PLoS ONE: Pretvaranje mikročipa potpis u dijagnostičkom testu: Trial of Custom 74 ekspresijom gena za pojašnjenje i prognozu prognozu rak želuca

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Rak želuca (GC) je povezan s visokim stopama smrtnosti i nepovoljnom prognozom u naprednim stadijima. Osim toga, ne postoje učinkovite metode za dijagnosticiranje raka želuca u ranoj fazi ili za predviđanje ishoda u svrhu odabira mogućnosti liječenja bolesnika. Stoga je važno da se ispitati nove metode za GC dijagnozu. pregled

Metodologija /glavne nalaze

Kako bi se olakšala njegova primjena u dijagnostičkom okruženju, skupina od 74 gena s dijagnostičku i prognostičku informacija je preveden na prilagođenoj microarray sadrži smanjenu set 1.042 proba za visoke prerade propusnost. U ovom izvješću ćemo pokazati po prvi put da je običaj mini-polje se može koristiti kao pouzdan dijagnostički alat u raka želuca. Uz AUC vrijednosti 0,565 (95% CI 0,305-0,825) pokazuje savršenu testa, osjetljivost i specifičnost dijagnoze iz ROC krivulje izračunate su se 70% i 80%, respektivno. pregled

Zaključci /Značaj pregled

Podaci jasno pokazuju reproducibilnost i robusnost maloj mjeri microarray. Niz je izvrstan alat za klasifikaciju i predviđanje ishoda bolesti u bolesnika s karcinomom želuca pregled

Izvor:. Yin Y, Zhuo W, Zhao Y, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) Pretvaranje mikročipa potpis u dijagnostičkom testu: Trial of Custom 74 ekspresijom gena za razrješenjem i Predviđanja prognozu rak želuca. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10,1371 /journal.pone.0081561 pregled

Urednik: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, United States of America pregled

Primljeno: 25. lipnja 2013; Prihvaćeno: 14. listopada 2013; Objavljeno: 3. prosinca 2013 pregled

Copyright: © 2013 Yin i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Nacionalni Osnovni istraživački program Kina (973 program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) ima visoku učestalost te je drugi vodeći uzrok smrtnosti od raka [1,2]. Prognoza GC je vrlo ovisna o stadiju bolesti pri dijagnozi i načinu liječenja. [3] Stopa preživljavanja pet godina u pacijenata s uznapredovalim rakom želuca je oko 20%, dok je u ranom stadiju raka želuca je iznad 60% [4-6]. Međutim, nije bilo djelotvornog i metode za detekciju rani stadij raka i za predviđanje moguće prognozu osigurati odgovarajuću terapiju za svakog pacijenta. U Japanu, iako su mogli učinkovitije otkriti i liječiti rano rak želuca (EGC) kroz opsežne screening, samo endoskopija može se obično koristi za EGC detekcije. To je razlog zašto rano dijagnosticiranje i sposobnost za razlikovanje malignih i premalignih lezija su važni [7]. Stoga je važno da se ispitati nove metode za GC dijagnostičke ili prognostičke predviđanja za kliničke primjene. pregled

Neke promjene gena mogu biti povezane s canceration i progresiju GC [8-11]. Na primjer, prethodni podaci koje smo proučavali predložio da kolagen geni mogli biti potencijalni biomarker za razlikovanje zloćudnih od premalignih lezija u stomaku [12]. Budući da je progresija bolesti od premalignih stanja GC je dinamičan proces [13-15], otkrivanje genskih promjena mogla omogućiti identifikaciju gena bolesti povezane ranije nego patoloških pregleda. Osim toga, ekspresija gena daje dodatne informacije o pacijentovom stanju [16]. Stoga microarray analiza može biti važan i koristan način za dijagnozu i stratifikacije rizika raka želuca. Pregled

Osim toga, pomoću prilagođene mini polja za kliničku praksu ne samo da može biti jeftinije, ali može također zahtijevaju manje uzorak ulaz RNA za označavanje i hibridizacije, a vrijeme obrade podataka može biti znatno smanjena u usporedbi s normalnim microarrays [17]. Prilagođena mikropostrojima 70 gena za prognozu raka dojke, koji je odobren od strane Uprave za hranu i lijekove (FDA), provjerava izvedivost običaj microarray u kliničkoj upotrebi [18,19]. Iako je bilo nekoliko studija o pojedinim skupinama gena za GC dijagnoze, mikropostrojima tehnologija je trenutno ne koristi kao dijagnostički alat u raka želuca. Pregled

U ovom radu opisujemo prvi put razvoja prilagoditi dijagnostički GC mini-niz i pokazati da je običaj mini-polje se može koristiti kao pouzdan dijagnostički i predviđanja alat u raka želuca. pregled

Rezultati

Prilagođena mini-niz od skupine mogućih gena se odnose na GC canceration i napretka pregled

U prethodnom istraživanju koristili smo oligonukleotidne mikročipa od 38.500 gena za sustavno ispitivanje diferencijalne ekspresije gena kod 33 uzoraka od normalnog, maligne i malignih lezija u želucu [12]. Frakcija od 696 diferencirati-ekspresije gena nalaze u formalnom istraživanju su dizajnirani u prilagođenom mini-niz, kao dio baze istraživanja. Osim toga, za neke skupine u kojima geni su otkrili da su možda blisko povezana s GC, običaj mini-niz uključivao 44 kolagena vezane gene [20-22], 54 gene za sex hormonskih receptora i plažama, pronađeno diferencirati-ekspresije gena u drugim studijama, te 915 normalizaciju gena (detaljni podaci u tablici S1). U ovom istraživanju, 1042-ekspresije gena profil osnovana je kao snažan dijagnoze i prognoziranje ishoda bolesti u bolesnika s rakom želuca. pregled

Usporedba Array performanse 1042-gena s onom Original 25K Microarray Netlogu

Kako bi se utvrdilo da li se prilagoditi mini-niz ispitivanja obavlja slične izvornim 25 k microarrays [12] dva uzorka ( LYXT i LYXS) iz istih pacijenata koji se koriste u izvornom nizu razvijati 1042-dijagnostičke klasifikator preuzeti su. Izrazi za 696 gena generiranih pomoću dijagnostičkog mini-niz bili su vrlo slični (Pearson korelacija 0.957, p < 0,01). Originalnim objavljenih podataka (Slika 1) pregled

Identifikacija gena različito izražena u maligni i premalignih želučani tkiva

Svi podaci hibridizacije su pozadine-ispravljen, normalizirana, a analizirani identificirati diferencirane-ekspresije gena u 40 uzoraka koji predstavljaju malignih lezija i prekanceroze (n = 20 u svakoj skupini). Skup 371 gena je utvrđeno da je odvajanje malignih lezija iz premalignih lezija pomoću hijerarhijskog klastera i SVM i ostavi jedan-out potvrdu, dok predmaligna uzorak (MGFS) su svrstane u malignim skupine, a pet malignih uzoraka (XSHT, GJFT, CXCT , XYT i QLTT) su svrstane u premalignog grupi. MGFS i uzorak se uzima iz okolnog tkiva karcinoma pečat prstena. Patološka izvješće otkriva da je uzorak XSHT bio umjereno diferenciran adenokarcinom, uzorak GJFT bio Umjereno dobro diferencirani adenokarcinom, dok CXCT, XYT a uzorci QLTT bili su dobro diferencirani adenokarcinom. Ove različito izražene gene uključene 199 up-reguliranih gena i 172 dolje regulira gene u malignim lezijama u usporedbi s premalignih lezija (slika 2). Pregled

Razlikovanje prognozu želučanog karcinoma Netlogu

bez nadzora, hijerarhijski klastera algoritam nam je omogućilo da klastera 20 GC maligne lezije su na temelju njihove sličnosti izmjerenih tijekom značajnih genima 371 različito izraženim genima između malignih i premalignih lezija. Naime, u lijevom skupini, 4 od 10 pojedinačnih pacijenata bili su u ranoj fazi GC i ostali predstavljeni s vrlo raznovrsnih ozljeda, dok je u pravoj grupi, 2 od 10 sporadičnih bolesnika bilo je u skupini koja je razvila udaljene metastaze u roku od 5 godina ili s visokom stupnju i slabo diferenciranih lezija. Dakle, na temelju nadzirane klastera, možemo razlikovati 'dobru prognozu "i" lošu prognozu' tumora do neke mjere (Slika 3). Osim toga, tip i stadij GC pacijenata bili su povezani s podskupine lošem ili dobrom prognozom (tablica 1, detaljni podaci u tablici S2).
Grupa 1 (Dobra prognoza) pregled Grupa 2 (loša prognoza) pregled Age62.8 ± 7.1161.3 ± 7.02Gender (muško /žensko) 7/38 /2Stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /4Pathological tip (umjereno dobro diferenciranog adenokarcinoma /slabo diferenciranog adenokarcinoma /karcinom pečatni stanica prstena /mucinozni adenokarcinom) 7/2 /1 /4/3 /1 /2Metastasis sa 5 years13Table 1. faza pacijenata oboljelih od raka želuca u dvije grupe.
CSV Preuzmite CSV

Custom polje s minimalnim brojem gena za GC dijagnozu i prognozu pregled

nekontrolirano dvodimenzionalni klaster analiza gena klastera i GC klastera je izvedena samostalno pomoću aglomerativnim hijerarhijski clustering algoritam s 371 gena koji bi mogao prepoznati maligne GC i premalignih lezija. Izračunat je koeficijent korelacije od izraza za svaki gen s ishodu bolesti, a pronađena su 252 gena koji se značajno povezana s ishodom bolesti (koeficijent korelacije < -0,3 ili > 0,3) (detaljni podaci u tablici S1). pregled

Ove 252 geni su rang-naručio na temelju veličine koeficijenta korelacije. Broj gena u 'prognostičkim klasifikatora' je optimiziran sekvencijalnim dodavanjem podskupove 5 gena s vrha tog ranga naredio popis i procjenu svoje snage za ispravnu klasifikaciju primjenom metode 'ostavi-jedan-out' za cross-validacije. Klasifikacija se temelji na odnosu na razine ekspresije preostalih uzoraka iz dobrih i loših pacijenata, respektivno. Točnost poboljšana, dok se ne postigne optimalan broj marker gena. Dakle, 74 geni su određena da bude minimalan broj gena koji bi mogli biti klasificirani kao dva podgrupama različite prognoze (Slika 4). S AUC vrijednost 0,565 (95% CI 0.305-0.825) ukazuje savršen test, osjetljivost i specifičnost dijagnoze iz ROC krivulje izračunate su se 70% i 80%, pojedinačno (Slika 5). Pregled

na temelju Gene ontologije (GO) funkcija klasifikaciji, funkcionalna primjedba za gena koji sudjeluju u staničnom ciklusu, invaziju i metastaziranje, angiogeneze, i prijenos signala značajno izraženi su u lošu prognozu potpis (označavanje gena navedenih u tablici S1). Ovi geni su nekoliko grupa za koje funkcija primjedba pruža uvid u temeljne biološke mehanizam koji vodi do ključnih funkcija koje sudjeluju u nastanku tumora i napredovanje. Geni uključeni u stanični ciklus, invaziju i metastaziranje, angiogeneze, te prijenosa signala su značajno različito izraženi između dva potpisa (npr GKN1, INHBA, SPP1 i THBS4). U međuvremenu, bez nadzora klaster analiza razlikuje između različitih prognostičkih tumora. Ocjenjujući sve 74 prognostičkih reporter gena, više gena koji pripadaju ovim funkcionalnim kategorijama postati jasno (npr GKN1, GKN2, GIF, PSCA i LIPF). Pregled

Pacijenti u dvije grupe razvrstanih po 74 gena i cijela probe su gotovo isti, osim za uzorak LCM, koja je klasificirana u dobru prognozu skupine u cijelom sonde microarray i na lošu prognozu skupine u klasifikaciji na 74-gena. Uzorak LCM je sakupljen od malignih tkiva pacijenata koji pate od mucinozni adenokarcinom u stadiju IV sa kraći životni vijek od ostalih pacijenata u formalni skupinama. Dakle, 74-gen klasifikacija mikropostrojima može biti pouzdaniji. Pregled

Provjera 74 gena custom polja i korelacije podataka microarray s prognostičkim profila Netlogu

Za GC pacijenata 11 uključen u prethodna studija [12], izračunali smo koeficijent korelacije razine ekspresije 74 gena utvrđenom prosječnom profilu tih gena u tumorima iz pacijenata s dobru prognozu (CI). Pacijent s koeficijentom korelacije od više od -0.007 (praga rezultiralo stopi od 13 posto lažno negativnih rezultata) zatim je dodijeljen skupini s dobre prognoze potpisa, a svi ostali pacijenti su dodijeljeni skupini sa siromašnima -prognosis potpis (Slika 6). Osim toga, krivulja preživljavanja dvaju skupina značajno se razlikuje (p < 0.05) (Slika 7). Dakle, klasifikator je pokazao usporedive performanse o potvrđivanju 11 nezavisnih sporadičnih tumora i potvrdio prediktivnu moć i robusnost klasifikaciji prognozi 74-gena prilagođenom polju. Pregled

obnovljivosti prilagođene mini-array Netlogu

Kako provjeriti podatke o gena izraza iz podataka microarray, odabrali smo diferencirane-gena, INHBA, i pregledao svoj izraz s kvantitativnim RT-PCR analize. Naši podaci su pokazali da je gen značajno promijenila izraz u malignim tkivima u odnosu na premalignih tkiva u 11 par podudaranja uzoraka, u skladu s rezultatima dobivenim iz analize microarray (slika 8).

sub grupu reprodukcije povezana gena s rakom želuca Netlogu

u 74-gena popisu običaj microarray, pronašli smo skupinu gena s klasifikaciji GO reprodukcije (tablica 2), u kojem 5 geni za sex hormonskih receptora i putevi (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 i FOXL2), zar ne samo učinkovito odvojeno maligni od premalignih uzoraka, ali i klasificirati slabu i dobru prognozu s hijerarhijskom klastera i SVM (Slika 9). Osim toga, dva spolni hormon geni imali značajnu differentiated- izraz dobru prognozu za loše prognoze GC (ESRRG 8.83, AR 0.37, p < 0,01).
Simbol pregled Fold promjenu pregled Simbol pregled Fold change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table 2. Geni s GO klasifikaciji reprodukciju u 74 gena microarray.
CSV Preuzmite CSV

Rasprava pregled

U ovom istraživanju smo prijavili prvi put da je običaj mikropostrojima može biti učinkovita metoda za dijagnozu i prognozu prognozu u GC klinički. Nedostatak kliničkih biomarkera za rano raka želuca, bez ikakvih posebnih ranih simptoma dovodi do usporenog dijagnoze i doprinosi visokoj smrtnosti od raka želuca [23]. U nekim slučajevima dolazi do promjena samo na razini gena, bez patološkim promjenama. Promjene u ekspresiji gena može pomoći u ranoj dijagnozi, prognozi i smjernice liječenja za postoperativni zračenja i kemoterapije. Razvoj microarray tehnologija omogućuje istraživanje mogućnosti patološkog preokret i ocjenjivanje i vođenje terapije. Osim toga, stvaranje ciljanih microarray oprema mogla bi se tehnika korisnijim. Zbog loše specifičnosti i nedostatak zrele zajedničkog dijagnoze, običaj mikropostrojima nije se primjenjivalo u kliničkoj upotrebi za rak želuca još, iako postoje studije u dijagnostici gena. pregled

Analiza Microarray je naširoko koristi tehnologiju za proučavanje ekspresije gena na globalnoj razini. Nekoliko molekularni testovi trenutno zaposleni u kliničkoj procjeni raka su izvedeni iz microarray-based profila genske ekspresije. Jedan primjer testa mikročipa bazi je MammaPrint, prilagođeni mikropostrojima 70 gena povezanih s rizikom za rani razvoj udaljenim metastazama u mladih bolesnika s limfnih čvorova rak dojke negativan. MammaPrint je ratificiran od strane FDA. Sposobnost da koristite ovaj profil u visokom propusnosti dijagnostičkog postavka mogla biti velika prednost u prognozu i liječenje raka dojke [17-19]. Međutim, tehnologija je trenutno ne koriste kao rutinski dijagnostički alat u raka želuca, a nije bilo studija prilagođenih proizvedenog niza koji se koriste u dijagnosticiranju i predviđanja prognoze. U ovom izvješću ćemo pokazati po prvi put da je običaj mini-polje se može koristiti kao pouzdan dijagnostički alat u raka želuca. pregled

U ovom radu opisuju razvoj prilagođeni dijagnostičko raka želuca mini-niz i opisati njegovu pouzdanu primjenu u dijagnostičke okruženju. Mnoga klinička ispitivanja su u korelaciji promjene u ekspresiji gena pojedinih želuca rezultat raka, često s kontradiktornih rezultata. Primjeri uključuju CXCL1, HOXA10 i metilacije PCDH10 [24-26]. Međutim, ti geni nisu bili uključeni u našem mini polja. Moguće je da su druge studije platili više pozornosti na funkcije tih gena, dok smo fokusirani na izrazima mRNA. 74-gen custom polja može biti moguće prediktivni alat za rak želuca. Podaci jasno pokazuju reproducibilnost i robusnost maloj mjeri microarray. Uporaba prilagođenog microarray mogao pružiti nekoliko prednosti, kao što su točne informacije o riziku recidiva u usporedbi s konvencionalnim kliničkih kriterija, a time će se poboljšati smjernice za zahtjev za dodatne terapije. pregled

U međuvremenu, zbog 2 puta veću učestalost u muškaraca nego u žena s GC [1], nekoliko većih epidemiološka istraživanja ukazuju na to da spol je značajno neovisna prognostički čimbenik za ukupno preživljavanje u GC pacijenata [27,28 ] i muški prevlast karcinoma želuca u korelaciji s kašnjenjem od 10 do 15 godine u početku crijevna tipa karcinoma želuca u žena u usporedbi s muškarcima [29]. U ovom profilu 74 gena prilagođenom mini-polje, 5 geni su različito izražena između malignih lezija i premalignih lezija GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 i FOXL2). Ova skupina gena seksom povezan s mogućim ulogama u GC je prvi put predložio, a postoji nekoliko studija o ovoj skupini gena povezanih s karcinomima. Važno je napomenuti da je najnovija studija izvijestila Matson i kolege pokazali su moguću povezanost i stazu DMRT1, FOXL2 i spolne hormone [30]. DMRT1, DMRT3 i DMRTA1 svi su uključeni u klasteru obitelji gena koji imaju cink prst-kao DNA-vezujući motiv (DM domene) u zajednički, što je također ključni regulator muškog razvoja muha i glista. Nadalje, glavni geni u ovom putu su svi uključeni u naše podatke. Podaci mogu nam pružiti smjeru istraživanja za seksom povezan gena u GC i otkriti mogući put i mehanizam GC canceration. pregled

Dakle, matrica može biti odličan alat za klasifikaciju i predviđanje ishoda bolesti u bolesnika s rakom želuca. Ipak, postoje neka ograničenja u našem profilu. Uzorci trebaju biti proširen kako bi provjerili kliničku valjanost i ponovljivost. Pregled

Materijali i metode

Pacijenti i uzorci

Četrdeset kirurški resected želučani primjerci raka i susjedne ne-tumorske primjerci bili dobiven od Sir Run Run Shaw bolnice, Medicinskog fakulteta Sveučilišta Zhejiang te su korišteni tijekom lipnja 2007. do svibnja 2011. godine prikupili smo malignih i premalignih tkiva iz različitih regija resected želucu od svakog pacijenta koji su bili podvrgnuti operaciji. Četrdeset grupirani uzorci tkiva iz dvadesetak bolesnika s primarnim rakom želuca koji su bili podvrgnuti operaciji (dvadeset malignih lezija, dvadeset prekanceroze) su izabrani za oligonukleotid microarray analize (tablica 1, detaljni podaci u tablici S2). Sve prikupljenih uzoraka su fiksirani, ugrađen, obojeni H &E, a Lauren je dijagnosticiran i WHO klasifikaciji samostalno tri profesionalna patologa. Dvanaest paru uzorci s malignim i premalignih lezija od pacijenata koji su se podvrgnuli operaciji su izabrani za kvantitativno reverzne transkripcije-PCR (kvantitativni RT-PCR). Rezultati iz kvantitativnog RT-PCR uspoređeni su s patološkim evidencije iz koji doprinosi ustanove. Završni patološka analiza je određen konsenzusom i pregledao, ako je to potrebno. "Maligne" se odnosi na razne vrste karcinoma želuca. "Premalignih" pokazuje atrofičnog gastritisa, intestinalne metaplazije i /ili displaziju. Uzorci su odmah zamrznute u tekućem dušiku i pohranjeno na -80 ° C do daljnje obrade. Pismeni informirani pristanak dobiven prije uzimanja uzorka, a Protokol istraživanja je odobren od strane kliničkih istraživanja etičkog povjerenstva Sir Run Run Shaw bolnici. Pregled

Prilagođeno Mini-Array pregled

izvornom prilagođeno 8 * 15k mini-niz sadržavao 1042 canceration i prognozi vezane gene identične sondi na izvornog polja [12]. Mini-array uključeno 696 različito izražene gene između malignih lezija i premalignih lezija GC bolesnika koji smo našli u prethodnoj 38, 500 gena čips, 44 kolagena vezane gene, 54 gene za sex hormonskih receptora i plažama, te diferencirane-ekspresije gena u kategoriji druge studije koje su uočene u trostruko. Svaki niz obuhvaća 1042 sonde za hibridizaciju i kontrole kvalitete tiska, kao i 915 normalizacije gena (detaljni podaci u tablici S1). Osam identične mini polja su prisutni na jednom 1 "x 3" tobogan, čime za osam pojedinačnih Hibridizacija se izvode istovremeno (prilagoditi u Šangaju biočip Co. Ltd., Agilent Technologies). pregled

Oligonucleotide mikropločicama pregled

Ukupna RNA se ekstrahira i očisti pomoću Trizol reagensa (Invitrogen, USA), te RNeasy Mini Kit (Qiagen, Njemačka) standardnim postupcima koje je preporučio proizvođač. Razine i kvalitete Crne mjerene su Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA), a kvaliteta RNA je pod kontrolom standardnom 2100 rin > = 7.0 i 28S /18S > = 0.7. Crna rascijepkana s genski čip uzorka Čišćenje modula (Affymetrix, SAD) i označen sa jednim boju pomoću Agilent uvećanje metodu bilježenja. Hibridizacije bojenje, pranje i skeniranje postupci provedeni su kako je opisano u genski čip Expression Analysis tehničku priručniku (Affymetrix, USA). Pregled

Analiza oligonukleotida microarray podataka Netlogu

Rezultati microarray bili skeniraju Agilent skener. Podaci su normalizirani i razgovarao nakon stjecanja slike i kvantifikaciju identificirati gene sa značajnim diferencijalne izrazi koriste za ekstrakciju značajki softvera. Open source tumačiti programski jezik (R) je korištena za statističke računanje i grafički [12]. Sirovi podaci o prilagođenom microarray je prenesena na ArrayExpress kao pristupni broj A-MEXP-2338. Pregled

Dizajn studije pregled

Mi smo koristili metodu na temelju profila genske ekspresije klasificirati želučanog karcinoma u prognostički ili dijagnostički kategorije. Metoda uključuje sljedeće korake: (1) dizajn prilagođeni mini-niz sa skupinom gena vjerojatno se odnose na GC canceration i napredak na temelju prethodnih studija, (2) Izbor diferencirati-ekspresije gena između malignih i premalignih lezija (fold promjena > 2 puta i p < 0,05) (3), bez nadzora dvodimenzionalni klaster analiza gena klastera i GC klastera obavlja samostalno pomoću aglomerativnim hijerarhijski clustering algoritam (4), izbor diskriminirati gena kandidata iz gena u koraku 2, u skladu njihovoj povezanosti s kategoriju (dobro ili loše prognoze) (5), određivanje optimalnog skupa reporter gena pomoću cross postupak provjere valjanosti i ostavi jedan izlaz (6), prognostički ili dijagnostički predviđanje na temelju ekspresije gena optimalna skup reporter gena [18.19] (7) IDE zabilježeni reporter gena, i (8) analiza korelacije podataka microarray s prognostičkim profila Netlogu

Kvantitativna RT-PCR analiza pregled

ukupna RNA ekstrahirana iz uzoraka obrnuto prepisana u cDNA pomoću prime skripte TM RT reagens pribora (Takara, Japan) na 37 ° C 15 min, a na 85 ° C tijekom 15 sekundi. PCR reakcije upotrebljavaju SYBR® PREMIS EX Taq TM kit su provedena na 95 ° C tijekom 30 sekundi, nakon čega slijedi 40 ciklusa na 95 ° C tijekom 15 sekundi, 60 ° C tijekom 10 sekundi i 72 ° C tijekom 40 sekundi s 7500 stvarnog vrijeme PCR System (Applied Biosystems, USA). Domaćinstva gena β-aktin služio kao interna kontrola. Forward primer slijed INHBA je GTGATGGCAAGGTCAACATCT, i obrnuto jedan je GCGGTAGTGGTTGATGACTGT. Pregled

Statistička analiza pregled

Mi smo koristili proporcionalnog opasnostima regresijske analize za podešavanje povezanost između koeficijenta korelacije (CI) i metastaza za ostale varijable. P-vrijednosti povezane s omjerima izgledi su izračunate primjenom Fisherov egzaktni test. Pregled

popratne podatke
tablici S1.
informacije gena u koracima od metoda za projektiranje mini-niz i konačnih 74 mini-array gene. pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s001 pregled (XLS) pregled Tablica S2.
pojedinosti o podacima lezija za microarray. pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0081561.s002 pregled (DOC) pregled

• PLoS ONE: Mutacija na intronske ponavljanja ataksija-o izrazito Mutirana (ATM) gena i ATM gubitak proteina u primarnim rakom želuca s mikrosatelitni Instability
• PLoS ONE: RhoE promovira metastaza u rak želuca kroz mehanizam ovisan o pojačani izražaj CXCR4