PLOS ONE: Ciblage CDH17 Supprime la progression tumorale dans le cancer gastrique par régulation négative de Wnt /β-caténine Signaling

Résumé

Objet

Le cancer gastrique reste l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde entier. Les patients présentent habituellement en retard avec l'invasion locale ou de métastases, pour lesquels il n'y a pas de traitements efficaces disponibles. Après des études précédentes qui ont identifié la molécule d'adhésion cadhérine-17 (CDH17) comme un marqueur potentiel de cancer de l'estomac, nous avons effectué des études de preuve de principe pour développer des approches thérapeutiques rationnels ciblant CDH17 pour le traitement de cette maladie.

Méthodes

immunohistochimie a été utilisée pour étudier l'expression de CDH17 dans 156 carcinomes gastriques, et la relation entre la survie et l'expression CDH17 a été étudiée par des analyses multivariées. L'effet de l'interférence de l'ARN à médiation knockdown de CDH17 sur la prolifération de lignées cellulaires de carcinome gastrique a été étudiée in vitro et in vivo, ainsi que les effets sur la signalisation en aval par immunotransfert.

Résultats

CDH17 était constamment régulée à la hausse dans les cancers gastriques humaines, et la survie globale chez les patients atteints CDH17 surexpression était plus pauvre que chez ceux sans expression de ce gène (taux de survie à 5 ans ensemble 29,0% vs 45,0%, P < 0,01). essais fonctionnels ont démontré que CDH17 knockdown a inhibé la prolifération cellulaire, l'adhérence, la migration, l'invasion, clonogénicité et induisent G0 /G1 arrestation. Chez les souris, shRNA médiation knockdown CDH17 inhibe fortement la croissance tumorale; injection intratumorale de CDH17 shRNA entraîne des effets antitumoraux significatifs sur les modèles de tumeurs transplantées. Les mécanismes sous-jacents antitumoraux inhibition CDH17 impliquent l'inactivation de signalisation Wnt /β-caténine.

Conclusion

Nos résultats identifient CDH17 comme biomarqueur du cancer de l'estomac et cible thérapeutique attrayante pour cette tumeur maligne agressive.

Citation: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Ciblage CDH17 Empêche Tumor Progression dans le cancer gastrique par régulation négative de Wnt /β-caténine Signaling. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10.1371 /journal.pone.0056959

Editeur: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, États-Unis d'Amérique

Reçu le 22 Octobre 2012; Accepté 16 Janvier 2013; Publié 15 Mars, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Qiu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles (30672408 à RHX). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la quatrième cause la plus fréquente de décès par cancer dans le monde. Bien que l'incidence du cancer gastrique a considérablement diminué dans certains pays développés au cours de la dernière décennie, un total d'un million de nouveaux cas sont estimés être diagnostiqués chaque année [1]. Les patients atteints de cette maladie ont généralement un mauvais perspectives, représentant 10% du total des décès par cancer [2]. Même après une chirurgie radicale, plus de la moitié des patients se reproduise. l'implication des ganglions lymphatiques, la profondeur de l'invasion tumorale et la localisation de la tumeur ont été identifiés comme des facteurs pronostiques clinico les plus importants [3], [4].

invasion locale et métastases à distance se produisent couramment dans le carcinome gastrique avancé. Le processus d'invasion et de métastases est complexe et nécessite la dysrégulation d'une variété d'éléments cellulaires, y compris des molécules d'adhésion critiques. Cadhérine appartient à l'une des familles de molécules d'adhésion et joue un rôle crucial dans l'établissement interaction cellule-cellule [5]. Cadhérine-17 (CDH17), qui est également appelé foie intestin (LI) cadhérine ou d'un peptide humain transporteur-1 (HPT-1) est un élément de structure unique de la superfamille des cadhérines [6], [7]. Alors que les cadhérines classiques dits, tels que E, N et P-cadhérine, ont cinq répétitions de cadhérine au sein du domaine extracellulaire, CDH17 se compose de sept répétitions de cadhérine. En outre, CDH17 a seulement 20 acides aminés dans le domaine cytoplasmique, alors que les cadhérines classiques ont un domaine cytoplasmique hautement conservée comprenant des acides aminés 150-160. CDH17 est exprimée chez les souris et les humains presque exclusivement dans les cellules épithéliales de l'intestin grêle à la fois et du côlon embryonnaires et adultes, sans expression détectable dans l'estomac et le foie [8].

En utilisant des approches génomiques et protéomiques intégratives, les chercheurs ont commencé à identifier oncogènes nouvelles et suppresseurs de tumeurs dans le cancer gastrique. Des études antérieures de cohortes cliniques identifiées CDH17 comme un marqueur de maladie potentiel de cancer gastrique [9], [10]. En dépit de ces résultats cliniques significatifs, les fonctions moléculaires de CDH17 restent inconnues, et son rôle tumorigène dans le carcinome gastrique n'a pas encore été confirmée. Ici, nous avons cherché à disséquer les mécanismes de signalisation oncogéniques de CDH17 dans le contexte de carcinome gastrique et évalué les effets du ciblage CDH17 comme une approche thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.

Les de

Méthodes Patients

La population étudiée était composée de 156 patients consécutifs (106 hommes et 50 femmes) programmés pour une chirurgie à partir du 1er Janvier 2002 au 31 Décembre 2006 à Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, en Chine. Tous les patients inclus dans cette étude avaient un histologiquement confirmé le diagnostic de carcinome gastrique primaire qui a été analysé plus pathologiquement après la chirurgie. La chirurgie est composée de sous-total ou gastrectomie totale chez tous les patients; une technique normalisée a été utilisée pour la résection chirurgicale et curage, comme décrit ailleurs [3]. Les patients ayant subi une chirurgie non-exérèse, et ceux avec le type Siewert I Cardia adénocarcinome ont été exclus de l'étude. Spécimen et tumoraux tailles ont été enregistrées par les pathologistes. zones représentatives de la tumeur ont été sélectionnés et snap-congelés. classement pTNM a suivi les critères de la 6e édition de l'UICC [11] .Le âge médian des patients était de 57,2 ans (extrêmes: 27-78 ans) l'âge, le sexe, le type de chirurgie, l'emplacement de la tumeur, le stade TNM, la chimiothérapie, l'échantillon Enfin, la taille de la tumeur, et la différenciation histologique, ont été enregistrées pour chaque patient dans une base de données. Tous les patients qui ont subi tout type de chimiothérapie étaient sur le 5-FU, le platine ou les régimes à base de taxol. Tous les patients, après la sortie de l'hôpital, sont entrés dans un programme de suivi selon le protocole standard [12]. Le suivi a été fermé en Avril 2010. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de Sun Yat-sen University Cancer Center, tous les participants ont donné leur consentement éclairé à participer à cette étude.

lignées cellulaires et CDH17 anticorps

lignées de cellules de carcinome gastrique, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 et SGC-7901 ont été obtenus à partir de la American type Culture Collection (Manassas, VA), cancer japonais Ressources de recherche Bank (Tokyo, Japon) et de l'Université de médecine de Beijing (Beijing, Chine). Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Sigma) additionné de 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen) et 1% de pénicilline-streptomycine (Invitrogen). Un anticorps monoclonal de souris CDH17 (ab54511) était de Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 ARN en épingle à cheveux (shRNA)

Le puro pLKO.1 (7 kb) construction lentiviral contient un promoteur U6 et HIV-1 signal d'encapsidation de l'ARN avec des éléments pruomycin- et résistance à l'ampicilline clonée en 3 'du promoteur de la phosphoglycérate kinase humaine (hPGK). Un cpptCTE a été insérée en 5 'du promoteur hPGK. Human constructions CDH17 shRNA ont été générés en ligaturant les oligomères recuits suivants dans les sites uniques Agel et EcoRI de pLKO.1 puro: CDH17 shRNA avant (5'GCC GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G-3 ') et arrière (5'-AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G-3'). Préparations lentiviraux ont été produits par cotransfection pLKO.1 puro avec un vecteur vide CDH17 shRNA et virus auxiliaire plasmides d'emballage et pCMVΔR8.9 pMG.G (dans un rapport 10:10:01) dans des cellules 293T. La transfection a été réalisée en utilisant de la lipofectamine et le réactif PLUS (Invitrogen). Les lentivirus ont été récoltées à 24, 36, 48 et 60 heures après la transfection. Deux contrôles ont été mis en place, dans lequel les cellules de cancer gastrique soit reçu aucun traitement, ou ont été transfectées avec brouillés vecteur non ciblées ARNi (Mock). L'infection a été réalisée en présence de 8 pg /ml de polybrène. Après l'infection, AGS et MKN-45 cellules ont été sélectionnées pour l'expression stable des shRNA utilisant 2 pg /mL de puromycine. Les cellules ont été lysées pour une analyse Western blot 10 jours après l'infection.

immunotransfert et fractionnement subcellulaire

lysats de protéines ont été préparés à partir de monocouches de lignées cellulaires en utilisant un tampon de lyse (1% de NP-40,50 mM de Tris -HCl, pH 8,0, fluorure de sodium 100 mM, du pyrophosphate de sodium 30 mM, du molybdate de sodium à 2 mM, EDTA 5 mM, orthovanadate de sodium 2 mM) contenant des inhibiteurs de protéase (10 mg /ml d'aprotinine, 10 mg /ml de leupeptine, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM ). Les concentrations en protéines ont été déterminées en utilisant la protéine test Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Les lysats cellulaires ont été soumis à dodécylsulfate de sodium par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfacte (SDS-PAGE), et les protéines séparées ont été transférées électrophorétiquement à membranes Immobilon-P (Millipore). Après le blocage par le lait non gras, les membranes ont été incubées de façon indépendante dans P53 anticorps primaire (Signaling CellΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), la cycline D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling΢9), β-caténine (Zymed, 13-8400), GSK3ß (Santa Cruz, sz-7291) et p-GSK3ß (Ser9) (Cell SignalingΥ6). La membrane a été lavée plusieurs fois dans du PBS avec 0,1% de Tween 20 et numérisé dans l'infrarouge bicolore système de détection de l'imageur LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences) selon les instructions du fabricant.

fractionnements subcellulaires ont été effectuées en utilisant tampons de lyse cellulaire spécifiques et les étapes de centrifugation répétées (kit d'extrait nucléaire de Motive active, Carlsbad, CA) selon les spécifications du fabricant. Les fractions cellulaires ont été dissous dans du tampon RIPA et la concentration en protéine a été mesurée en utilisant une protéine BCA de quantification. Les extraits de protéine (20 ug) ont ensuite été dissous dans 1 x tampon de Laemmli, soumis à une électrophorèse sur SDS-PAGE à 10% et transférés sur des membranes de nitrocellulose, comme décrit ci-dessus. Analyse par Western blot polymérase poly-ADP-ribose (PARP, de Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) et superoxyde dismutase 2 (SOD2, de ABFrontier, Séoul, Corée) ont été effectués pour confirmer la séparation appropriée des protéines nucléaires et cytosoliques.

quantitative après transcription inverse-PCR (PCR-QPT)

ARN total a été extrait à partir de lignées cellulaires et de tissus congelés d'adénocarcinome gastrique par le réactif Trizol (Invitrogen). la transcription inverse de l'ARN total (2 Ag) a été réalisée en utilisant un kit Advantage RT PCR (Clontech) et l'ADNc a été soumis à une PCR pour 28 cycles d'amplification avec les amorces suivantes: Fw CDH17, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC et CHD17 Rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-actine a été utilisé comme témoin.

immunohistochimie (IHC)

Un total de 156 formaline fixes et des échantillons de tissus cancéreux gastrique paraffine ont été sélectionnés pour l'étude IHC. La coloration IHC a été réalisée sur des coupes de tissus 5 um réhydratées par des alcools gradués. une activité de peroxydase endogène a été bloquée avec 0,3% de peroxyde d'hydrogène pendant 15 min. Les lames ont été traitées à micro-ondes dans le tampon citrate 10 mM (pH 6,0) pendant 10 min. La liaison non spécifique a été bloquée avec 10% de sérum normal de lapin pendant 20 minutes. Les lames de tissus ont été mises en incubation avec des anticorps anti-CDH17 (dilution 1:50) pendant 60 min à 37 ° C dans une chambre humide. Les lames ont été mises en incubation avec une immunoglobuline de lapin biotinylé anti-souris à une concentration de 1:100 pendant 30 min à 37 ° C, puis on fait réagir avec un conjugué streptavidine-peroxydase de 30 min à 37 ° C et enfin mis en incubation avec de la diaminobenzidine 3-3 'comme un substrat chromogène. Pour exclure un signal faux positif, les contrôles négatifs ont été inclus dans chaque test en remplaçant l'anticorps primaire avec un sérum de blocage. Deux observateurs indépendants ne connaissant pas les informations clinicopathologique ont marqué les diapositives. La définition de la coloration est la suivante: négative, 0% à moins de 5% des cellules tumorales présentant une immunoréactivité; faible, de 5 à 40% des cellules tumorales présentant une immunoréactivité; positif, plus de 40% des cellules tumorales présentant une immunoréactivité. Les cas positifs ont été futher sous-classés en CDH17 + (immunoréactivité: 40-60%), CDH17 2+ (immunoréactivité: 60-80%) et CDH17 3+ (immunoréactivité: 80-100%).

Dans essais in vitro pour évaluer le phénotype tumoral

les procédures expérimentales pour la croissance cellulaire, la formation de foyers, l'agar mou, la migration cellulaire, la cicatrisation des plaies et des analyses du cycle cellulaire sont décrits dans le soutien Méthodes S1.

expériences de sauvetage

le sauvetage de CDH17 dans shCDH17 AGS et MKN-45 lignées de cellules sont décrites dans le soutien Méthodes S1.

In vivo des modèles murins de cancer gastrique

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l'éthique de l'expérimentation animale de Sun Yat-sen University Cancer Center (Numéro de permis: 09-0238). Toute chirurgie a été réalisée sous anesthésie pentobarbital de sodium, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Après l'anesthésie, la souris nude ont été sacrifiées par dislocation cervicale.

formation de tumeurs chez la souris nude.

In vivo tumorigénèse a été étudiée par des expériences de xénogreffe de tumeur. Environ 2 × 10 ^{6 cellules AGS infectées par CDH17 shRNA, le contrôle des cellules AGS infectées avec le vecteur mock ARNi et les cellules AGS parentales ont été injectées s.c. dans le droit et les jambes arrière gauche de 4 semaines d'âge des souris nues (30 souris, 10 par condition). La formation des tumeurs chez des souris nues a été contrôlée sur une période de 8 semaines. Le volume tumoral a été calculé selon la formule suivante V = 0,5 × L × L 2. [13]}

modèle de souris portant une tumeur.

tumeurs sous-cutanées ont été induites chez des souris nues en utilisant des cellules AGS comme mentionné ci-dessus. Une semaine après l'inoculation, les souris ont été traitées avec un anti-CDH17 shRNA. Chaque souris a reçu 100 ul de injectionscontaining intratumorale 1 × 10 ^{9 copies de CDH17 ou lentivirus maquette, deux fois par semaine pendant 2 semaines. Cinq souris ont été utilisées dans chaque groupe. La croissance tumorale a été contrôlée quotidiennement.}

Les analyses statistiques de statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS 13.0. Les différences entre les variables ont été évaluées par χ2 analyse ou tests t de 2 à queue étudiants. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type, sauf indication contraire. La survie globale (OS) et la survie sans maladie (DFS) courbes ont été calculées par la méthode de Kaplan-Meier et les différences entre les deux groupes ont été comparés par le test du log-rank. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

CDH17 est fortement exprimé dans les cellules de carcinome gastrique et est en relation avec les résultats cliniques pauvres

Tout d'abord, nous avons examiné le niveau d'expression de CDH17 dans 156 échantillons de carcinome gastrique par IHC: 69 (44,3%) des 156 cas étaient positifs, alors que les 87 cas restants (55,7%) étaient négatifs ou faibles pour CDH17 expression (figure 1).. Le niveau d'expression était +, 2+ et 3+ dans 21 (13,5%), 20 (12,8%) et 28 (17,9%) des cas, respectivement. Ces résultats indiquent que CDH17 peut jouer un rôle important dans la tumorigenèse du cancer gastrique. Nous avons ensuite comparé les caractéristiques cliniques et pathologiques des patients avec et sans expression CDH17. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée entre les deux groupes en ce qui concerne le sexe, l'âge, la taille de la tumeur, le site de la tumeur, la profondeur de l'invasion tumorale, métastase ganglionnaire, métastases à distance et le stade TNM (tableau 1)
.

Ensuite, nous avons étudié l'impact potentiel de CDH17 statut d'expression sur la survie à long terme des patients en analyse univariée et multivariée. Le suivi médian était de 24,3 mois, à la fin du suivi, 68 patients étaient encore en vie, 87 patients étaient décédés de la tumeur, et 1 patiente étaient morts d'une autre cause; le taux de survie à 5 ans liée au cancer dans toute la série était de 37,8%. Les analyses univariées ont montré une association entre la survie globale et le site de la tumeur, la différenciation histologique, stade TNM et d'expression CDH17 (tableau S1). Dans les analyses multivariées, site de la tumeur (p = 0,02) la différenciation histologique (p = 0,02), le stade TNM (p < 0,001) et l'expression CDH17 (p < 0,01) étaient des facteurs pronostiques indépendants pour la survie globale. Figue. 2A montre la différence de survie globale entre les patients avec et sans expression CDH17. La survie globale médiane était de 15,9 mois chez les patients présentant une expression CDH17 comparativement à 26,6 mois chez ceux CDH17 expression négative ou faible (P < 0,01), ce qui correspond à une réduction de 16% de la mortalité. En outre, la survie sans maladie (DFS) l'analyse a été réalisée chez 131 patients ayant subi une résection R0. À la fin du suivi, 69 (52,7%) des patients étaient encore en vie et 62 (47,3%) patients étaient décédés de récidive de la tumeur ou de métastases à distance, les analyses multivariées ont montré les résultats semblables, la différenciation histologique, site de la tumeur, la profondeur de l'invasion tumorale (stade pT), des ganglions lymphatiques métastases (stade pN) étaient des facteurs pronostiques indépendants pour la survie sans maladie (données non présentées). Nous avons également constaté que les patients sans expression CDH17 ont un meilleur pronostic que ceux qui avec l'expression CDH17 dans le tissu tumoral (figure 2B). (P < 0,01). La survie globale a été réduite chez les patients présentant une expression élevée de CDH17 (IHC 2+, 3+) que chez les patients avec CDH17 + expression (Fig. 2C). La médiane de survie globale des patients dont les tumeurs avaient plus l'expression CDH17 était de 10,9 mois pour CDH17 3+, 21,1 mois pour CDH17 2+, et 25,7 mois chez ceux assignés à être CDH17 + expression (p < 0,01).

CDH17 exprimé dans des lignées de cellules gastriques humaines

Nous avons évalué si les lignées cellulaires de carcinome gastrique humain expriment CDH17 et pourraient ainsi être utilisées pour évaluer en outre la fonction potentielle de cette protéine. Nous avons sélectionné un panel de 6 gastriques lignées cellulaires de carcinome avec un potentiel métastatique différent: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 et SGC-7901. CDH17 niveau de l'ARNm a été mesurée par analyse qRT-PCR. Une forte expression a été observée dans la lignée cellulaire de cancer gastrique primaire et métastatique (AGS et MKN-45) (Fig. S1A). analyse de blot Western a confirmé haute expression de la protéine CDH17 dans AGS (établie à partir d'une tumeur primaire) et MKN-45 (métastatique) (Fig. S1B).

Pris ensemble, ces résultats suggèrent que CDH17 est important pour l'initiation et la métastase du cancer gastrique; au moins un sous-ensemble de lignées de cellules de carcinome gastrique bien accrédités conserve l'expression de CDH17 permettant la caractérisation fonctionnelle supplémentaire.

CDH17 knockdown induit des effets anti-tumorales in vitro

Ensuite, nous avons frappé vers le bas dans CDH17 AGS-lignes cellulaires de carcinome gastrique et MKN-45 en utilisant des shRNA CDH17 spécifiques. Le knockdown cédé > 75% de réduction à la fois des taux de protéines et de l'ARNm (figure 3A.). Nous avons ensuite évalué les propriétés tumorigènes et métastatiques (prolifération, formation de colonies, l'adhérence, l'invasion et cycle cellulaire) des cellules CDH17 déficientes gastriques cancéreuses (cellules shCDH17) par rapport aux cellules de contrôle des vecteurs infectés simulacres.

CDH17 shRNA knockdown médié a donné lieu à une croissance significativement réduite des cellules de lignées cellulaires de carcinome gastrique (P < 0,001) (figure 3A, à droite).. formation Foci a également été inhibée de manière significative (P < 0,001) dans les cellules shCDH17 par rapport aux cellules simulées (figure 3B, Gauche.), un résultat similaire a été obtenu dans la gélose molle, dans laquelle la formation de colonies a été considérablement réduite dans les cellules shCDH17 (P < 0,001;. la figure 3B, à droite). Le rôle de CDH17 dans les métastases a été étudiée par des essais de cicatrisation des plaies et Transwell. CDH17 effet de choc a pu réduire la mobilité des cellules (Fig. 3C, gauche), tel que déterminé par le dosage de la plaie. test Transwell a révélé que l'expression réduite de CDH17 diminue de manière significative l'adhésion cellulaire (P < 0,001) (Fig. 3C, droite). Explorer le mécanisme sous-tendant l'inhibition de croissance par CDH17 effet de choc, les distributions de cycle cellulaire de cellules avec CDH17 shRNA en épingle à cheveux et Mock ont ​​été déterminées par cytométrie en flux: Des cellules shCDH17 ont été arrêtées en phase G0 /G1, avec moins de cellules en G2 /M en phase (fig . 3D). L'effet antitumoral de CDH17 effet de choc a été également observée dans la lignée cellulaire de carcinome gastrique métastatique MKN-45 (Fig. S2A-E). Selon les normes acceptées qui assureraient la qualité et la précision des expériences ARNi [14], nous avons effectué des expériences de sauvetage re exprimant CDH17 en AGS et MKN-45 shCDH17 cellules (Fig. S3A-B). Restauration d'expression CDH17 dans AGS et MKN-45 cellules a renvoyé les cellules au phénotype parental, confirmant que les effets anti-tumoraux de CDH17 knockdown ne sont pas dus à des effets cibles hors. Les expériences de sauvetage ont révélé que, après la restauration de l'expression CDH17 dans ces deux lignées cellulaires, la tumorigénicité et le potentiel métastatique ont augmenté à des niveaux similaires d'AGS parentales et des cellules MKN-45 (Fig. S3C-F). Ces résultats fournissent des preuves solides des rôles oncogéniques de CDH17 dans les cellules de carcinome gastrique.

CDH17 comme une cible in vivo pour la thérapie du cancer gastrique

Nous avons examiné si CDH17 est nécessaire pour la formation de tumeurs et l'invasivité dans des cellules de carcinome gastrique dans un modèle de souris nude. Nous injection sous-cutanée shCDH17, Mock et cellules AGS parentales dans des souris nude. Les tumeurs sont normalement visibles macroscopiquement sur la face dorsale des flancs dans une période de 6 à 8 semaines d'injection de cellules. 1 souris à la fois les parents et les groupes AGS Mock est mort au cours de la troisième semaine après injection (points limites ont été utilisés). Les souris ont été tuées 8 semaines après l'injection des cellules tumorales. Dans le groupe de souris injectées avec des cellules shCDH17, 2 souris ne présentait aucun nodule tumoral, et 8 souris ont montré une formation significative de la tumeur réduite par rapport aux souris injectées avec des cellules fictives. La taille des tumeurs et le poids ont été réduits de manière significative chez les souris injectées avec des cellules shCDH17 par rapport aux souris injectées avec des cellules fictives (Fig. 4A). Ces résultats montrent que la réduction de l'expression CDH17 peut supprimer de manière significative la tumorigénicité in vivo.

Pour mieux évaluer l'effet de CDH17 knockdown sur la croissance de la tumeur primaire, nous avons ensuite cherché à savoir si l'administration in vivo de CDH17 shRNA pourrait entraver la croissance d'un xénogreffe de tumeur établie à partir de cellules AGS parentales chez la souris nude. Une semaine après l'inoculation de la tumeur, lorsque la tumeur a atteint environ 100 mm ^{3, nous avons effectué une injection intratumorale de CDH17 shRNA ou vecteur maquette à une dose de 10 9 particule virale /injection sur le site de la tumeur. L'injection a été administrée deux fois par semaine pendant 2 semaines. Chez les animaux injectés avec le vecteur Mock, les tumeurs ont augmenté progressivement au cours de l'expérience. Au contraire, l'injection intratumorale de CDH17 shRNA a entraîné de manière significative des tumeurs plus petites à chaque point de temps, y compris la mesure du volume final (Fig. 4B). L'examen des cellules tumorales par IHC CDH17 a démontré une régulation remarquable de cible destiné CDH17 dans les cellules traitées shCDH17 (P < 0,05; fig. 4B). Ces résultats démontrent que, dans une régulation négative in vivo de CDH17 dans des cellules de carcinome gastrique réduit la formation de tumeurs chez la souris, ce qui implique que CDH17 est une cible thérapeutique pour le cancer gastrique.}

La régulation de la signalisation Wnt /β-caténine par CDH17 knock-down

Nous avons interrogé plusieurs voies afin de découvrir le mécanisme moléculaire d'inhibition CDH17 knockdown médiée par la croissance du cancer gastrique, la prolifération et la métastase. Nous avons trouvé plusieurs membres de la voie /β-caténine à différentiellement exprimés entre shCDH17 et cellules parentales. β-caténine expression, GSK-3β phosphorylation, et l'expression de la cycline D1 ont diminué; et l'expression Rb augmenté dans les deux AGS et les cellules MKN-45 shCDH17. En outre, l'expression de P53, MDM2 et la clé du cycle cellulaire p21 régulateur augmenté dans les cellules CDH17-knockdown. (Fig. 5A). Dans un TOPFlash /FOPFlash rapporteur de la luciférase test (Fig. 5B), la restauration de CDH17 dans les deux AGS et MNK-45 cellules a augmenté de manière significative la puissance des signaux TCF /LEF par rapport aux contrôles shCDH17. En outre, comme représenté à titre d'analyse immunoblot, on a détecté une augmentation à la fois de la protéine totale et nucléaire β-caténine après le rétablissement de CDH17 AGS et MKN-45, par rapport à la shCDH17 (fig. 5C) .Together, ces résultats indiquent que CDH17 knockdown entraîne une régulation négative de la voie /β-caténine dans les cellules cancéreuses gastriques. Ceci, à son tour, donne à penser que CDH17 maintient le potentiel prolifératif par Wnt /β-caténine de voie de signalisation.

Discussion

CDH17 est un nouveau cadhérine, sa structure étant différente de celles des cadhérines classiques en ce que le domaine N-terminal et la portion cytoplasmique affiche aucune homologie significative avec les cadhérines classiques [6]. La fonction biologique de CDH17 est encore inconnue. De nombreuses études ont rapporté des niveaux élevés de CDH17 dans divers cancers humains, reliant l'expression de cette protéine pour le pronostic et le risque assesment [10], [15]. CDH17 surexpression a été rapporté dans les adénocarcinomes gastriques [9], le carcinome hépatocellulaire [16] et le cancer colorectal [17]. Cela indique que CDH17 peut être crucial dans la tumorigenèse du cancer gastrique et le foie.

Chez l'homme, CDH17 est normalement exprimé exclusivement sur la surface basolatérale des hépatocytes et des entérocytes. Après le premier rapport du CDH17 comme un marqueur metapasia intestinale par Grotzinger et al [9], plusieurs enquêtes ont évalué l'expression CDH17 dans le cancer gastrique. CDH17 a été exprimé dans 50-78% des tissus de cancer gastrique avec de type intestinal prédominance [18], [19]. Dans la présente étude, nous démontrons que CDH17 est un oncogène et une cible thérapeutique intéressante dans le cancer gastrique: CDH17 est fortement exprimée dans les tissus tumoraux, avec près de la moitié des cancers gastriques étant CDH17 positif par IHC. Park et ses collègues ont évalué l'expression CDH17 dans plus de 200 échantillons de tissus de carcinome gastrique, et ont indiqué qu'il a été fortement exprimée dans les stades TNM antérieures [20], En outre, ils ont constaté que l'expression réduite de CDH17 a été montré pour être étroitement associée à l'agressivité de la tumeur et métastase ganglionnaire de carcinome gastrique humain [20]. Cependant, d'autres ont rapporté que son expression était beaucoup plus élevé dans les pays avancés métastase ganglionnaire [18], [21]. Dans notre étude, il n'y avait pas de relation entre l'expression CDH17 et d'autres caractéristiques clinico.

En tant que facteur pronostique, l'expression CDH17 a montré une tendance à un indicateur pour la survie défavorable dans plusieurs cohortes de patients, même après ajustement pour le stade tumoral. Dans ce contexte, la médiane de survie globale de 15,9 mois dans le groupe avec expression positive CDH17, contre 26,6 mois chez les patients atteints de tumeurs IHC négatifs représente une relation cliniquement significative. En outre, une analyse exploratoire a montré la survie globale médiocre chez les patients présentant une expression élevée de la protéine CDH17 (IHC 2+ et 3+) par rapport aux patients ayant une faible expression de la protéine CDH17 (IHC +). Ces résultats sont remarquables compte tenu du mauvais pronostic dans cette population. Collectivement, l'expression CDH17 est un marqueur pronostique utile dans le carcinome gastrique et semble être liée à la progression de la tumeur.

La présente étude démontre que shRNA médiée CDH17 knockdown dans les très tumorigènes gastriques cellulaires de carcinome lignes AGS et MKN-45 peut effectivement supprimer la croissance des cellules, de diminuer la formation de foyers et la formation de colonies dans la gélose molle, ainsi que d'invasivité et leur capacité métastatique du cancer gastrique in vitro. G1-S transition de phase est un point de contrôle important pour la progression du cycle cellulaire et de p21 est l'un des régulateurs négatifs importants au cours de cette transition [22]. Le principal effet du cycle cellulaire de CDH17 knock-down est l'inhibition de la transition de phase G1-S par l'activation de p21 a été confirmé dans des études blots (Fig. 5). Une étude récente dans les cellules de HCC a constaté que l'épuisement de CDH17 a entraîné l'inhibition de l'invasion, la croissance et les métastases dans les cellules de carcinome hépatocellulaire MHCC97H [16]. CDH17 est un régulateur positif pour migrateur, adhésif, et les comportements invasifs. Il est concevable que, en accord avec la N-cadhérine. Dans le cancer gastrique, CDH17 peut médier carcinome interaction cellulaire avec stroma gastrique et être impliqué dans la promotion de la métastase du cancer gastrique en facilitant la migration des cellules de carcinome et de rétablir homophile adhésion cellule-cellule dans les métastases. Nos études fournissent de nouveaux aperçus sur son rôle potentiel dans l'initiation du cancer de l'estomac et de la progression. D'après nos résultats, CDH17 est un oncogène et une cible thérapeutique intéressante dans le cancer gastrique.

En conséquence, nous postulons que le ciblage CDH17 peut être utilisé pour traiter le cancer gastrique in vivo. Des modèles murins de cancer gastrique ont été utilisés pour valider l'effet de cibler CDH17 comme un traitement potentiel. L'infection des cellules de carcinome gastrique par CDH17 shRNA aboli leur cancérogénicité chez les souris. Chez les souris porteuses de tumeur, administration locale de lentiviral basé sur le shRNA CDH17 a inhibé la croissance tumorale, présentant un effet de suppression de frappe sur la formation de tumeurs. Ces résultats ont d'importantes implications cliniques pour le traitement du cancer gastrique. À l'heure actuelle, il n'y a qu'un seul approuvé par la FDA thérapie ciblée pour le traitement d'un sous-ensemble du cancer gastrique: trastuzumab, un anticorps monoclonal qui interfère avec le récepteur HER2. Malheureusement, les tumeurs HER2 exprimant sont rares, seulement 22% des patients de cancer gastrique pourrait bénéficier de cette thérapie [23]. En revanche, CDH17 a été fortement exprimé dans le cancer gastrique dans presque 50% des patients (Tableau 1) .Actuellement, thérapie standard pour le cancer gastrique comprend la chirurgie avec debulking optimale de la maladie suivie d'un traitement cytotoxique. Malgré ces efforts, 80% des patients diagnostiqués avec un cancer gastrique développent une maladie récurrente et seulement 20% de ces patients survivent 5 ans après le diagnostic [24]. Nos résultats suggèrent fortement que les patients atteints de cancer gastrique peuvent bénéficier d'une thérapie ciblée contre CDH17, et justifier l'exploration et la conception d'inhibiteurs potentiels CDH17.

Les mécanismes moléculaires par lesquels CDH17 régule la croissance du cancer gastrique reste à élucider. Un récent rapport a montré une trans-interaction entre la E-cadhérine et CDH17 dans les entérocytes au cours du développement de l'épithélium intestinal [25], [26], ce qui suggère que CDH17 pourrait croiser la voie Wnt par sa coordination avec la E-cadhérine et /ou associés les partenaires. Des études antérieures ont trouvé que le ciblage CDH17 inactivant signalisation Wnt /β-caténine dans le carcinome hépatocellulaire [16]. L'activation de la signalisation /β-caténine se trouve dans environ 30% des cancers gastriques et des modèles animaux transgéniques ont également démontré que la signalisation Wnt favorise la carcinogenèse gastrique [27].

• PLOS ONE: Caveolin-1 Expression Level dans le cancer des fibroblastes associés Prédit Résultat dans le cancer gastrique
• PLOS ONE: Étude de phase II Évaluation 2 schémas posologiques de forétinib Oral (GSK1363089), ÉÉGC /VEGFR2 Inhibitor, chez les patients atteints du cancer métastatique gastrique