qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA), vérifie la faisabilité de microréseau personnalisé dans l'utilisation clinique [18,19]. Bien qu'il y ait eu plusieurs études sur certains groupes de gènes pour le diagnostic de GC, la technologie des puces à ADN est actuellement pas utilisé comme outil de diagnostic dans le cancer gastrique.
Dans cet article, nous décrivons pour la première fois le développement d'un personnalisé GC diagnostic mini-réseau et de démontrer que la coutume mini-réseau pourrait être utilisé comme un outil de diagnostic et de prévision fiable dans le cancer gastrique.
Résultats
Une coutume mini-réseau d'un groupe de gènes possibles liés à GC cancérisation et de progrès
Dans une étude précédente, nous avons utilisé un microréseau d'oligonucléotide de 38.500 gènes examiner systématiquement l'expression différentielle des gènes parmi les 33 échantillons provenant de la normale, précancéreuses et les lésions malignes dans l'estomac [12]. Une fraction de 696 gènes différenciés-expression trouvée dans l'étude formelle ont été conçus dans la mesure mini-réseau dans le cadre d'une base de recherche. En outre, pour certains groupes dans lesquels ont été trouvés qui ont été peut-être étroitement liée à GC gènes, la mesure mini-réseau comprend également 44 collagène liées à des gènes [20-22], 54 gènes pour sexe récepteurs hormonaux et les voies, les gènes différenciés-expression trouvés dans d'autres études, et les gènes 915 de normalisation (données du tableau S1 détaillé). Dans cette étude, un profil d'expression 1042-gène a été établi comme un diagnostic puissant et prédicteur des résultats de la maladie chez les patients atteints de cancer gastrique.
Comparaison des performances Array 1042-Gene avec celui de 25k d'origine Microarray
Pour déterminer si le test mini-réseau personnalisé effectue semblable à l'original 25 k microarrays [12], deux échantillons ( LYXT et LYXS) à partir d'un même patient utilisés dans la série originale pour développer le classificateur 1042-diagnostic ont été récupérés. Les expressions de 696 gènes générés en utilisant la mini-série de diagnostic étaient très similaires (corrélation de Pearson de 0,957, p < 0,01). Les données publiées d'origine (Figure 1)
Identification de gènes exprimés de manière différentielle dans maligne et tissus gastriques précancéreuses
Toutes les données des hybridations ont été corrigées en arrière-plan, normalisée et analysées afin d'identifier les gènes différenciés-expression dans des 40 échantillons qui représentent des lésions malignes et les lésions précancéreuses (n = 20 dans chaque groupe). Un ensemble de 371 gènes a été trouvé pour séparer les lésions malignes de lésions précancéreuses en utilisant la classification hiérarchique et SVM laisser-one-out confirmation, alors qu'un échantillon précancéreuses (MGFS) ont été classés dans le groupe malin, et cinq échantillons malignes (XSHT, gjft, CXCT , XYT et QLTT) ont été classés dans le groupe précancéreuses. Le MGFS et l'échantillon a été prélevé sur le tissu environnant d'un carcinome chevalière. Le rapport pathologique a révélé que l'échantillon de XSHT était un adénocarcinome modérément différencié, l'échantillon gjft était modérément à l'adénocarcinome bien différencié, tandis que CXCT, XYT et des échantillons QLTT étaient bien adénocarcinome différencié. Ces gènes exprimés de manière différentielle inclus 199 gènes régulés à la hausse et 172 gènes régulés vers le bas dans les lésions malignes par rapport aux lésions précancéreuses (figure 2).
Un non supervisé, hiérarchique algorithme de regroupement nous a permis de regrouper les lésions malignes 20 GC sur la base de leurs similitudes mesurées sur les gènes importants de 371 gènes exprimés de manière différentielle entre les lésions malignes et précancéreuses. Notamment, dans le groupe de gauche, 4 des 10 patients sporadiques étaient à un stade précoce de la CG et les autres présentaient des lésions hautement différenciés, alors que dans le groupe de droite, 2 des 10 patients sporadiques étaient dans le groupe qui a développé des métastases à distance dans les 5 ans ou avec une grande scène et des lésions mal différenciées. Ainsi, en utilisant le clustering sans surveillance, nous pouvons distinguer entre «bon pronostic» et les tumeurs "pauvres pronostic" dans une certaine mesure (Figure 3). En outre, le type et le stade du GC des patients ont été associés à des sous-groupes de pauvres ou de bon pronostic (tableau 1, les données détaillées dans le tableau S2).
Groupe 1 (bon pronostic)
Groupe 2 (mauvais pronostic)
Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (Homme /Femme) 7/38 /2Stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /Type 4Pathological (Modérément à bien différencié adénocarcinome /mal différenciée adénocarcinome /Signet carcinome anneau /mucineux adénocarcinome) 7/2/1/03/4/1 /2Metastasis avec 5 years13Table 1. Le stade des patients atteints de cancer de l'estomac en deux groupes.
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tableau personnalisé avec un nombre minimum de gènes pour le diagnostic de GC et de prédiction
Unsupervised bidimensionnelle analyse typologique des clusters de gènes et GC regroupement a été effectué en utilisant indépendamment un algorithme de classification ascendante hiérarchique avec 371 gènes qui pourrait identifier GC malignes et des lésions précancéreuses. Le coefficient de corrélation de l'expression pour chaque gène avec le résultat de la maladie a été calculé, et 252 gènes ont été trouvés à être associés de façon significative avec le résultat de la maladie (coefficient de corrélation < -0.3 ou > 0,3) (données détaillées dans le tableau S1).
Ces 252 gènes ont été classés par ordre sur la base de l'ampleur du coefficient de corrélation. Le nombre de gènes dans le 'classificateur pronostique' a été optimisé en ajoutant successivement des sous-ensembles de 5 gènes du haut de cette liste de classement ordonné et d'évaluer sa puissance pour la classification correcte en utilisant la méthode «leave-one-out» pour la validation croisée. La classification a été faite sur la base de la corrélation entre les niveaux des échantillons restants d'expression des bons et mauvais patients, respectivement. La précision est améliorée jusqu'à ce que le nombre optimal de gènes marqueurs a été atteinte. Par conséquent, 74 gènes ont été déterminés à être le nombre minimum de gènes qui pourraient être classés comme deux sous-groupes de pronostic différent (Figure 4). Avec une valeur de 0,565 AUC (95% CI 0,305-0,825) indiquant un test parfait, la sensibilité et la spécificité du diagnostic de la courbe ROC ont été calculées à 70% et 80%, respectivement (figure 5).
Basé sur le ontologie génétique (GO) classification des fonctions, l'annotation fonctionnelle pour les gènes impliqués dans le cycle cellulaire, l'invasion et les métastases, l'angiogenèse et la transduction du signal sont sensiblement upregulated dans la signature de mauvais pronostic (annotation des gènes énumérés dans le tableau S1). Ces gènes comprennent plusieurs groupes pour lesquels la fonction d'annotation permet de mieux comprendre le mécanisme biologique sous-jacent conduisant à des fonctions clés impliqués dans la tumorigenèse et la progression. Les gènes impliqués dans le cycle cellulaire, l'invasion et la métastase, l'angiogenèse et la transduction de signal ont été significativement exprimés de manière différentielle entre les deux signatures (par exemple, GKN1, INHBA, et SPP1 THBS4). Pendant ce temps, l'analyse de cluster non supervisé distinction entre les différentes tumeurs pronostiques. En évaluant les 74 gènes rapporteurs pronostiques, plusieurs gènes appartenant à ces catégories fonctionnelles deviennent apparents (par exemple, GKN1, GKN2, GIF, PSCA et LIPF).
Les patients dans les deux groupes classés par les 74 gènes et les sondes entières sont presque les mêmes, sauf pour l'échantillon LCM, qui a été classé dans le groupe de bon pronostic dans l'ensemble des sondes microarray et dans le groupe de mauvais pronostic dans le classement 74-gène. L'échantillon de LCM a été recueilli à partir du tissu malin d'un patient souffrant d'adénocarcinome mucineux au stade IV avec une durée de vie plus courte que les autres patients dans les groupes formels. Par conséquent, le 74-gène classification microréseau pourrait être plus fiable.
Pour les 11 patients inclus dans le GC étude précédente [12], on a calculé le coefficient de corrélation du niveau de l'expression des 74 gènes avec le profil moyen déterminé de ces gènes dans des tumeurs provenant de patients de bon pronostic (CI). Un patient avec un coefficient de corrélation de plus de -0,007 (le seuil a donné lieu à un taux de faux négatifs de 13 pour cent) a été ensuite attribué au groupe avec la signature de bon pronostic et tous les autres patients ont été affectés au groupe des pauvres -prognosis signature (Figure 6). En outre, la courbe de survie des deux groupes varie considérablement (p < 0,05) (figure 7). Ainsi, le classificateur a montré une performance comparable sur la validation des 11 tumeurs sporadiques indépendants et a confirmé le pouvoir prédictif et la robustesse de la classification pronostique du tableau personnalisé de 74 gènes.
Pour valider les données de l'expression des gènes à partir des données de puces à ADN, nous avons choisi un gène différencié expression, INHBA, et examiné son expression avec l'analyse RT-PCR quantitative. Nos données montrent que le gène modifié de manière significative l'expression dans les tissus malins par rapport aux tissus précancéreux dans 11 échantillons de paires appariées, en accord avec les résultats obtenus par l'analyse de puces à ADN (figure 8).
dans la liste des puces à ADN personnalisé 74-gène, nous avons trouvé un groupe de gènes avec la classification GO de la reproduction (tableau 2), dans lequel 5 gènes des récepteurs et des voies d'hormones sexuelles (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 et FOXL2), pourrait non seulement séparer efficacement maligne à partir d'échantillons précancéreuses mais également classer les pauvres et bon pronostic avec la classification hiérarchique et SVM (Figure 9). En outre, deux gènes d'hormones sexuelles avaient expression differentiated- significative de bon pronostic à un mauvais pronostic de GC (ESRRG 8,83, AR 0,37, p < 0,01).
Symbole
Fold changement
Symbole
Fold change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table 2. Gènes avec GO classement de la reproduction dans 74 gènes groupe microarray.
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Discussion
Dans la présente étude, nous rapportons pour la première fois que le microréseau personnalisé pourrait être une méthode efficace pour le diagnostic et la prédiction du pronostic GC cliniquement. Un manque de biomarqueurs cliniques pour le cancer gastrique au début sans symptômes précoces spécifiques conduit à un diagnostic tardif et contribue à la forte mortalité du cancer gastrique [23]. Dans certains cas, des changements se produisent uniquement au niveau du gène, sans changement pathologique. Les changements dans l'expression génique pourraient aider au diagnostic précoce, le pronostic et le guidage d'un traitement post-opératoire pour le rayonnement et la chimiothérapie. Le développement des technologies de microréseaux permet l'étude de la possibilité d'inversion pathologique et l'évaluation et l'orientation de la thérapie. En outre, la création de matériel de microarray ciblé pourrait rendre la technique plus utile. En raison de la faible spécificité et la carence du diagnostic conjoint mature, le microréseau personnalisé n'a pas encore été appliquée dans l'utilisation clinique pour le cancer gastrique, bien qu'il y ait des études dans le diagnostic génétique.
Analyse de biopuces est une technologie largement utilisée pour étudier l'expression des gènes à l'échelle mondiale. Plusieurs analyses moléculaires actuellement employées dans l'évaluation clinique des cancers sont dérivés de base de microréseaux profil d'expression génique. Un exemple d'un dosage à base de microréseaux est MammaPrint, un microréseau personnalisé de 70 gènes associés au risque de développement précoce de métastases à distance chez les jeunes patients avec des ganglions lymphatiques du cancer du sein négatif. MammaPrint a été ratifiée par la FDA. La possibilité d'utiliser ce profil dans un cadre de diagnostic à haut débit pourrait être un grand avantage dans le pronostic et le traitement du cancer du sein [17-19]. Toutefois, la technologie actuellement pas utilisée comme un outil de diagnostic de routine dans le cancer gastrique, et il n'y a eu aucune étude des microréseaux personnalisés utilisés dans le diagnostic ou la prédiction du pronostic. Dans ce rapport, nous démontrons pour la première fois que la coutume mini-réseau peut être utilisé comme un outil de diagnostic fiable dans le cancer gastrique.
Dans cet article, nous décrivons le développement d'un cancer gastrique mini-réseau de diagnostic personnalisé et décrire son utilisation fiable dans un cadre de diagnostic. De nombreuses études cliniques ont mis en corrélation des altérations de l'expression des gènes individuels avec les résultats du cancer gastrique, souvent avec des résultats contradictoires. Des exemples comprennent CXCL1, HOXA10 et méthylation de PCDH10 [24-26]. Cependant, ces gènes ne sont pas inclus dans notre mini-tableau. Il est possible que les autres études ont payé plus d'attention aux fonctions de ces gènes, alors que nous nous sommes concentrés sur les expressions des ARNm. Le tableau personnalisé 74 gène peut être un outil de prédiction possible pour le cancer gastrique. Les données démontrent clairement la reproductibilité et la robustesse de la petite puces à ADN sur mesure. L'utilisation d'un microréseau personnalisé pourrait fournir plusieurs avantages, tels que des informations précises sur le risque de récidive par rapport aux critères cliniques classiques, et d'améliorer ainsi la direction de l'exigence d'un traitement adjuvant.
Pendant ce temps, à cause d'une 2 fois plus forte incidence chez les hommes que chez les femmes avec GC [1], plusieurs enquêtes épidémiologiques plus importantes suggèrent que le sexe était un facteur pronostique indépendant important pour la survie globale chez les patients du GC [27,28 ] et de la prédominance masculine du cancer de l'estomac est en corrélation avec un délai de 10 à 15 ans dans l'apparition du cancer gastrique de type intestinal chez les femmes que chez les hommes [29]. Dans ce profil de 74 gènes personnalisé mini-réseau, 5 gènes ont été exprimés de manière différentielle entre les lésions malignes et les lésions précancéreuses du GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 et FOXL2). Ce groupe de gènes de sexe associé à des rôles possibles dans GC a d'abord été proposé, et il y a peu d'études sur ce groupe de gènes associés à des cancers. Il est important de noter que la dernière étude publiée par Matson et ses collègues ont montré une association possible et voie de DMRT1, FOXL2 et l'hormone de genre [30]. DMRT1, DMRT3 et DMRTA1 sont tous inclus dans un groupe de la famille des gènes qui ont un zinc motif (domaine DM) liaison à l'ADN de doigt, en commun, qui est aussi un régulateur clé du développement des hommes dans les mouches et les nématodes. Par ailleurs, les principaux gènes de cette voie sont inclus dans les données. Les données peuvent nous fournir une direction de recherche de gènes de sexe associé en GC et de révéler une voie possible et le mécanisme de GC cancérisation.
Par conséquent, le tableau pourrait être un excellent outil pour classer et prédire l'issue de la maladie chez les patients atteints de cancer gastrique. Cependant, il y a des limitations dans notre profil. Les échantillons doivent être élargis pour vérifier la validité clinique et la reproductibilité.
Patients et échantillons
Quarante spécimens de cancer gastrique résection chirurgicale et des spécimens non tumorales adjacentes étaient obtenu à partir de Sir Run Run Shaw Hôpital, école de l'Université Zhejiang Medicine et ont été utilisés au cours de Juin 2007 à mai 2011. Nous avons recueilli les tissus malins et précancéreuses de différentes régions de l'estomac réséqué de chaque patient qui a subi une intervention chirurgicale. Quarante échantillons de tissus regroupés de vingt patients atteints de cancer gastrique primaire ayant subi une chirurgie (vingt lésions malignes, vingt lésions précancéreuses) ont été choisis pour l'analyse des microréseaux oligonucléotide (tableau 1, les données détaillées dans le tableau S2). Tous les échantillons prélevés ont été fixés, noyés, colorées avec H & E, et un diagnostic de Lauren et classification OMS indépendamment par trois pathologistes professionnels. Douze échantillons appariés avec des lésions malignes et précancéreuses chez des patients ayant subi une chirurgie ont été choisis pour inverse quantitative transcription-PCR (RT-PCR quantitative). Les résultats de RT-PCR quantitative ont été comparés avec les dossiers pathologiques de l'institution contribuant. analyse pathologique final a été déterminé par consensus et revu si nécessaire. «Maligne» fait référence à divers types de cancers gastriques. «Précancéreuses» indique gastrite atrophique, métaplasie et /ou dysplasie intestinale. Les échantillons ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur. Le consentement éclairé écrit a été obtenu avant la collecte de l'échantillon, et le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche clinique de l'hôpital Sir Run Run Shaw.
Customized Mini-Array
L'original personnalisé 8 * 15k mini-réseau contient 1042 gènes de cancérisation et le pronostic lié identiques aux sondes sur le tableau d'origine [12]. Le mini-réseau inclus 696 gènes exprimés de manière différentielle entre les lésions malignes et les lésions précancéreuses de patients du GC que nous avons trouvé dans les précédents 38, 500 puces à ADN, 44 gènes de collagène liées, 54 gènes pour sexe récepteurs hormonaux et les voies et les gènes différenciés-expression trouvée dans d'autres études qui ont été repérés en triple. Chaque tableau comprend également 1042 sondes d'hybridation et de contrôle de la qualité d'impression, ainsi que 915 gènes de normalisation (données détaillées dans le tableau S1). Huit mini-réseaux identiques sont présents sur un seul 1 "x 3" slide, permettant huit hybridations individuelles à effectuer simultanément (personnalisé à Shanghai BioChip Co. Ltd., Agilent Technologies).
Oligonucleotide microarray
L'ARN total a été extrait et purifié en utilisant le réactif TRIzol (Invitrogen, USA) et RNeasy Mini Kit (Qiagen, Allemagne) par l'intermédiaire des procédures standard recommandées par les fabricants. Les niveaux et les qualités de l'ARNc ont été mesurées par un Agilent Bioanalyseur 2100 (Agilent, États-Unis), et la qualité de l'ARN a été contrôlé par la norme 2100 RIN > = 7.0 et 28S /18S > = 0,7. L'ARNc a été fragmenté avec le Gene Chip Cleanup Sample Module (Affymetrix, USA) et étiqueté avec une couleur unique à l'aide Agilent agrandir méthode de notation. Hybridation, coloration, les procédures de lavage et de balayage ont été réalisées comme décrit dans le Gene Chip Expression Analysis manuel technique (Affymetrix, États-Unis).
Les résultats de la puce étaient balayé par un scanner Agilent. Les données ont été normalisées et conversé après l'acquisition et la quantification image pour identifier les gènes avec des expressions différentielles significatives en utilisant un logiciel d'extraction d'entité. Un open source interprété langage informatique (R) a été utilisé pour le calcul des statistiques et graphiques [12]. Les données brutes de microréseau personnalisé a été téléchargé sur le ArrayExpress comme numéro d'accès A-MEXP-2338.
Nous avons utilisé une méthode basée sur les profils d'expression génique pour classer les cancers gastriques dans catégories pronostiques ou diagnostiques. La méthode comprend les étapes suivantes: (1) la conception d'un mini-tableau personnalisé avec un groupe de gènes possiblement liés à la GC cancérisation et de progrès basée sur des études antérieures, (2) la sélection de gènes différenciés-expression entre les lésions malignes et précancéreuses (pli changement > 2 fois et p < 0,05) (3), sans surveillance à deux dimensions analyse typologique des clusters de gènes et le regroupement de GC réalisée indépendamment en utilisant un algorithme de classification ascendante hiérarchique (4), la sélection de discriminer les gènes candidats à partir de gènes sélectionnés à l'étape 2 selon à leur corrélation avec la catégorie (bon ou mauvais pronostic) (5), la détermination de l'ensemble optimal de gènes rapporteurs en utilisant une procédure de validation croisée leave-one-out (6), la prédiction pronostique ou diagnostique basé sur l'expression du gène de l'optimal ensemble de gènes rapporteurs [18,19], (7) GO annotation de gènes rapporteurs, et (8) l'analyse de corrélation des données de puces à ADN avec le profil pronostique
analyse quantitative RT-PCR
l'ARN total extrait à partir d'échantillons a été transcrit en inverse en ADNc en utilisant le script de choix TM RT kit de réactifs (Takara, Japon) à 37 ° C pendant 15 min et à 85 ° C pendant 15 secondes. Les réactions de PCR en utilisant le kit SYBR premis EX Taq TM ont été réalisées à 95 ° C pendant 30 secondes, suivi de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 10 s et 72 ° C pendant 40 secondes avec le 7500 Real- système PCR temps (Applied Biosystems, USA). Le gène de ménage β-actine a servi de contrôle interne. La séquence d'amorce avant de INHBA est GTGATGGCAAGGTCAACATCT, et une marche arrière est GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.
Nous avons utilisé à risques proportionnels analyse de régression pour ajuster l'association entre le coefficient de corrélation (CI) et les métastases pour d'autres variables. Les p-valeurs associées aux rapports de cotes sont calculées à l'aide du test exact de Fisher.
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