PLoS ONE: Nukreipimas CDH17 Stabdo naviko progresavimas skrandžio vėžio Downregulating WNT /β-kateninai signalizacijos

Anotacija

Paskirtis

Skrandžio vėžys išlieka viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio mirties visame pasaulyje. Pacientai paprastai pateikti vėluoja vietos invazijos ar metastazių, dėl kurių nėra veiksmingų gydymo nėra. Po ankstesnius tyrimus, kad nustatytų adhezijos molekulės cad-17 (CDH17) kaip galimą persekiotoją skrandžio karcinoma, mes atliekame įrodymas iš principo studijas sukurti racionalius gydymo metodai orientacijos CDH17 gydant šią ligą.

Metodai

imunohistocheminis buvo naudojamas studijuoti CDH17 išraišką 156 skrandžio karcinoma, ir tarp išlikimo ir CDH17 išraiškos santykiai buvo tiriamas daugiamatis analizės. RNR interferencijos tarpininkaujant triuškinantis iš CDH17 dėl gausėjančių skrandžio karcinoma ląstelių linijų poveikis buvo tiriamas in vitro ir in vivo, taip pat apie vartotojų signalizacijos poveikis munoblotingu.

Rezultatai

CDH17 buvo nuosekliai iki reguliuojama žmogaus skrandžio vėžio, ir bendras išgyvenamumas pacientams, sergantiems CDH17 ląstelę buvo prastesnė negu tiems, kurie neturi išraiškos šio geno (5 yrs bendras išgyvenamumas 29,0% vs 45,0%, p < 0,01). Funkciniai tyrimai parodė, kad CDH17 nokdaunas slopino ląstelių proliferacija, sukibimas, migracija, invazija, clonogenicity ir paskatinti G0 /G1 suimti. Pelėms, shRNR tarpininkaujant CDH17 nokdaunas gerokai slopina auglio augimą; naviką injekcija CDH17 shRNAs sukelia reikšmingų priešvėžiniai poveikio transplantuotų navikų modelių. Priešvėžiniai mechanizmus, sukeliančius CDH17 slopinimas susijęs nukenksminimą WNT /β-kateninai signalizacijos.

Išvada

Mūsų rezultatai nustatyti CDH17 kaip skrandžio karcinoma ir patraukli gydomojo tikslo šio agresyvaus piktybinių navikų biologinis žymuo.

nurodomoji dalis: Qiu Hb Zhang Ly, Ren, C Zeng ZL, VU Wj, Lo Hy, et al., (2013) Nukreipimas CDH17 Stabdo naviko progresavimas skrandžio vėžio Downregulating WNT /β-kateninai signalizacijos. PLoS ONE 8 (3): e56959. Doi: 10,1371 /journal.pone.0056959

redaktorius: Cara Gottardi Šiaurės vakarų universiteto Feinbergas medicinos mokykla, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Spalio 22, 2012; Priėmė: Sausis 16, 2013 m Paskelbta: Kovo 15, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Qiu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo (30672408 į RHX). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia priežastis, dėl vėžio mirties pasaulyje. Nors skrandžio vėžio atvejų smarkiai sumažėjo kai kurių išsivysčiusių šalių per pastarąjį dešimtmetį, iš vieno milijono naujų atvejų iš viso yra apskaičiuota, kad kasmet diagnozuojama [1]. Pacientai, sergantys šia liga dažniausiai turi prastą perspektyvą, sudaro 10% visų mirčių nuo vėžio [2]. Net ir po radikalios operacijos, daugiau nei pusė pacientų pasikartos. Limfmazgių dalyvavimas, gylis naviko invazija ir naviko vietą buvo nustatyta, kad svarbiausių clinicopathologic prognozinių veiksnių [3], [4].

Vietinis invazija ir tolima metastazės dažniausiai pasitaiko išplitusiu skrandžio karcinoma. Invazijos ir metastazių procesas yra sudėtingas ir reikalauja iš ląstelinių elementų, įskaitant kritinių adhezijos molekulių įvairovė reguliacijos sutrikimas. Cad priklauso vienai adhezijos molekulių šeimoms ir vaidina lemiamą vaidmenį kuriant ląstelių ląstelių sąveiką [5]. Cad-17 (CDH17), kuris taip pat vadinamas kepenų žarnų (LI) cad arba žmogaus peptidas nešiklio-1 (RPK-1), yra struktūriškai unikalus narys cad superšeimai [6], [7]. Kadangi vadinamieji klasikiniai cadherins, pavyzdžiui, e, N- ir P-cad, turi penkis cad kartojasi per tarpląstelinio domeną, CDH17 susideda iš septynių cad kartojasi. Be to, CDH17 turi tik 20 amino rūgščių citoplazmos domeno, kadangi klasikinių cadherins turėti labai konservatyvių citoplazminio domeno, kurį sudaro 150-160 aminorūgščių. CDH17 išreiškiamas pelių ir žmonių beveik išimtinai epitelio ląstelių tiek embriono ir suaugusiųjų plonosios žarnos ir storosios žarnos, be juntamo raiškos skrandžio ir kepenų [8].

Naudojant integralias genomo ir PROTEOMIKOS metodus, mokslininkai pradėjo nustatyti naujų onkogenų ir naviko slopintuvai skrandžio vėžio. Ankstesni tyrimai klinikinių kohortos nustatė CDH17 kaip galimą ligos žymenį skrandžio karcinoma [9], [10]. Nepaisant šių svarbių klinikinių duomenų, molekulinės funkcijos CDH17 lieka nežinomi, o jo tumorogeniškas vaidmuo skrandžio karcinoma dar nebuvo patvirtinta. Čia mes siekiama perpjauti onkogeninių signalines mechanizmus CDH17 į skrandžio karcinoma kontekste ir įvertino orientacija CDH17 kaip galimą terapinį metodą skrandžio vėžio poveikį.

metodų

Pacientai

tyrime dalyvavo 156 pacientai iš eilės (106 vyrų ir 50 moterų) NUMATYTA operuoti nuo 2002 metų sausio 1 iki 31 2006 gruodžio mėn Sun Yat-Sen universiteto onkologijos centras, Guangzhou, Kinija. Visi pacientai, dalyvaujantys šiame tyrime buvo histologiškai diagnozuota pirminės skrandžio karcinoma, kad toliau buvo analizuojami patologiškai po operacijos. Chirurgija sudarė tarpines ar visos pašalintas skrandis visiems pacientams; standartizuotas metodas buvo naudojamas chirurginis rezekcija ir limfadenektomija, kaip aprašyta kitur [3]. Pacientai, kuriems buvo atlikta ne resective operacija, ir tie su Siewert I tipo CARDIA adenokarcinoma buvo pašalinti iš tyrimo. Pavyzdys ir naviko dydis buvo įrašyti pagal patologai. Reprezentacinės sritys naviko buvo atrinkti ir priedėliai įšaldomi. pTNM klasifikacija po 6-osios redakcijos UICC kriterijus [11] .Sriegines vidutinis amžius pacientų buvo 57,2 metų amžiaus (diapazonas: 27-78 metų) amžiaus, lyties, tipo operacijos, naviko vietą, TNM etape, chemoterapija, pavyzdys ilgis, naviko dydį ir histologinis diferenciacija, buvo registruojama kiekvieno paciento duomenų bazėje. Visi pacientai, kuriems buvo atlikta kiekvieno chemoterapijos tipą buvo ant 5-FU, platinos ar Taxol turinčiais režimais. Visi pacientai po išrašymo iš ligoninės, įrašytas tolesnių programą pagal standartinį protokolą [12]. Tolesnių buvo uždarytas 2010 metais tyrimas buvo patvirtintas etikos komisijos Sun Yat-sen Universiteto Cancer Center balandžio, visi dalyviai, jei jų rašytinį informuoto sutikimo dalyvauti šiame tyrime.

Mobilaus ryšio linijų ir CDH17 antikūno

Skrandžio vėžys ląstelių linijas, AGS, MKN-45, HGC-27, MSV-803 BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros kolekcijos (Manassas, VA), japonų vėžio mokslinių tyrimų išteklius bankas (Tokijas, Japonija) ir Pekino medicinos universitetas (Pekinas, Kinija). Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpė (Sigma), papildyta 10% vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen) ir 1% penicilinui streptomicino (Invitrogen). Pelė monokloninis antikūnas prieš CDH17 (ab54511) buvo iš Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 trumpas segtukas RNR (shRNR)

pLKO.1 Puro (7 KB) lentiviruso konstruktas yra U6 rengėjas ir ŽIV-1 RNR pakavimo signalas pruomycin- ir ampicillin- pasipriešinimo elementų klonuoti 3 "iš žmogaus phosphoglycerate kinazės (hPGK) rengėjas. CpptCTE buvo įterptas 5 'iš hPGK rengėjas. Žmogaus CDH17 shRNR konstruktai buvo sukurtas liguojant šiuos atkaitintomis oligomerus į unikalių Agel ir EcoRI svetainėse pLKO.1 Puro: CDH17 shRNR priekį (5'-CCG Persijos AKTAS TTC ATA TCC GCT GGA AKTAS CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3) ir atbulinės eigos (5'-AAT TBS AAA ACC AKTAS TTC ATA TCC GCT GGA AKTAS CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3). Lentiviruso preparatai buvo gaminamas bendrai transfekuoja pLKO.1 puro tuščias vektorių su CDH17 shRNR ir pagalbininkas virusų pakavimo plazmidžių pCMVΔR8.9 ir pMG.G (esant 10:10:1 santykiu) į 293T ląstelių. Transfekcijq buvo atliekama naudojant lipofectamine ir plius reagento (Invitrogen). Lentiviruses buvo surinktos 24, 36, 48 ir 60 h po transfekciją. Du kontrolė buvo įsteigtas, kuriame skrandžio vėžio ląstelės arba negavo gydymo arba buvo pernešta su plakta ne tikslingai RNRi vektoriaus (Mock). Infekcija buvo atliktas apsaugai polibrenui 8 mikrogramai /ml buvimą. Po infekcijos, AGS ir MKN-45 ląstelių buvo atrinkti stabilios išraišką shRNAs naudojant 2 mikrogramai /ml puromicino. Ląstelės buvo lizuoti už Vakarų dėmė analizė 10 dienų po infekcijos.

imunoblotas ir pavienių ląstelių tyri- mas kolonos

Baltymų Lizatai paruošti iš ląstelių linija monosluoksnių naudojant lizės buferio (1% NP-40,50 mM Tris -HCl, pH 8,0, 100 mM natrio fluoridas, 30 mM natrio pirofosfato, 2 mM natrio molibdatas, 5 mM EDTA, 2 mM natrio orthovanadate), kuriame yra proteazės inhibitorių (10 mg /ml aprotinino, 10 mg /ml leupeptiną, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą ). Baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant Bio-Rad baltymų tyrimas (Bio-Rad Laboratories "Hercules, CA, JAV). Ląstelių fragmentai buvo atliktas natrio dodecilo sulfacte-poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE), ir atskirtų baltymai buvo elektroforezės metodu perkelti į immobilon-P membranomis (Millipore). Po blokavimo iki neriebiu pienu, Membranos buvo inkubuojami nepriklausomai pirminėje antikūnų P53 (Cell SignalizacijosΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), 21 psl (Zymed!-7000), cikloniniai D1 (Santa Cruz SC-753 ), rb (Mobilusis Signalizacijos΢9), β-kateninai (Zymed, 13-8400), GSK3β (Santa Krusas, SZ-7291) ir p-GSK3β (Ser9) (Mobilusis SignalizacijosΥ6). Membrana buvo nuplauti kelis kartus PBS su 0,1% Tween20 ir nuskaitomi Li-COR Odyssey infraraudonųjų dviejų spalvų aptikimas Rodymo sistemos (Li-COR biologijos mokslų) pagal gamintojo instrukcijas.

pavienių ląstelių tyri- mas fractionations buvo atliekama naudojant specialūs ląstelių lizės buferiai ir pakartotiniai centrifugavimo žingsniai (branduolinė ekstraktas komplektas iš aktyvaus motyvas Carlsbad, CA) pagal gamintojo specifikacijas. Mobilaus ryšio frakcijos buvo ištirpinta Ripa buferio, ir baltymo koncentracija buvo matuojamas naudojant BCA baltymų kiekybinio įvertinimo testą. Baltymo ekstraktai (20 mikrogramų) buvo toliau ištirpinamas 1 × Laeminli buferio, elektroforetiškai dėl 10% SDS-PAGE ir perkelti ant nitroceliuliozės membranos, kaip aprašyta aukščiau. Vakarų dėmė analizė poli-ADP ribozės polimerazės (PARP, iš ląstelių Signalizacijos technologijų Inc, Beverly, MA) ir superoksido dismutazės 2 (Sod2, nuo ABFrontier, Seulas, Korėja) buvo atliekami siekiant patvirtinti tinkamą atskyrimui branduolinių ir citozolio baltymų.

Kiekybiniai atvirkštinės transkripcijos-PGR (qPT-PGR)

viso RNR buvo išskirta iš ląstelių linijų ir šaldytų skrandžio adenokarcinoma audinių Iki TRIzol reagento (Invitrogen). Atvirkštinę transkripciją visos RNR (2 AG) buvo padaryta naudojant privalumas RT PGR rinkinys (Klontex) ir kDNR buvo atliktas PGR 28 ciklų amplifikacija su šiais pradmenimis: CDH17 FW, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC ir CHD17 RV, 5 "-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-Actin buvo naudojamas kaip kontroliuoti.

imunohistocheminis (IHC)

iš visų 156 formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų skrandžio vėžio audinio mėginiai buvo atrinkti IHC tyrimo. IHC dažymo buvo atliktas 5-mikrometrai audinių skyriuose rehidrataciją per rūšiuojami alkoholiai. Endogeninės peroksidazės aktyvumas buvo užblokuotas su 0,3% vandenilio peroksido 15 min. Skaidres buvo mikrobangų apdorojamos 10 mM citrato buferio (pH 6,0), skirtos 10 min. Nespecifinis privalomas buvo užblokuotas su 10% normalaus triušių serumo 20 min. Audinių skaidres buvo inkubuojamos su anti-CDH17 (01:50 praskiedimo) 60 min 37 ° C temperatūroje drėgnoje kameroje. Skaidres buvo inkubuojamos su biotinilintu triušio anti-pelės imunoglobulino esant 1:100 koncentracijos 30 min 37 ° C temperatūroje, po to reaguoja su streptavidino-peroksidazės konjugato 30 min 37 ° C temperatūroje ir pagaliau inkubuojamos su 3-3 'diaminobenzidinu kaip Chromogenas substratas. Norėdami pašalinti klaidingą teigiamą signalą, neigiami kontroliniai mėginiai buvo įtraukta į kiekvieną pakeičiant pirminį antikūną su blokavimo serumo bandymą. Du nepriklausomi stebėtojai apakinti į clinicopathologic informacijos pelnė skaidres. Iš dažymo apibrėžimas buvo taip: neigiamas, su 0% iki mažiau nei 5% naviko ląstelių, rodančių reaktyvumas; silpnas, 5-40% naviko ląstelių, rodančių reaktyvumas; teigiamas, daugiau nei 40% naviko ląstelių, rodančių reaktyvumas. Teigiami atvejai Darbuotojų tolesnis subrangos suskirstyti į CDH17 + (reaktyvumas: 40-60%), CDH17 2+ (reaktyvumas: 60-80%) ir CDH17 3+ (reaktyvumas: 80-100%).

Be vitro tyrimai, siekiant įvertinti naviko fenotipą

eksperimentinės procedūros ląstelių augimą, židinių susidarymo, minkštas agaro, ląstelių migraciją, žaizdų gijimą ir ląstelių ciklo tyrimai yra aprašyti patvirtinamieji metodai S1.

gelbėjimo eksperimentai

iš CDH17 gelbėjimo shCDH17 AGS ir MKN-45 ląstelių linijų aprašyti patvirtinamieji metodai S1.

in vivo pelių modelius skrandžio vėžio

Šis tyrimas buvo atliktas iš griežtai laikantis vadove rekomendacijas dėl priežiūros ir naudojimo laboratorinių gyvūnų iš nacionalinių sveikatos institutų. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai Sun Yat-sen Universiteto Cancer Center etikos komiteto (leidimo numeris: 09-0238). Visi chirurgija buvo atlikta pagal natrio pentobarbitalio anestezijos ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų. Po narkozės, Nude pelėms buvo paaukojo slankstelių dislokaciją.

auglio susidarymą nuogas pelių.

vivo Tumorigenesis tyrė navikas ksenografiniuose eksperimentams. Apie 2 × 10 ^{6 AGS ląstelės užsikrėtę CDH17 shRNR, kontrolės užsikrėtę juoktis RNAi vektoriaus ir tėvų AGS ląstelių AGS ląstelės buvo švirkščiamas po oda į dešinę ir kairę užpakalinių kojų 4 savaičių senumo nuogas pelėms (30 pelėmis, 10 vienam būklės). Naviko formavimasis nuogas pelių buvo stebimi daugiau nei 8 savaičių laikotarpį. Navikas tūris buvo apskaičiuojamas pagal formulę V = 0,5 × L × W 2. [13]}

Naviko guolis pelės modelis.

poodinio navikai buvo sukeltas nuogas pelėmis, kurioms, kaip nurodyta pirmiau minėtus AGS ląsteles. Vieną savaitę po inokuliacijos, pelės buvo gydomi anti-CDH17 shRNR. Kiekvienas pelės gavo 100 įxL naviką injectionscontaining 1 × 10 ^{9 kopijos CDH17 ar juoktis lentiviruso, du kartus per savaitę 2 savaites. Penki pelių buvo naudojami kiekvienoje grupėje. Naviko augimo buvo stebimi kasdien.}

Statistika

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS 13.0. Skirtumai tarp kintamųjų buvo įvertintas χ2 analizės arba 2-tailed Stjudento t testų. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD, nebent nurodyta kitaip. Bendras išgyvenamumas (OS) ir išgyvenimo be ligos (DFS) kreivės buvo apskaičiuojamas Kaplan-Meier metodu, ir tarp šių dviejų grupių skirtumai buvo lyginamos pagal žurnalą rango testą. buvo laikomas p reikšmė mažesnė nei 0,05 statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

CDH17 yra labai išreikštas skrandžio karcinoma ląstelių ir yra susijęs su prasta klinikinės baigties

Pirmiausia, mes išnagrinėjo išraiška lygį CDH17 156 skrandžio karcinoma egzempliorių IHC: 69 (44,3%) iš 156 atvejų buvo teigiami, o likusių 87 atvejų (55,7%) buvo neigiami arba silpnas CDH17 išraiškos (1 pav.). Išraiškos lygis buvo + 2+ ir 3+ 21 (13,5%), 20 (12,8%) ir 28 (17,9%) atvejais atitinkamai. Šie rezultatai rodo, kad CDH17 gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio Tumorigenesis. Mes tada palyginti klinikinius ir patologinių funkcijų pacientų su ir be CDH17 išraiška. nepastebėta statistikos reikšmingų skirtumų tarp šių dviejų grupių, atsižvelgiant į lytį, amžių, naviko dydžio, naviko svetainėje, gylis naviko invazijos, limfmazgių metastazių, tolimos metastazės ir TNM etape (1 lentelė).

Be to, mes ištirti galimą poveikį CDH17 ekspresijos būklė dėl ilgalaikio išlikimo pacientams pagal vieną požymį ir Dispersinės analizės. Stebėjimo trukmės mediana buvo 24,3 mėnesio, pasibaigus stebėjimo pabaigoje, 68 pacientų vis dar buvo gyvi, 87 pacientai mirė nuo auglio, o 1 pacientui mirė nuo kitų priežasčių; vėžys susijusios 5 metų išgyvenamumas visoje serijoje buvo 37,8%. Vienmatės analizė parodė tarp bendro išgyvenamumo ir auglio vietą, histologinio diferenciacijos, TNM etape ir CDH17 išraiškos (lentelė S1) asociacija. Be daugiamatis analizes, auglio vietą (p = 0,02) histologinis diferenciacija (p = 0,02), TNM stadija (p < 0,001) ir CDH17 išraiška (p < 0,01) buvo nepriklausomi prognostiniai veiksniai bendrojo išgyvenimo. Pav. 2A rodo bendras išgyvenamumas nesiskyrė pacientų su ir be CDH17 išraiška. Bendro išgyvenamumo mediana buvo 15,9 mėn pacientams, sergantiems CDH17 išraiška, palyginti su 26,6 mėnesių tose CDH17 neigiamo ar silpna išraiška (p < 0,01), atitinkantis 16% sumažinti mirtingumą. Be to, išgyvenimą iki ligos progresavimo (DFS) analizė buvo atlikta 131 pacientų, kuriems buvo atlikta R0 rezekcijos. Pasibaigus stebėjimo pabaigoje, 69 (52,7%) pacientų vis dar buvo gyvi ir 62 (47,3%) pacientai mirė nuo auglio pasikartojimo ar tolimoje metastazių, daugiamatės analizės parodė panašius rezultatus histologinis diferenciaciją, auglio vietą, gylį naviko invazijos (pT etapas), limfos mazgas metastazės (pn etapas) buvo nepriklausomi prognostiniai veiksniai išgyvenimą iki ligos progresavimo (duomenys neparodyti). Mes taip pat nustatė, kad pacientai be CDH17 išraiškos geriau prognozę nei tie, kurie su CDH17 išraiškos auglio audinio (2B pav.) (P < 0,01). Bendras išgyvenamumas buvo mažesnis pacientams, sergantiems didelio išraiška CDH17 (IHC 2+, 3+), nei pacientams, sergantiems CDH17 + raiškos (pav. 2C). Bendro išgyvenimo mediana pacientų, kurių augliai buvo didesnis CDH17 išraiška buvo 10,9 mėnesiai CDH17 3+ 21.1 mėnesiai CDH17 2+ ir 25,7 mėnesiai kurie yra skirti būti CDH17 + išraiška (p < 0,01).

CDH17 išreikšta žmogaus skrandžio ląstelių linijų

Mes įvertinome, ar žmogaus skrandžio karcinomos ląstelių linijos išreikšti CDH17 ir taip gali būti naudojama toliau įvertinti galimą funkcija, tai baltymų. Mes atrinko 6 skrandžio karcinoma ląstelių linijų skirtingo metastazavusiu potencialo skydelį: AGS, MKN-45, HGC-27, MSV-803 BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901. CDH17 iRNR lygis buvo matuojamas KRL-PGR analizei. Stiprus išraiška buvo vertinama pirminės ir metastazavusiu skrandžio karcinoma ląstelių linijos (MAA ir MKN-45) (pav. S1A). Vakarų dėmės analizė patvirtino aukštą CDH17 baltymų ekspresiją AGS (nustatoma pagal pirminio naviko) ir MKN-45 (metastazavusiam) (Pav. S1B).

Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad CDH17 svarbu inicijuoti ir metastazių skrandžio vėžio; bent gerai akredituoto skrandžio karcinoma ląstelių linijų poaibis išlaiko išraišką CDH17 leidžianti toliau funkcionavimo apibūdinimui.

CDH17 nokdaunas skatina priešnavikinis poveikis in vitro pervežimas

Be to, mes nuvertė CDH17 į skrandžio karcinomos ląstelių linijos-MAA ir MKN-45 naudojant CDH17 konkrečius shRNAs. Nokdaunas davė > 75% sumažinti tiek mRNR ir baltymų koncentracijos (pav 3a.). Mes tada įvertino tumorogeninį ir metastazavusiu savybes (proliferacija, kolonija formavimas, sukibimo, invazija ir ląstelių ciklas) apie CDH17 trūkumas skrandžio vėžio ląstelių (shCDH17 ląstelių), palyginti su juoktis užkrato užkrėstų kontrolinių ląstelių.

CDH17 shRNR sąlygojamą nokdaunas lėmė gerokai sumažintas ląstelių augimą skrandžio karcinoma ląstelių linijas (p < 0,001) (3a pav, Teisė.). Židiniai formavimas taip pat buvo smarkiai slopino (p < 0,001) shCDH17 ląstelių, lyginant su Mock ląstelių (pav 3B, Kairysis.), Panašus rezultatas buvo gautas minkštas agaro, kuriame kolonija formavimas gerokai sumažėjo shCDH17 ląstelių (p < 0,001; pav. 3B, dešinėje). Iš CDH17 vaidmuo metastazių buvo tiriamas žaizdų gijimo ir transwell tyrimus. CDH17 nokdaunas galėjo sumažinti ląstelių mobilumą (pav. 3C, kairėje), kaip nustatyta žaizdos tyrimu. Transwell tyrimas atskleidė, kad sumažintas išraiška CDH17 žymiai sumažėja ląstelių sukibimą (p < 0,001) (pav. 3C, dešinėje). Tirti mechanizmo, lemiančio augimo slopinimo CDH17 triuškinantis, ląstelės ciklo skirstiniai ląstelių, turinčių CDH17 shRNR segtukas ir Mock lėmė tėkmės citometrijos: shCDH17 ląstelės buvo suimtas G0 /G1 fazės, su mažiau ląstelių G2 /M-fazės (pav 3D.). Priešvėžiniai poveikis CDH17 triuškinantis taip pat buvo pastebėtas metastazavusiu skrandžio karcinoma ląstelių linijos MKN-45 (pav. S2A-E). Pagal pripažintus standartus, kad būtų apdrausti kokybę ir tikslumą RNAi eksperimentų [14], mes atliekame gelbėjimo eksperimentai naujo išreikšti CDH17 į AGS ir MKN-45 shCDH17 ląstelės (pav. S3A-B). Restauravimas CDH17 raiškos AGS ir MKN-45 ląstelių grįžo ląsteles tėvų fenotipo, patvirtinantis, kad anti-vėžinių poveikis CDH17 triuškinantis buvo ne dėl nuo tikslo poveikį. Gelbėjimo eksperimentai parodė, kad atkūrus CDH17 išraiškos šių dviejų ląstelių linijų atveju tumorogeniškumo ir metastazavusiu potencialas išaugo iki panašaus lygio tėvystės AGS ir MKN-45 ląstelių (pav. S3C-F). Šie rezultatai suteikia tvirtą įrodymų apie onkogeniniam vaidmenų CDH17 skrandžio karcinoma ląsteles.

CDH17 kaip in vivo Target skrandžio vėžio gydymo

Mes išnagrinėti, ar CDH17 reikalingas auglio susidarymo ir invaziškumo į skrandžio karcinomos ląstelės nuogas pelėmis modelį. Mes po oda švirkščiamas shCDH17, netikrus ir tėvų AGS ląsteles į nuogas pelių. Navikai yra paprastai matomas akimi į nugaros šonai per 6 iki 8 savaičių laikotarpį ląstelių injekcija. 1 pelė iš abiejų tėvų AGS ir Mock grupių mirė per trečią savaitę po injekcijos (poveikio žmonėms buvo naudojamas). Pelės žuvo 8 savaitėms po naviko ląstelių injekcija. Pelių sušvirkšta shCDH17 ląstelių grupės, 2 peles rodomas ne auglys mazgeliai, ir 8 pelėmis parodė, jog žymiai sumažėjo auglio susidarymą palyginti su pelėmis sušvirkšta juoktis ląsteles. Naviko dydis ir svoris buvo žymiai sumažino pelių sušvirkšta shCDH17 ląstelių, lyginant su pelėmis sušvirkšta juoktis ląstelių (pav. 4a). Šie rezultatai rodo, kad CDH17 raiškos sumažinimas gali gerokai nuslopinti tumorogeniš- in vivo.

Jei dar įvertinti CDH17 triuškinantis dėl pirminio tumoro augimo efektą, tada mes ištirti, ar in vivo, pristatymas CDH17 shRNR gali trukdyti An augimą įkurta navikas svetimo nuo tėvų AGS ląstelių nuogas pelių. Vieną savaitę po skiepijimo naviko, kai navikas pasiekė maždaug 100 mm ^{3, mes atliko naviką injekcijos CDH17 shRNR ar juoktis vektoriaus siekia 10 9 virusinės dalelės /injekcijos dozė prie auglio vietą. Injekcijos buvo vartojama du kartus per savaitę, 2 savaites. Gyvūnų, kurie buvo suleistų su Mock vektoriaus, augliai išaugo palaipsniui per eksperimento metu. Priešingai, naviką injekcija CDH17 shRNR lėmė žymiai mažesnius auglius kiekviename laiko taške, įskaitant galutinio tūrio matavimo (4B pav.). Išnagrinėjus naviko ląstelėse CDH17 IHC parodė nepaprastą žemyn reguliavimą ketinama CDH17 taikinį į shCDH17 paveiktų ląstelių (P < 0,05; 4B pav.). Šie rezultatai rodo, kad in vivo downregulation iš CDH17 skrandžio karcinoma ląstelių sumažina auglio susidarymą pelėmis, o tai reiškia, kad CDH17 yra terapinis taikinys skrandžio vėžio.}

Down reguliavimo WNT /β-kateninai signalizacijos iki CDH17 triuškinantis

tardytas kelis būdus, siekiant atrasti molekulinę mechanizmą CDH17 nokdaunas slopinamos skrandžio vėžio augimo, platinimo ir metastazių. Mes nustatėme, keli nariai WNT /β-kateninai keliu turi būti skirtingai išreikšti tarp shCDH17 ir tėvinės ląstelės. β-kateninai išraiška GSK-3β fosforilinimas ir cikloniniai D1 raiška sumažėjo; ir Rb išraiška padidėjo abiejose AGS ir MKN-45 shCDH17 ląsteles. Be to, išraiška P53, MDM2 ir pagrindinę ląstelės ciklo reguliatoriaus p21 padidėjo CDH17-triuškinantis ląsteles. (5A pav.). Be TOPFlash /FOPFlash reporteris liuciferazės tyrimo (5b pav.), Restauracija CDH17 tiek AGS ir MNK-45 ląstelių žymiai padidino TCF /LEF signalų stiprumą lyginant su shCDH17 kontrolės. Be to, kaip parodė būdu Imunoblotingas, mes aptiko tiek bendro ir branduolinės β-kateninai baltymų padidėjimas Atkūrus CDH17 į AGS ir MKN-45, palyginti su shCDH17 (. 5C pav) .Together, šie rezultatai rodo, kad CDH17 triuškinantis rezultatus downregulation iš WNT /β-kateninai keliu skrandžio vėžio ląsteles. Tai, savo ruožtu, reiškia, kad CDH17 palaiko dauginimosi potencialą WNT /β-kateninai rūšyse signalizacijos.

Diskusijos

CDH17 yra naujas cad, jos struktūra yra skiriasi nuo klasikinių cadherins tuo, kad N-galinį domeną ir citoplazmos dalis rodo neturi didelės homologiją su klasikiniu cadherins [6]. Biologinis funkcija CDH17 vis dar nežinoma. Daugybė tyrimų pranešė padidėjęs CDH17 įvairiose žmogaus vėžio, susiejant išraišką šio baltymo prognozės ir rizikos vertinimas [10], [15]. CDH17 raiška buvo pranešta skrandžio adenokarcinoma [9], kepenų ląstelių karcinoma [16] ir tiesiosios žarnos karcinoma [17]. Tai rodo, kad CDH17 gali būti labai svarbus skrandžio ir kepenų vėžiu Tumorigenesis.

žmonėms, CDH17 paprastai išreiškiama tik į basolateral paviršiaus hepatocitų ir enterocituose. Po pirmojo pranešimo CDH17 kaip žarnyno metapasia persekiotoją iki Grotzinger et al [9], keli tyrimai vertinami CDH17 išraišką skrandžio vėžio. CDH17 buvo išreikšta 50-78% skrandžio vėžio audiniuose su žarnyno tipo vyravimas [18], [19]. Šiame tyrime mes įrodyti, kad CDH17 yra onkogeno ir patraukli terapinis taikinys skrandžio vėžiu: CDH17 yra labai išreikštas navikų audiniuose, beveik pusę skrandžio vėžio šaliai CDH17 teigiamas IHC. Parkas ir kolegos įvertino CDH17 išraiška daugiau nei 200 skrandžio karcinoma audinių pavyzdžių, ir pranešė, kad jis buvo labai išreikšta ankstesniais TNM etapais [20], Be to, jie nustatė, kad sumažintas išraiška CDH17 buvo įrodyta, kad būti glaudžiai susijęs su naviko agresyvumą ir limfmazgių metastazės žmogaus skrandžio karcinoma [20]. Tačiau kiti pranešė, kad jo išraiška buvo daug didesnis pažangių limfmazgių metastazių [18], [21]. Mūsų tyrimo duomenimis, ten buvo tarp CDH17 saviraiškos ir kitų klinikos ypatybių nėra santykiai.

Kaip prognostinis faktorius, CDH17 išraiška rodė tendenciją paraišką nepalankios išgyvenimo keliais Pacientų grupės rodiklį, net po to, kai kontroliuojant auglio stadijoje. Atsižvelgiant į tai, vidutinis bendras išgyvenamumas 15,9 mėnesius grupės su pozityvaus CDH17 išraiškos, vs 26,6 mėnesių pacientams, sergantiems IHC neigiamų navikų yra kliniškai reikšmingą ryšį. Be to, tiriamoji analizė parodė prastą bendrą išgyvenimą pacientams, sergantiems didelio išraiška CDH17 baltymo (IHC 2+ ir 3+), palyginti su pacientais, kurių mažos raiškos CDH17 baltymo (IHC +). Šie duomenys yra Pažymėtina, atsižvelgiant į prastą prognozę šioje populiacijoje. Apibendrinant, CDH17 išraiška yra naudinga prognostinė žymeklis skrandžio karcinoma, atrodo, būti susiję su naviko progresavimo.

Šis tyrimas rodo, kad shRNR tarpininkaujant CDH17 triuškinantis į labai kancerogeniniam skrandžio karcinoma ląstelių linijų AGS ir MKN-45 galėtų veiksmingai slopinti ląstelių augimą, sumažinti židinių susidarymą ir kolonijas sudarančių vienetų susidarymą minkštu agaro, taip pat yra invazinis ir metastazių; gebėjimą skrandžio vėžio in vitro. G1-S fazinis virsmas yra pagrindinis Checkpoint už ląstelės ciklo progresavimo ir p21 yra vienas iš kritinių neigiamų reguliavimo šio perėjimo [22] metu. Pagrindinis ląstelės dalijimosi ciklo poveikis CDH17 triuškinantis yra slopinimas G1-S fazinio virsmo per p21 aktyvavimo buvo patvirtinta dėmės tyrimų (5 pav.). Neseniai atliktas tyrimas į HCC ląstelių nustatė, kad iš CDH17 išeikvojimas lėmė invazijos, augimo ir metastazių slopinimo MHCC97H kepenų ląstelių karcinoma ląstelių [16]. CDH17 yra teigiamas reguliatorius migruojančių, klijų ir invazinių elgesį. Tikėtina, kad, laikantis N-cad. Skrandžio vėžio, CDH17 gali tarpininkauti karcinoma ląstelių sąveiką su skrandžio stromos ir dalyvauja skrandžio vėžio metastazių skatinimo palengvinant karcinoma ląstelių migraciją ir atkurti homophilic ląstelių ląstelių sukibimą metastazių. Mūsų tyrimai suteiks naujų įžvalgų apie jos galimą vaidmenį skrandžio vėžio inicijavimo ir progresavimą. Pagal mūsų rezultatus, CDH17 yra onkogeno ir patraukli Gydymo tikslas skrandžio vėžio.

Todėl, mes postulate, kad taikant pagal CDH17 gali būti naudojamas gydyti skrandžio vėžio in vivo. Pelės modeliai skrandžio vėžio buvo naudojami patvirtinti, kad orientacija CDH17 kaip galimą gydymo poveikį. Infekcija skrandžio karcinoma ląstelėse CDH17 shRNR panaikino savo kancerogeniškumo pelių. Naviko guolis su pelėmis, vietinis pristatymas lentiviruso remiantis CDH17 shRNR slopina naviko augimą, rodo ryškus slopinimo poveikį naviko susidarymą. Šie rezultatai turi svarbių klinikinių pasekmių skrandžio vėžiui gydyti. Šiuo metu, yra tik vienas FDA patvirtintas nukreiptas gydymas panaudojimas gamybai skrandžio vėžio pogrupyje gydymo: trastuzumabo, monokloninio antikūno, kuris trukdo su HER2 receptorius. Deja, HER2 ekspresija navikai yra reti, tik 22% skrandžio vėžio pacientas galėtų gauti naudos iš šios terapijos [23]. Priešingai, CDH17 buvo labai išreikštas skrandžio vėžio beveik 50% pacientų (1 lentelė) .Currently, standartinis gydymas skrandžio vėžio apima chirurgija su optimalaus debulking ligos po citotoksinį gydymą. Nepaisant šių pastangų, 80% pacientų, kuriems diagnozuota skrandžio vėžio kurti pasikartojantį liga ir tik 20% šių pacientų išgyventi 5 metus nuo diagnozės nustatymo [24]. Mūsų rezultatai aiškiai rodo, kad skrandžio vėžiu sergantiems pacientams gali pasinaudoti tikslingai terapija prieš CDH17, ir garantuojate, tirti ir dizainas potencialių CDH17 inhibitoriais.

molekulinius mechanizmus, kuriais CDH17 reguliuoja skrandžio vėžio augimą dar reikia išsiaiškinti. Neseniai ataskaita parodė, peržengianti sąveiką E-cad ir CDH17 enterocituose plėtros žarnyno epitelio metu [25], [26], o tai rodo, kad CDH17 gali susikerta su WNT keliu per savo suderinusi su E-cad ir /arba susijusi Partneriai. Ankstesni tyrimai parodė, kad orientacija CDH17 inaktyvuoja WNT /β-kateninai signalizacijos kepenų ląstelių karcinoma [16]. Aktyvinimas WNT /β-kateninai signalizacijos randama apie 30% skrandžio vėžio ir transgeninių gyvūnų modeliai taip pat parodė, kad WNT signalizacijos skatina skrandžio kancerogenezės [27].

• PLoS ONE: Caveolin-1 išraiška lygis vėžiu asocijuotųjų fibroblastų prognozuoja baigtis Skrandžio Cancer
• PLoS ONE: II fazės tyrimo vertinimas 2 dozavimas geriamųjų Foretinib (GSK1363089) cMet /KEAFR 2 inhibitorius, pacientams, sergantiems skrandžio vėžiui