De abstracte
Doel
Maagkanker blijft een van de belangrijkste oorzaken van kanker overlijden wereldwijd. Patiënten meestal aanwezig te laat met lokale invasie of metastase, waarvoor er geen effectieve therapieën beschikbaar. Naar aanleiding van eerdere studies dat de adhesie molecuul cadherine-17 (CDH17) geïdentificeerd als een potentiële marker voor maagcarcinoom, voerden we proof-of-principle studies rationele therapeutische benaderingen gericht CDH17 voor de behandeling van deze ziekte te ontwikkelen.
Immunohistochemie werd gebruikt om de expressie van CDH17 bestuderen 156 maagcarcinomen, en de relatie tussen de overleving en CDH17 expressie werd onderzocht door multivariate analyse. Het effect van RNA-interferentie gemedieerde knockdown van CDH17 op de proliferatie van maagcarcinoom cellijnen werd bestudeerd in vitro en in vivo, alsook de effecten op stroomafwaartse signalering door immunoblotting.
CDH17 was altijd opwaarts gereguleerd in menselijke maagkanker en totale overleving bij patiënten met CDH17 opregulatie was slechter dan bij proefpersonen zonder expressie van dit gen (5 jr overall overleving 29,0% vs. 45,0%, P < 0,01). Functionele assays die CDH17 knockdown remden celproliferatie, adhesie, migratie, invasie, clonogenicity en induceren G0 /G1 arrest. In muizen, shRNA-gemedieerde knockdown CDH17 aanzienlijk remt tumorgroei; intratumorale injectie van CDH17 shRNAs resulteert in significante antitumor effecten op getransplanteerd tumormodellen. De anti-tumor mechanismen die ten grondslag liggen aan CDH17 remming betrekken inactivatie van Wnt /β-catenine signalering.
Onze resultaten identificeren CDH17 als een biomarker van maagcarcinoom en aantrekkelijke therapeutisch doel voor deze agressieve maligniteit.
Visum: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Targeting CDH17 Onderdrukt progressie van de tumor bij maagkanker door neerwaarts reguleren Wnt /β-catenine signalering. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10.1371 /journal.pone.0056959
Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, de Verenigde Staten van Amerika
Ontvangen: 22 oktober 2012; Aanvaard: 16 januari 2013; Gepubliceerd: 15 maart 2013
Copyright: © 2013 Qiu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd
Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation (30672408 tot RHX). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript
Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan
Introductie
Maagkanker is de vierde meest voorkomende oorzaak van kanker overlijden in de wereld. Hoewel de incidentie van maagkanker dramatisch in sommige ontwikkelde landen de afgelopen tien jaar is afgenomen, zijn een totaal van een miljoen nieuwe gevallen naar schatting elk jaar te worden gediagnosticeerd [1]. Patiënten met deze ziekte hebben vaak een slechte vooruitzichten, goed voor 10% van het totale aantal sterfgevallen kanker [2]. Zelfs na radicale chirurgie, meer dan de helft van de patiënten terugkeren. Betrokkenheid van de lymfeklieren, de diepte van tumorinvasie en tumor locatie zijn geïdentificeerd als de meest significante clinicopathologic prognostische factoren [3], [4].
Local invasie en metastasen op afstand regelmatig voordoen in gevorderde maagcarcinoom. Het proces van invasie en metastase is complex en vereist de ontregeling van diverse cellulaire elementen inclusief kritische adhesiemoleculen. Cadherine behoort tot een van de families adhesiemolecuul en speelt een cruciale rol bij het vaststellen van cel-cel interacties [5]. Cadherine-17 (CDH17), die ook wordt genoemd lever-darm (LI) cadherine of humane transporter peptide-1 (HPT-1), is een uniek structureel lid van de cadherine-superfamilie [6], [7]. Dat de zogenaamde klassieke cadherinen, zoals E-, N- en P-cadherine, vijf cadherine herhalingen in het extracellulaire domein, CDH17 bestaat uit zeven cadherine herhalingen. Bovendien CDH17 slechts 20 aminozuren in het cytoplasmatische domein, terwijl klassieke cadherinen een geconserveerde cytoplasmatisch domein bestaat uit aminozuren 150-160. CDH17 uitgedrukt in muis en mens bijna uitsluitend in epitheliale cellen zowel embryonale en volwassen dunne darm en colon, met geen detecteerbare expressie in de maag en de lever [8].
Gebruikmakend integratieve genomische en proteomische benaderingswijzen hebben onderzoekers begonnen nieuwe oncogenen en tumor suppressors identificeren maagkanker. Eerdere studies van klinische cohorten die CDH17 als potentiële ziektemarker voor maagcarcinoom [9], [10]. Ondanks deze significante klinische bevindingen, de moleculaire functies van CDH17 steeds onbekend, en zijn rol in tumorigene maagcarcinoom is nog niet bevestigd. Hier wilden wij de oncogene signalering mechanismen van CDH17 ontleden in de context maagcarcinoom en evalueerden de effecten van targeting CDH17 als mogelijke therapeutische benadering voor maagkanker.
Patiënten
De onderzoekspopulatie bestond uit 156 opeenvolgende patiënten (106 mannen en 50 vrouwen) gepland voor een operatie van 1 januari 2002 tot 31 december 2006 bij Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, China. Alle patiënten in deze studie had een histologisch bevestigde diagnose van primaire maagcarcinoom dat verder werd geanalyseerd pathologisch na de operatie. Chirurgie bestond uit subtotaal of totale gastrectomy bij alle patiënten; een gestandaardiseerde techniek werd gebruikt voor chirurgische resectie en lymfadenectomie, zoals elders beschreven [3]. Patiënten die niet-resectieve chirurgie ondergaan, en die met Siewert type I Cardia adenocarcinoom werden uitgesloten van de studie. Specimen en tumor maten werden geregistreerd door de pathologen. Representatieve delen van de tumor werden geselecteerd en snel bevroren. pTNM kwalificatie volgde de criteria van de 6e editie van de UICC [11] .De gemiddelde leeftijd van de patiënten was 57,2 jaar (uitersten: 27-78 jaar) Leeftijd, geslacht, type operatie, de tumor locatie, TNM stadium, chemotherapie, specimen lengte, tumorgrootte en histologische differentiatie, vermeld voor elke patiënt in een database. Alle patiënten die enig type chemotherapie ondergaan waren op de 5-FU, platina of taxol-based regimes. Alle patiënten, na ontslag uit het ziekenhuis, ging een follow-up-programma volgens de standaard protocol [12]. De follow-up was in april 2010. Het onderzoek werd goedgekeurd door de commissie ethiek in de Sun Yat-sen University Cancer Center gesloten, alle deelnemers ontvangen hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie.
Maagcarcinoom cellijnen AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 en SGC-7901 werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA), Japanese Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) en Beijing Medical University (Beijing, China). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Sigma) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen) en 1% penicilline-streptomycine (Invitrogen). Een muis monoklonaal antilichaam tegen CDH17 (ab54511) was vanaf Abcam (Cambridge, MA).
De pLKO.1 puro (7 kb) lentivirale construct bevat een U6 promoter en HIV-1 RNA-verpakkingssignaal met pruomycin- en ampicillin- weerstandselementen gekloneerd 3 'van de humane fosfoglyceraatkinase (PGK) promoter. Een cpptCTE werd ingevoegd 5 'van de PGK promoter. Human CDH17 shRNA constructen werden gegenereerd door ligatie van de volgende versmolten oligomeren in de unieke Agel en EcoRI plaatsen van pLKO.1 puro: CDH17 shRNA voorwaarts (5'-CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G-3 ') en achteruit (5'-AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G-3'). Lentivirale voorbereidingen werden geproduceerd door co-transfecteren pLKO.1 puro lege vector met CDH17 shRNA, en helper virus verpakking plasmiden pCMVΔR8.9 en pMG.G (bij een 10:10:01 verhouding) in 293T-cellen. Transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine en PLUS reagens (Invitrogen). Lentivirussen werden geoogst op 24, 36, 48 en 60 uur na transfectie. Twee controles werden opgezet, waarbij de maagkanker cellen ofwel kregen geen behandeling of getransfecteerd met scrambled ongerichte RNAi vector (Mock). Infectie werd uitgevoerd in de aanwezigheid van 8 ug /ml polybreen uitgevoerd. Na infectie, AGS en MKN-45 cellen werden geselecteerd op stabiele expressie van de shRNAs gebruik 2 ug /ml puromycine. Cellen werden gelyseerd voor Western blot analyse 10 dagen na de infectie.
Protein lysaten werden bereid uit cellijn monolagen middels lysis buffer (1% NP-40,50 mM Tris -HCl, pH 8,0, 100 mM natriumfluoride, 30 mM natriumpyrofosfaat, 2 mM natriummolybdaat, 5 mM EDTA, 2 mM natriumorthovanadaat) met proteaseremmers (10 mg /ml aprotinine, 10 mg /ml leupeptine, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride ). Eiwitconcentraties werden bepaald met de Bio-Rad proteïne assay (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Cellysaten werden onderworpen aan natriumdodecylsulfaat sulfacte-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en de gescheiden eiwitten werden elektroforetisch overgebracht naar Immobilon-P membranen (Millipore). Na het blokkeren van niet-vette melk, werden de membranen geïncubeerd in onafhankelijke primaire antilichamen P53 (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), Cycline D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling9), β-catenine (Zymed, 13-8400), GSK3ß (Santa Cruz, sz-7291) en p-GSK3ß (Ser9) (Cell SignaleringΥ6). Het membraan werd enkele malen gewassen in PBS met 0,1% Tween 20 en gescand in de LI-COR Odyssey Infrarood twee kleurdetectie imager systeem (LI-COR Bioscience) volgens de instructies van de fabrikant.
subcellulaire fractionaties werden uitgevoerd onder gebruikmaking specifieke cel lysis buffers en herhaalde centrifugatie stappen (kernextract kit van Active Motive, Carlsbad, CA) volgens de specificaties van de fabrikant. Celfracties werden opgelost in RIPA-buffer en de eiwitconcentratie werd gemeten met BCA proteïne assay gekwantificeerd. Eiwitextracten (20 ug) werden verder opgelost in 1 x Laemmli buffer, onderworpen aan elektroforese op een 10% SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen zoals hierboven beschreven. Western blot analyse van poly-ADP-ribose polymerase (PARP, van Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) en superoxide dismutase 2 (SOD2, van ABFrontier, Seoul, Korea) werden uitgevoerd met passende scheiding van nucleaire en cytosolische eiwitten bevestigen.
kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (QPT-PCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellijnen en ingevroren maagdarmkanker weefsels door het TRIzol reagens (Invitrogen). Reverse transcriptie van totaal RNA (2 Ag) werd uitgevoerd met behulp van een Advantage RT PCR kit (Clontech) en cDNA werd onderworpen aan PCR van 28 cycli van amplificatie met de volgende primers: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC en CHD17 Rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-actine werd gebruikt als controle.
immunohistochemie (IHC)
Totaal 156 formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde maagkanker weefselmonsters werden geselecteerd voor IHC studie. IHC-kleuring werd uitgevoerd op 5 urn weefselcoupes gerehydrateerd met gegradeerde alcoholen. Endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd met 0,3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten. Glaasjes werden magnetron behandeld in 10 mM citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 10 min. Niet-specifieke binding werd geblokkeerd met 10% normaal konijnenserum gedurende 20 min. Het weefsel glasplaatjes werden geïncubeerd met anti-CDH17 (1:50 verdunning) gedurende 60 min bij 37 ° C in een vochtige kamer. De glasplaatjes werden geïncubeerd met gebiotinyleerd konijn anti-muis immunoglobuline in een concentratie van 1:100 gedurende 30 minuten bij 37 ° C vervolgens omgezet met een streptavidine-peroxidase conjugaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C en tenslotte geïncubeerd met 3-3 'diaminobenzidine als een chromogeen substraat. Een vals positief signaal te sluiten, worden negatieve controles opgenomen in elke test door het vervangen van het primaire antilichaam met blokkerende serum. Twee onafhankelijke waarnemers blind voor de clinicopathologic informatie scoorde de dia's. De definitie van kleuring was als volgt: negatief, waarbij 0% tot minder dan 5% van de tumorcellen tonen immunoreactiviteit; zwak, 5-40% van tumorcellen toont immunoreactiviteit; positief, meer dan 40% van tumorcellen tonen immuunreactiviteit. De positieve gevallen werden verdere sub-ingedeeld in CDH17 + (immunoreactiviteit: 40-60%), CDH17 2+ (immunoreactiviteit: 60-80%) en CDH17 3+ (immunoreactiviteit: 80-100%).
de experimentele procedures voor celgroei, foci vorming, zachte agar, celmigratie, wondgenezing en celcyclus assays zijn beschreven in de Supporting Methods S1 beoordelen.
Rescue experimenten
de redding van CDH17 in shCDH17 AGS en MKN-45 cellijnen die worden beschreven in de ondersteunende methoden S1.
in vivo muismodellen van maagkanker
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van Sun Yat-sen University Cancer Center (Permit Nummer: 09-0238). Alle operatie werd uitgevoerd onder natriumpentobarbital verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. Na de verdoving, werden Naakt muizen gedood door cervicale dislocatie.
In vivo het ontstaan van tumoren werd onderzocht door tumor xenograft experimenten. Ongeveer 2 x 10 6 AGS cellen geïnfecteerd met CDH17 shRNA, controle AGS cellen geïnfecteerd met mock RNAi vector en ouderlijke AGS cellen werden s.c. in de rechter en linker achterpoten van 4 weken oude naakt muizen (30 muizen, 10 per conditie). Tumorvorming in naakt muizen werd gevolgd gedurende een 8-weekse periode. Het tumorvolume werd berekend door de formule V = 0,5 x L x W 2. [13] tumordragend muismodel. Subcutane tumoren werden geïnduceerd in naakt muizen, waarbij AGS cellen zoals hierboven vermeld. Eén week na inoculatie werden de muizen behandeld met anti-CDH17 shRNA. Elke muis ontving 100 ul van intratumorale injectionscontaining 1 × 10 9 exemplaren van CDH17 of mock lentivirus, twee keer per week voor 2 weken. Vijf muizen werden in elke groep. Tumor groei werden dagelijks gecontroleerd. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 13.0. Verschillen tussen variabelen werden beoordeeld door χ2 analyse of 2 staart Student's t-tests. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD, tenzij anders aangegeven. Overall survival (OS) en ziektevrije overleving (DFS) werden berekend door de Kaplan-Meier-methode, en de verschillen tussen de twee groepen werden vergeleken met log-rank test. Een p waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant. CDH17 wordt sterk tot expressie gebracht in gastrische carcinoomcellen en is gerelateerd aan slechte klinische uitkomst Ten eerste, onderzochten we de expressie van CDH17 in 156 maagcarcinoom exemplaren door IHC: 69 (44,3%) van de 156 gevallen waren positief, terwijl de overige 87 gevallen (55,7%) waren negatief of zwak voor CDH17 expressie (afb. 1). Het niveau van expressie was +, 2+ en 3+ respectievelijk 21 (13,5%), 20 (12,8%) en 28 (17,9%) gevallen. Deze bevindingen geven aan dat CDH17 een belangrijke rol bij maagkanker tumorgenese kunnen spelen. Vervolgens vergeleken we de klinische en pathologische kenmerken van de patiënten met en zonder CDH17 expressie. Geen statistisch significante verschillen waargenomen tussen de twee groepen met betrekking tot geslacht, leeftijd, grootte van de tumor, tumor, diepte van tumorinvasie, lymfeklieren metastase, metastasen op afstand en TNM stadium (tabel 1). Next, we onderzoek gedaan naar de mogelijke gevolgen van CDH17 status van meningsuiting op de lange termijn overleving van patiënten met univariate en multivariate analyse. Mediane follow-up was 24,3 maanden, aan het einde van de follow-up, 68 patiënten waren nog in leven, 87 patiënten was overleden van de tumor, en 1 patiënt was gestorven aan andere oorzaak; de kanker-gerelateerde 5-jaarsoverleving in de gehele reeks was 37,8%. Univariate analyses toonden een verband tussen de totale overleving en tumor site, histologische differentiatie, TNM podium en CDH17 expressie (tabel S1). In multivariate analyse, tumor (p = 0,02) histologische differentiatie (p = 0,02), TNM stadium (p < 0,001) en CDH17 expressie (p < 0,01) waren onafhankelijke prognostische factoren voor de totale overleving. Fig. 2A toont de totale overleving verschil tussen patiënten met en zonder CDH17 expressie. De mediane totale overleving was 15,9 maanden bij patiënten met CDH17 expressie in vergelijking met 26,6 maanden bij degenen CDH17 negatieve of zwakke expressie (P < 0,01), wat overeenkomt met een vermindering van 16% van de sterfte. Bovendien werd de ziekte van overleving analyse (DFS), uitgevoerd bij 131 patiënten die een R0 resectie ondergingen. Aan het einde van de follow-up, 69 (52,7%) patiënten nog leefden en 62 (47,3%) patiënten overleden terugkeer van de tumor of metastasen op afstand, multivariate analyse toonde vergelijkbare resultaten, histologische differentiatie, tumor, diepte van tumorinvasie (pT stadium), lymfe-metastase (pN stadium) waren onafhankelijke prognostische factoren voor ziektevrije overleving (gegevens niet getoond). We vonden ook dat patiënten zonder CDH17 expressie een betere prognose dan die met CDH17 expressie in tumorweefsel (figuur 2B.) (P < 0,01). Overall survival was minder bij patiënten met een hoge expressie van CDH17 (IHC 2+, 3+) dan bij patiënten met CDH17 + expressie (Fig. 2C). De mediane totale overleving van patiënten met tumoren hadden hogere CDH17 expressie was 10,9 maanden voor CDH17 3+, 21,1 maanden voor CDH17 2+, en 25,7 maanden bij degenen die aan CDH17 + expressie (p < 0,01) zijn. We evalueerden of humaan maagcarcinoom cellijnen CDH17 en dus kunnen worden gebruikt om het eiwit verder te evalueren potentiaalfunctie. Selecteerden we een panel van 6 maagcarcinoom cellijnen met verschillende metastatisch potentieel: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 en SGC-7901. CDH17 mRNA-niveau werd gemeten door qRT-PCR-analyse. Sterke expressie werd gezien in het primair en gemetastaseerd maagcarcinoom cellijn (AGS en MKN-45) (Fig. S1A). Western blots analyse bevestigde hoge CDH17 eiwitexpressie in AGS (vastgesteld op basis van een primaire tumor) en MKN-45 (metastatisch) (Fig. S1B). Samengenomen suggereren deze resultaten dat CDH17 belangrijk is voor initiatie en metastase van maagkanker; ten minste een subset van goede kwalificaties maagcarcinoom cellijnen behoudt expressie van CDH17 waardoor verdere functionele karakterisering. CDH17 knockdown induceert antitumorale effecten in vitro Vervolgens hebben we neergehaald in CDH17 maagcarcinoom cellijnen-AGS en MKN-45 met behulp van CDH17-specifieke shRNAs. De knock-down leverde > 75% reductie van zowel mRNA en eiwit niveaus (Fig 3A.). Vervolgens hebben we de beoordeling van het tumorigene en metastatische eigenschappen (proliferatie, vorming kolonie, adhesie, invasie en celcyclus) van de CDH17 deficiënte maagkanker cellen (shCDH17 cellen) in vergelijking met de mock vector-geïnfecteerde controle cellen. CDH17 shRNA gemedieerde knockdown in significant verminderde celgroei van maagcarcinoom cellijnen (P < 0,001) (figuur 3A, rechts.). Foci vorming werd ook significant geremd (P < 0,001) in shCDH17 cellen tegen Mock cellen (Figuur 3B, Links.), Een vergelijkbaar resultaat werd in zachte agar verkregen, waarbij de kolonievorming aanzienlijk shCDH17 cellen werd verminderd (P < 0,001; fig. 3B, rechts). De rol van CDH17 bij metastase werd onderzocht door wondheling en transwell assays. CDH17 knockdown kon cel mobiliteit (fig. 3C, links) verminderen, zoals bepaald door de wondproef. Transwell test is gebleken dat een verminderde uitdrukking van CDH17 aanzienlijk verlaagt celadhesie (P < 0,001) (fig. 3C, rechts). Om het mechanisme dat ten grondslag groeiremming door CDH17 knock-down te verkennen, werden de celcyclus verdeling van cellen met CDH17 shRNA hairpin en Mock bepaald door flowcytometrie: shCDH17 cellen werden gearresteerd in G0 /G1-fase, met minder cellen in G2 /M-fase (Fig . 3D). Het antitumoreffect van CDH17 knockdown werd ook gezien in de gemetastaseerd maagcarcinoom cellijn MKN-45 (fig. S2A-E). Volgens de gangbare normen die de kwaliteit en nauwkeurigheid van RNAi experimenten [14] zou verzekeren, voerden we rescue experimenten re-expressie CDH17 in AGS en MKN-45 shCDH17 cellen (Fig. S3A-B). Herstel van CDH17 expressie in AGS en MKN-45 cellen keerde de cellen aan de ouderlijke fenotype bevestigen dat de antitumorale effecten van CDH17 knockdown niet door af doelwit effecten. De redding experimenten bleek dat na het herstel van de CDH17 expressie in die twee cellijnen, de tumorgeniciteit en metastatische potentieel verhoogd tot een vergelijkbaar niveau van de ouderlijke AGS en MKN-45-cellen (Fig. S3C-F). Deze resultaten bieden sterke aanwijzingen van de oncogene rol van CDH17 in maagcarcinoom cellen. We onderzocht of CDH17 nodig is voor tumorvorming en invasieve in gastrische carcinoomcellen in een naakt muismodel. We subcutaan shCDH17, Mock en ouderlijke AGS cellen in naakt muizen. Tumoren zijn gewoonlijk macroscopisch zichtbaar in de dorsale flankeert binnen 6-8 weken cellen injectie. 1 muis van zowel de ouderlijke AGS en Mock groepen stierven tijdens de derde week na de injectie (humane eindpunten werden gebruikt). Muizen werden gedood 8 weken na injectie van tumorcellen. In de groep muizen geïnjecteerd met shCDH17 cellen, muizen 2 weergegeven zonder tumor knobbeltjes en 8 muizen vertoonden significant verminderde vorming tumor in vergelijking met muizen die zijn geïnjecteerd met cellen mock. De tumorgrootte en gewicht werden significant verminderd bij muizen geïnjecteerd met shCDH17 cellen vergeleken met muizen geïnjecteerd met mock cellen (Fig. 4A). Deze resultaten laten zien dat vermindering van CDH17 expressie aanzienlijk onderdrukken tumorvorming in vivo. Om het effect van CDH17 knockdown van primaire tumorgroei verder te karakteriseren we vervolgens onderzocht of in vivo afgifte van CDH17 shRNA toename aan kan belemmeren gevestigde tumor xenograft uit de ouderlijke AGS cellen in naakt muizen. Een week na tumor inoculatie, wanneer de tumor ongeveer 100 mm hadden bereikt 3, voerden we een intratumorale injectie van CDH17 shRNA mock vector in een dosis van 10 9 virusdeeltje /injectie op de tumorplaats. De injectie tweemaal per week toegediend, gedurende 2 weken. In de dieren geïnjecteerd met de Mock vector, de tumoren groeiden progressief in de loop van het experiment. Integendeel, intratumorale injectie van CDH17 shRNA in significant kleinere tumoren op elk tijdstip, met de uiteindelijke volumemeting (Fig. 4B). Onderzoek van de tumorcellen door CDH17 IHC toonde opmerkelijke neerwaartse regulatie van CDH17 beoogde doel in het shCDH17 behandelde cellen (P < 0,05; fig. 4B). Deze resultaten demonstreren dat in vivo downregulatie van CDH17 gastrische carcinoomcellen vermindert de tumorvorming bij muizen, hetgeen impliceert dat CDH17 een therapeutisch doelwit voor maagkanker. We ondervraagd verschillende trajecten om het moleculaire mechanisme van CDH17 knockdown-gemedieerde remming van gastrische kanker groei, proliferatie en metastase te ontdekken. We vonden verschillende leden van het Wnt /β-catenine route differentieel tot expressie tussen shCDH17 en ouderlijke cellen. β-catenine expressie, GSK-3β fosforylering en Cycline D1 expressie afgenomen; en Rb expressie verhoogd in zowel AGS en MKN-45 shCDH17 cellen. Bovendien expressie van P53, MDM2 en de sleutel celcyclus regulator p21 verhoogd CDH17-knockdown cellen. (Fig. 5A). In een TOPFlash /FOPFlash reporter luciferase assay (Fig. 5B), herstel van CDH17 in zowel AGS en MNK-45 cellen aanzienlijk verhoogd de sterkte van TCF /LEF signalen vergeleken met de shCDH17 controles. Zoals getoond door middel van immunoblot analyse detecteerden we een stijging van zowel het totale en nucleaire β-catenine eiwit na terugkeer van CDH17 in AGS en MKN-45, in vergelijking met de shCDH17 (fig. 5C) .Together deze resultaten geven aan dat CDH17 knockdown resulteert in downregulatie van de Wnt /β-catenine route bij maagkanker cellen. Dit op zijn beurt stelt CDH17 handhaaft de proliferatieve potentieel door Wnt /β-catenine signalering route. CDH17 een nieuw cadherine, de structuur verschilt van die van de klassieke cadherinen dat het N-terminale domein en het cytoplasmatische gedeelte vertoont geen significante homologie met klassieke cadherinen [6]. De biologische functie van CDH17 is nog onbekend. Talrijke studies hebben verhoogde niveaus van CDH17 gerapporteerd in verschillende menselijke kankers, het koppelen van expressie van dit eiwit prognose en geïdentificeerde risico's [10], [15]. CDH17 overexpressie gerapporteerd in adenocarcinoom [9], hepatocellulair carcinoom [16] en colorectaal carcinoom [17]. Dit geeft aan dat CDH17 cruciaal in de tumorigenese van maag- en leverkanker kan zijn. Bij mensen CDH17 normaliter uitsluitend tot expressie gebracht op het basolaterale oppervlak van hepatocyten en enterocyten. Na het eerste verslag van CDH17 als een intestinale metapasia marker door Grotzinger et al [9], hebben verschillende onderzoeken CDH17 expressie geëvalueerd bij maagkanker. CDH17 werd uitgedrukt in 50-78% van maagkanker weefsels met intestinale type overwicht [18], [19]. In de huidige studie, tonen we aan dat CDH17 is een oncogen en een aantrekkelijk therapeutisch doel bij maagkanker: CDH17 is sterk uitgedrukt in tumor weefsels, met bijna de helft van maagkanker zijn CDH17 positief door IHC. Park en medewerkers evalueerden de CDH17 expressie in meer dan 200 maagcarcinoom weefselmonsters en gerapporteerd dat het sterk tot expressie werd gebracht in eerdere TNM fase [20] Bovendien vonden zij dat een verminderde expressie van CDH17 is aangetoond dat nauw geassocieerd met tumor agressiviteit en lymfeknoop metastase van humaan maagcarcinoom [20]. Echter, andere noemen zijn expressie was veel hoger in advanced lymfeklier [18], [21]. In onze studie was er geen verband tussen CDH17 expressie en andere klinische en pathologische kenmerken. Als prognostische factor, CDH17 expressie vertoonden een tendens naar een indicator voor ongunstige overleving in verschillende patiëntenpopulaties, zelfs na correctie voor tumor stadium. In dit verband is de mediane overleving van 15,9 maanden in de groep met positieve CDH17 expressie, versus 26,6 maanden bij patiënten met IHC negatieve tumoren is een klinisch significante relatie. Bovendien een verkennende analyse toonde slechte overleving bij patiënten met hoge expressie van CDH17 eiwit (IHC 2+ en 3+) in vergelijking met patiënten met lage expressie van CDH17 eiwit (IHC +). Deze bevindingen zijn opmerkelijk gezien de slechte prognose in deze populatie. Gezamenlijk CDH17 expressie is een nuttige prognostische marker maagcarcinoom en lijkt verband te houden met tumorprogressie. De onderhavige studie toont aan dat shRNA-gemedieerde knockdown CDH17 in de zeer tumorigene maagcarcinoom cellijnen AGS en MKN-45 kan effectief te onderdrukken celgroei, verminderen vorming foci en kolonievorming in zachte agar, en invasiviteit en metastatische vermogen van maagkanker in vitro. G1-S overgangsfase is een belangrijk controlepunt voor celcyclusprogressie en p21 is een van de kritieke negatieve regulatoren tijdens deze overgang [22]. De belangrijkste celcyclus effect van CDH17 knockdown remming van G1-S-fase transitie door de activering van p21 werd bevestigd door studies blots (Fig. 5). Een recente studie in HCC cellen gevonden dat depletie van CDH17 resulteerde in de remming van invasie, groei en metastase in MHCC97H hepatocellular carcinoomcellen [16]. CDH17 is een positieve regulator voor trekkende, lijm, en invasieve gedrag. Het is denkbaar dat, in overeenstemming met N-cadherin. Bij maagkanker kan CDH17 carcinoma cel interacties mediëren met maag stroma en de bevordering van maagkanker metastase betrokken door het bevorderen carcinoom celmigratie en herstel van homofiele cel-celadhesie in metastase. Onze studies bieden nieuwe inzichten in de mogelijke rol bij maagkanker initiatie en progressie. Volgens de resultaten, CDH17 is een oncogen en een aantrekkelijk therapeutisch doel bij maagkanker. Daarom we stellen dat gericht CDH17 kan worden gebruikt om maagkanker in vivo. Muismodellen van maagkanker werden gebruikt om het effect van targeting CDH17 als potentiële behandeling valideren. Infectie van de maag-carcinoom cellen door CDH17 shRNA afgeschaft hun carcinogeniteit bij muizen. In tumor-dragende muizen, lokale levering van lentivirale gebaseerde CDH17 shRNA geremd tumorgroei, met een opvallende onderdrukking effect op tumorvorming. Deze resultaten hebben belangrijke klinische implicaties voor de behandeling van maagkanker. Momenteel is er slechts één FDA-goedgekeurde gerichte therapie voor de behandeling van een subset van maagkanker: Trastuzumab, een monoklonaal antilichaam dat interfereert met de HER2-receptor. Helaas, HER2 expressie tumoren zijn zeldzaam, kon slechts 22% maagkanker patiënten baat hebben bij deze therapie [23]. Daarentegen werd CDH17 sterk tot expressie gebracht in maagkanker in bijna 50% van de patiënten (Tabel 1) .Op dit moment standaard therapie voor maagkanker omvat chirurgie met optimale debulking van de ziekte gevolgd door chemotherapie. Desondanks, 80% van de patiënten met maagkanker te ontwikkelen recidief en slechts 20% van deze patiënten overleeft 5 jaar na diagnose [24]. Onze resultaten suggereren sterk dat maagkanker patiënten kunnen baat hebben bij gerichte therapie tegen CDH17, en garandeert de exploratie en ontwerpen van potentiële CDH17 remmers. De moleculaire mechanismen die CDH17 regelt maag kanker groei nog worden opgehelderd. Een recent rapport toonde een trans-interactie tussen E-cadherine en CDH17 in enterocyten tijdens de ontwikkeling van het darmepitheel [25], [26], wat suggereert dat CDH17 zou kruisen met de Wnt route door de samenwerking met E-cadherine en /of geassocieerde partners. Uit eerdere studies bleek dat targeting CDH17 inactiveert Wnt /β-catenine signalering in leverkanker [16]. Activatie van de Wnt /β-catenine signalering komt voor bij ongeveer 30% van maagkanker en transgene diermodellen hebben ook aangetoond dat Wnt-signalering bevordert maagkanker [27].
Statistieken
Resultaten
CDH17 uitgedrukt in menselijke maag cellijnen
CDH17 als een in vivo Doel voor maagkanker Therapy
Neerregeling van Wnt /β-catenine signalering door CDH17 knockdown
Discussie
Bacteriofagen kunnen E. coli behandelen zonder de darm te beschadigen,
Wat is de deal met hepatitis C?
Wat kan oude uitwerpselen ons vertellen over de evolutie van het menselijke darmmicrobioom?
Orgaanchiptechnologie verbetert de studie van de darm voor gepersonaliseerde geneeskunde
Mensen versus virussen - Kunnen we uitsterven in de nabije toekomst voorkomen?
Maatregelen om overdracht van SARS-CoV-2 via afvalwater in arme regio's te voorkomen
Mediterraan dieet bevordert gezond ouder worden met gezonder darmmicrobioom
Een nieuwe studie online gepubliceerd in het tijdschrift Darm in februari 2020 meldt de opvallende gezondheidsbevorderende effecten van slechts één jaar overschakelen op een mediterraan dieet. De re
Een veganistisch dieet kan darmmicroben stimuleren die helpen bij het afvallen
Door over te schakelen op een veganistisch dieet kunnen mensen elke week bijna een pond afvallen en hun risico op diabetes aanzienlijk verminderen, volgens een studie die onlangs werd gepresenteerd op
Microplastic voor het eerst ontdekt in menselijk afval
Uit een analyse van menselijke ontlastingsmonsters van deelnemers in acht landen is gebleken dat elk afzonderlijk getest monster microplastic bevatte en dat er tot negen verschillende soorten plastic