Plos ONE: ciljanje CDH17 Zavira napredovanje tumorjev želodčnega raka, ki ga Downregulating NT /beta-Catenin Signaling

Povzetek

Namen

želodčnega raka je še vedno eden od glavnih vzrokov smrti zaradi raka po vsem svetu. Bolniki običajno prisotne pozno z lokalnim invazijo ali metastaz, za katere ni na razpolago učinkovitih terapij. Po predhodnih študij, ki ugotovljenih adhezijske molekule kadherina-17 (CDH17) kot potencialni marker za raka želodca, smo izvedli proof-of-načeloma študije za razvoj racionalne terapevtskih pristopov, usmerjenih CDH17 za zdravljenje te bolezni.

Metode

Imunohistokemija smo uporabili za študij izražanja CDH17 v 156 želodčnih karcinomov, in odnos med preživetjem in CDH17 izražanja so preučevali multivariatne analize. Učinek RNA-interference posredovano rasklapanje za CDH17 o širjenju celičnih linij karcinoma želodca je bila preučena in vitro in in vivo, kot tudi vplivi na nižji stopnji signalizacijo z imuno.

Rezultati

CDH17 je dosledno navzgor regulirano v želodčnih raka pri ljudeh in celokupno preživetje pri bolnikih z CDH17 uravnavanjem je slabša kot pri tistih brez ekspresijo tega gena (5 let skupna stopnja preživetja 29,0% v primerjavi z 45,0%, P < 0,01). Funkcionalni testi pokazali, da CDH17 rasklapanje inhibira proliferacijo celic, oprijem, migracije, invazije, clonogenicity in povzroči G0 /G1 aretacijo. Pri miših, shRNA posredovano CDH17 razgradljiv močno zavira rast tumorjev; intratumorska injekcijo CDH17 shRNAs posledico pomembnih učinkov protitumornih na presajenih tumorskih modelih. Mehanizmi antitumorskih povezane z inhibicijo CDH17 vključujejo inaktivacijo NT /β-catenin signalizacijo.

Zaključek

Naši rezultati prepoznajo CDH17 kot biomarker želodčnega raka in privlačno terapevtski cilj za to agresivno malignosti.

Navedba: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zi, Wu WJ, Luo Hy, et al. (2013) Ciljanje CDH17 Zavira napredovanje tumorjev želodčnega raka, ki ga Downregulating NT /β-Catenin signalnega. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959

Urednik: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Združene države Amerike

Prejeto: 22. oktober 2012; Sprejeto: 16. januar 2013; Objavljeno: 15. marec 2013

Copyright: © 2013 Qiu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z National Natural Science Foundation (30672408 do RHX). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu. Čeprav se je incidenca raka želodca močno zmanjšala, v nekaterih razvitih državah v zadnjem desetletju, so ocenjeni skupaj milijon novih primerov, ki jih diagnosticirali vsako leto [1]. Bolniki s to boleznijo imajo običajno slabo obeti, kar predstavlja 10% smrti zaradi vseh rakavih [2]. Tudi po radikalni operaciji, več kot polovica bolnikov ponovil. Limfna sodelovanje vozlišče, globina tumorske invazije in lokacijo tumorja so bile opredeljene kot najpomembnejše clinicopathologic prognostičnih dejavnikov [3], [4].

Lokalni invazija in oddaljene metastaze pogosto pojavljajo v napredovalim karcinomom želodca. Postopek invazije in metastaz je zapletena in zahteva disregulacij različnih celičnih elementov, vključno kritičnih adhezijskih molekul. Kadherina pripada enemu izmed molekul družin adhezijskih in igra ključno vlogo pri vzpostavljanju interakcije celica-celica, [5]. Kadherina-17 (CDH17), ki se imenuje tudi jeter, črevesja (LI) kadherina ali humani peptid transporter-1 (RVP-1), ki je na strukturno edinstvena član kadherina naddružina [6] [7]. Ker imajo tako imenovane klasične cadherins, kot so E-, N- in P-kadherina, pet kadherina ponovitev znotraj zunajcelični domeni, CDH17 je sestavljen iz sedmih kadherina ponovitev. Poleg tega CDH17 ima le 20 aminokislin v citoplazemske domene, ker imajo klasični cadherins visoko ohranjenih citoplazemsko domeno, ki sestoji iz 150-160 aminokislin. CDH17 je izražena v miših in ljudje skoraj izključno v epitelnih celic tako zarodka in odraslih tankega in debelega črevesa, brez zaznavne ekspresijo v želodcu in jetrih [8].

Uporaben celostne genomske in proteomskimi pristopov imeli raziskovalci začeli identificirati nove onkogeni in tumor valov pri raku želodca. Prejšnje študije kliničnih kohorte opredeljena CDH17 kot potencialni marker bolezni za rakom želodca [9], [10]. Kljub tem večjih kliničnih ugotovitev, molekulske funkcije CDH17 ostajajo neznani, in še ni bila potrjena njena tumorogen vlogo pri karcinomu želodca. Tukaj smo želeli razčleniti na onkogeni signalne mehanizme za CDH17 v okviru želodčni karcinom in ocenili učinke ciljanje CDH17 kot potencialnega terapevtskega pristopa za raka želodca.

metod

Bolniki

populacija študije je sestavljalo 156 zaporednih bolnikov (106 moških in 50 žensk), predvidenih za operacijo od 1. januarja 2002 do 31. decembra 2006 v Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, Kitajska. Vsi pacienti vključeni v to študijo, so imeli histološko potrjeno diagnozo primarnega želodca raka, ki je bil nadalje analizirani patološko po operaciji. Operacija je sestavljalo vsot ali celotnega želodca pri vseh bolnikih; standardizirano tehniko je bila uporabljena za kirurško resekcijo in limfadenektomijo, kakor je opisano drugje [3]. Bolniki, ki so šli skozi brez resective operacijo, in tisti z vrsto Siewert sem Cardia adenokarcinom so bili izključeni iz študije. Vzorec in tumor velikosti so zabeležile patologi. Reprezentativne območja tumorja so bili izbrani in snap zmrznjeno. Razvrstitev pTNM po merilih iz 6. izdaja UICC [11] Odprta srednja starost bolnikov je bila 57,2 let (razpon: 27-78 let), starost, spol, vrsta operacijo, lokacija tumorja, stopnjo TNM, kemoterapija, vzorec dolžina, velikost tumorja in histološki diferenciacija, smo zabeležili za vsakega bolnika v podatkovno bazo. Vsi bolniki, ki so šli skozi vsako vrsto kemoterapije so na 5-FU, platina ali režimi, ki temeljijo na Taksol. Vsi bolniki, po odpustu iz bolnišnice, vstopila v nadaljevalni program po standardnem protokolu [12]. Nadaljnje ukrepanje je zaključila aprila 2010. Študija je odobril odbor za etiko v Sun Yat-sen University Cancer Center, vsi udeleženci pod svojo pisno privolitev za sodelovanje v tej študiji.

celičnih linij in CDH17
protiteles

želodcu celične linije karcinom, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 in SGC-7901 so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection (Manassas, VA), japonski Cancer Research virov Bank (Tokio, Japonska) in Peking Medical University (Peking, Kitajska). Celice smo kultivirali v RPMI 1640 medija (Sigma), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen) in 1% penicilin-streptomicin (Invitrogen). Miš monoklonsko protitelo CDH17 (ab54511) je bila od Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 kratek Ostra RNA (shRNA)

pLKO.1 puro (7 kb) lentivirusni konstrukt vsebuje U6 promotor in HIV-1 RNA embalaža signala z pruomycin- in ampicillin- elementov odpornost klonirali 3 "humanega fosfoglicerat kinaze (hPGK) promotorja. CpptCTE bil vstavljen 5 'od promotorja hPGK. Človeški konstrukti CDH17 shRNA so bili ustvarjeni z ligiranjem naslednje razbeljenem oligomerov v edinstvenih Agel in EcoRI straneh pLKO.1 Puro: CDH17 shRNA naprej (5'CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3) in nazaj (5'-AAT STS AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3). Lentivirusni pripravki so bili proizvedeni s kotransfektiranjem pLKO.1 puro prazen vektor z CDH17 shRNA in virus pomočnik pakiranje plazmidi pCMVΔR8.9 in pMG.G (v razmerju 10:10:1) v 293T celice. Transfekciji smo izvedli s pomočjo Lipofectamine in PLUS reagenta (Invitrogen). Lentiviruses so bile pridelane na 24, 36, 48 in 60 ur po transfekciji. Dve napravi sta bili ustanovljeni, v katerem so želodčne rakave celice bodisi prejela nobenega zdravljenja, ali so transfekciji s umešana RNAi vektorsko nenamenska (Mock). Okužbe je bila izvedena v prisotnosti 8 ug /ml polybrene. Po okužbe, AGS in MKN-45 celice so bili izbrani za stabilno izražanje shRNAs z uporabo 2 mg /ml puromicina. Celice smo lizirali zahodnega analizo blot 10 dni po infekciji.

imunoblot in subceličnih frakcionirno

Beljakovinski lizate smo pripravili iz celica linij monosloje uporabo razpada blažilnika (1% NP-40,50 mM Tris -HCl, pH 8,0, 100 mM natrijev fluorid, 30 mM natrijev pirofosfat, 2 mM natrijevega molibdata, 5 mM EDTA, 2 mM natrijevega ortovanadata), ki vsebuje proteaznih inhibitorjev (10 mg /ml aprotinina, 10 mg /ml leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid ). Koncentracije proteinske smo določili z uporabo testa protein Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Celični lizati bili podvrženi natrijev dodecil sulfacte-poliakrilamidno gelsko elektroforezo (SDS-PAGE) in ločene proteine ​​smo elektroforetsko prenesena Immobilon-P membrano (Millipore). Po blokirati z mlekom brez maščobe, smo membrane inkubirali neodvisno v primarnem protitelesa P53 (Cell signalizacijaΠ2), Mdm2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), ciklin D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell signalizacija΢9), β-Catenin (Zymed, 13-8400), GSK3P (santa Cruz, sz-7291) in p-GSK3P (Ser9) (Cell SignalizacijaΥ6). Membrana je bila večkrat sprali v PBS z 0,1% Tween20 in skenirane v LI-COR Odyssey infrardečo dvobarvni tipala za zaznavanje sistema (LI-COR biološke znanosti), v skladu z navodili proizvajalca.

subceličnih fractionations smo izvedli s pomočjo posebne razpad celic blažilniki in ponavljajoče centrifugiranjem koraki (Nuclear izvleček komplet iz aktivnega Motive, Carlsbad, CA), v skladu z navodili proizvajalca. Celične frakcije smo raztopili v RIPA pufra in koncentracijo proteina smo merili z BCA protein količinsko testom. Proteinske ekstrakte (20 ug) smo nadalje raztopimo v 1 x pufru Laemmli, podvržemo elektroforezi na 10% SDS-PAGE in prenesli na nitrocelulozne membrane, kot je opisano zgoraj. smo izvedli Western blot analizo poli-ADP-riboze polimeraze (PARP od signalizacijo med celicami Technology Inc, Beverly, MA) in superoksid dismutazo 2 (SOD2, od ABFrontier, Seoul, Koreja) za potrditev ustreznega ločitev jedrskih in citosolnih proteinov.

Kvantitativna reverzno transkripcijo-PCR (qPT-PCR)

Total RNA je bila vzeta iz celičnih linij in zamrznjene adenokarcinomom želodca tkiv s strani TRIzola reagenta (Invitrogen). Reverzna transkripcija celotne RNA (2 Ag) je bila opravljena z uporabo Prednost RT za komplet PCR (Clontech), in cDNA podvrgli PCR 28 ciklov pomnoževanja z naslednjimi primerji: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC in CHD17 RV, 5 "-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-aktina smo uporabili kot kontrolo.

Imunohistokemija (IHC)

skupno 156 formalina fiksno in vzorce tkiva raka želodca-parafin vgrajeni so bili za IHC študij izbrali. IHK obarvanje smo izvedli na odsekih tkiva 5-mikrometrskimi hidracijo skozi razvrščenih alkoholov. Endogene peroksidaze aktivnost smo blokirali z 0,3% vodikovega peroksida 15 minut. Ploščice smo mikrovalovna obdelamo v 10 mM citrat (pH 6,0) za 10 minut. Nespecifično vezavo smo blokirali z 10% normalnega kunčjega seruma 20 min. Drsniki tkiva inkubiramo z anti-CDH17 (01:50 redčenje) za 60 minut pri 37 ° C v vlažni komori. Drsniki inkubiramo z biotiniranimi zajcev proti mišjim imunoglobulina pri koncentraciji 1:100 30 minut pri 37 ° C, nato reagiramo s streptavidinom-peroksidazo konjugata 30 minut pri 37 ° C in končno inkubirana z diaminobenzidine 3-3 'kot kromogena substrat. Da bi izključili lažno pozitiven signal, so bile negativne kontrole vključeni v vseh testih, ki ga zamenjavi primarnega protitelesa z blokado seruma. Dve neodvisni opazovalci zaslepljeni z clinicopathologic informacije dosegel diapozitive. Opredelitev obarvanja je bila naslednja: negativna, 0% do manj kot 5% tumorskih celic, ki kažejo radioinkorporacijo; šibka, 5-40% tumorskih celic, ki kažejo radioinkorporacijo; pozitiven, več kot 40% tumorskih celic, ki kažejo radioinkorporacijo. Pozitivni primeri so, Dodatne razvrščajo v CDH17 + (radioinkorporacijo: 40-60%), CDH17 2+ (radioinkorporacijo: 60-80%) in CDH17 3+ (radioinkorporacijo: 80-100%).

V vitro testi za oceno tumorja fenotip

eksperimentalni postopki za rast celic, nastanek žarišč, mehki agar, migracije celic, celjenje ran in testi celičnega ciklusa, so opisani v spremnem Metode S1.

Reševalne poskusi

reševanje CDH17 v shCDH17 letnem pregledu rasti in MKN-45 celičnih linijah, so opisani v spremnem Metode S1.

in vivo modelih miši raka želodca

Ta študija je bila izvedena v strogo v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali iz National Institutes of Health. Protokol je odobril Odbor za etiko o poskusih na živalih v Sun Yat-sen University Cancer Center (številka dovoljenja: 09-0238). Vse operacija je bila izvedena v skladu z natrijevim pentobarbital anesteziji, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Po anesteziji, so Nude miši žrtvovali s cervikalno dislokacijo.

nastanek tumorjev pri golih miših.

In vivo tumorigeneze je preiskovala tumor ksenotransplantskih poskusov. Približno 2 x 10 ^{6 AGS celice, okužene z CDH17 shRNA, nadzor AGS celice, okužene z modelnim RNAi vektorja in starševskih AGS celic smo injicirali subkutano v levo in desno zadnjih nog 4 tednov starega golih miši (30 miši, 10 na stanju). nastanek tumorjev pri golih miših smo spremljali preko obdobju 8 tednov. Volumen tumorja smo izračunali s formulo V = 0,5 x L x W 2. [13]}

Tumor, ki nosijo modela miši.

podkožne tumorje so bile povzročene v golih miših z AGS celice kot zgoraj omenjene. En teden po okužbi, smo miši obdelali z anti-CDH17 shRNA. Vsaka miš dobi 100 ml za intratumorska injectionscontaining 1 × 10 ^{9 kopij CDH17 ali modelnim lentivirusom, dvakrat na teden 2 tedna. Pet miši so bile uporabljene v vsaki skupini. rast tumorja so dnevno spremljali.}

STATISTIKA

Statistične analize so bile izvedene s pomočjo SPSS 13.0. Razlike med spremenljivkami so bili ocenjeni s χ2 analizi ali t testih 2-tailed študenta. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD, če ni navedeno drugače. Celokupno preživetje (OS) in preživetje brez bolezni (DFS) krivulje smo izračunali po metodi Kaplan-Meier, in razlike med obema skupinama smo primerjali s testom log-ranga. Vrednost p manj kot 0,05 smo upoštevali kot statistično značilne.

Rezultati

CDH17 je zelo izražena v želodčnih celic karcinoma in je povezana s slabo klinični izid

Najprej, smo pregledali nivoja izražanja CDH17 v 156 želodčnega karcinoma osebkov po IHC: 69 (44,3%), od tega so 156 primerov pozitivna, medtem ko preostalih 87 primerih (55,7%) so bili negativni ali šibka CDH17 izražanja (slika 1).. Nivo izražanja je bila + 2+ in 3+ pri 21 (13,5%), 20 (12,8%) in 28 (17,9%) primerov oz. Te ugotovitve kažejo, da lahko CDH17 igrajo pomembno vlogo pri želodčnem tumorigeneze raka. Nato smo primerjali klinične in patološke značilnosti bolnikov z in brez CDH17 izražanja. Med obema skupinama niso opazili statistično pomembne razlike glede na spol, starost, velikost tumorja, tumorja mestu, globine tumorske invazije, bezgavk metastaze, oddaljenih metastaz in stopnji TNM (tabela 1).

Nato smo raziskovali potencialni vpliv statusa izražanja CDH17 na dolgoročno preživetje bolnikov z univariantne in multivariatne analize. Mediano spremljanje je bila 24,3 mesecev, na koncu spremljanja je bilo 68 bolnikov še vedno živ, 87 bolnikov je umrl zaradi tumorja, in 1 bolnik je umrl zaradi drugega razloga; 5-letna stopnja preživetja, povezanih z rakom v celotni seriji je bil 37,8%. Univariatne analize so pokazale povezavo med celokupno preživetje in mesto tumorja, histoloških razlik, stadij TNM in CDH17 izražanja (tabela S1). V analizah multivariatne, tumor mesto (p = 0,02) histološke diferenciacija (p = 0,02), stopnja TNM (p < 0,001), so neodvisni napovedni dejavniki za celotno preživetje in CDH17 izraz (0.01 p <). Fig. 2A prikazuje skupno razliko v preživetju bolnikov z in brez CDH17 izražanja. Mediana celokupnega preživetja je bila 15,9 meseca pri bolnikih z CDH17 izražanja v primerjavi z 26,6 meseca pri tistih CDH17 negativno ali šibko izražanje (P < 0,01), kar ustreza zmanjšanju za 16% smrtnost. Poleg tega je bilo preživetje brez bolezni analiza (DFS) je leta 131 bolnikih, ki so kurativna R0 resekcijo. Na koncu spremljanja je bilo 69 (52,7%) bolnikov še vedno živ in 62 (47,3%) bolnikov je umrl tumorja ponovitve ali oddaljenih metastaz, multivariatne analize so pokazale podobne rezultate, histološki diferenciacijo tumorja mesto, globine tumorske invazije (faza pT), limfna vozlišča metastaze (faza pN) so neodvisni napovedni dejavniki za preživetje brez bolezni (podatki niso prikazani). Prav tako smo ugotovili, da imajo pacienti brez CDH17 izražanja boljšo prognozo kot tisti s CDH17 izražanja v tumorskem tkivu (slika 2B). (P < 0,01). Celokupnega preživetja je bila zmanjšana pri bolnikih z visokim izražanja CDH17 (IHC 2+, 3+) kot pri bolnikih z CDH17 + izražanja (sl. 2C). Mediana celokupnega preživetja bolnikov s tumorji z višjo CDH17 izraz je bil 10,9 meseca za CDH17 3+, 21,1 mesecev za CDH17 2+, in 25,7 meseca pri tistih dodeljena biti CDH17 + izraz (p < 0,01).

CDH17 izražena v človeške želodčne celičnih linijah

smo ovrednotili, ali človeške celične linije karcinom želodca izražajo CDH17, zato se lahko uporablja za dodatno oceniti potencial Funkcija ta protein. Izbrali smo ploščo 6 želodčnih linij karcinom celic z različnimi metastatskega potenciala: AGS, podjetja MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 in SGC-7901. Stopnja CDH17 mRNA smo merili z analizo QRT-PCR. Močan izraz je bila opažena v primarnem in metastatskega želodčnega karcinoma celične linije (AGS in MKN-45) (sl. S1A). Western analiza blots potrdili veliko beljakovin izraz CDH17 v letnem pregledu rasti (sedež iz primarnega tumorja) in MKN-45 (metastatskega) (Sl. S1B).

Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da je CDH17 pomembna za začetek in metastaz raka želodca; vsaj podmnožica dobro poverilnice, želodca karcinom celičnih linijah ohranja izraz CDH17 omogoča nadaljnje funkcionalnih značilnosti.

CDH17 rasklapanje inducira anti-tumorske učinke in vitro

Naprej, smo podrli CDH17 v karcinom želodca celične linije-AGS in MKN-45 z uporabo CDH17 specifične shRNAs. Rasklapanje prinesla > 75% zmanjšanje tako mRNA in koncentracije proteina (slika 3A.). Nato smo ocenili na tumorogene in metastaznih lastnosti (orožja, nastajanja kolonija, oprijemljivost, invazijo in celični cikel) o pomanjkanjem želodčne rakavih celic CDH17 (shCDH17 celic) v primerjavi z modelnimi kontrolnih celicah vektorskih okuženih.

CDH17 shRNA pogojenega rasklapanje signifikantno nižjo rast celic celičnih linij karcinoma želodca (P < 0,001) (slika 3A, desno.). Poudarki formacija je tudi pomembno zavirala (P < 0,001) shCDH17 celic v primerjavi z modelnim celic (slika 3B, levo.), Podoben rezultat je bilo pridobljeno iz mehkega agarja, v katerem je bil nastanek kolonije bistveno zmanjšane shCDH17 celic (P < 0,001;. Slika 3B, desno). Vloga CDH17 metastaz so preučevali rane, zdravilnih in transwell testov. CDH17 rasklapanje je uspelo zmanjšati mobilnost celic (sl. 3C, levo), kot je določeno s testom rane. Transwell testa so pokazali, da zmanjšana ekspresija CDH17 občutno zmanjša celično adhezijo (P < 0,001) (sl. 3C, desno). Raziskati mehanizem, ki je podlaga inhibicijo rasti s CDH17 rasklapanje, so razdelitve celičnega cikla celic z CDH17 shRNA Ostra in Mock določi citometrije pretoka: shCDH17 celice so bili aretirani v G0 /G1 fazi, z manj celic v G2 /M fazi (slika . 3D). Protitumorsko učinek CDH17 rasklapanje so opazili tudi v metastatskim želodčni rak celične linije MKN-45 (sl. S2A-E). V skladu s sprejetimi standardi, ki bi zavarujejo kakovost in natančnost RNAi poskusov [14], smo izvedli reševanje poskusi ponovno izraža CDH17 v letnem pregledu rasti in MKN-45 shCDH17 celice (Slika. S3A-B). Obnova CDH17 izražanja v letnem pregledu rasti in MKN-45 celice vrnil celice s starševsko fenotip, ki potrjuje, da so učinki anti-tumor CDH17 rasklapanje niso bile posledica enkratnih ciljnih učinkov. Reševalne poskusi so pokazali, da po obnovi CDH17 izražanja v teh dveh celičnih linij, tumorogenosti in metastatskega potenciala povečala na podobni ravni starševskih AGS in MKN-45 celic (sl. S3C-F). Ti rezultati zagotavljajo trdne dokaze o onkogenih vlog CDH17 v želodčnih celic karcinoma.

CDH17 kot vivo Target za želodca Cancer Therapy

preučiti smo, ali je CDH17 potrebna za nastanek tumorjev in invazivnosti v želodčnih karcinoma celice v golih modelu miši. Mi subkutano shCDH17, lažna in starševske AGS celice v golih miših. Tumorji so običajno vidni z mikroskopom na hrbtni bokov v 6 do 8 tednov čas injiciranja celic. 1 miške iz obeh starševskih AGS in se norčujejo iz skupine umrl v tretjem tednu po (so uporabili humane končne točke) vbrizgavanje. Miši ubili 8 tednov po injekciji tumorskih celic. V skupini miši vbrizgali shCDH17 celic, 2 miši ni imel nobene tumorja vozliča in 8 miši so pokazali veliko nastanek zmanjšano tumorjev v primerjavi z mišmi vbrizgali z modelnimi celicami. velikost tumorja in teže so bili znatno zmanjšani pri miših, injiciranih s shCDH17 celic v primerjavi z mišmi vbrizgali z modelnimi celicami (sl. 4A). Ti rezultati kažejo, da zmanjšanje CDH17 izražanja lahko bistveno zavre tumorjev in vivo.

Da bi še dodatno oceniti učinek CDH17 rasklapanje na primarnem rast tumorja, smo nato preučila, ali bi lahko in vivo dostava CDH17 shRNA ovirajo rast ustanovljena tumor ksenogenskega od starševskih AGS celic v golih miših. En teden po tumorskem okužbi, ko je tumor dosegel približno 100 mm ^{3, smo izvedli intratumorska injekcijo CDH17 shRNA ali modelnega vektorja v odmerku 10 9 virusnih delcev /injiciranjem na mestu tumorja. Injekcijo je dvakrat na teden, 2 tedna. Pri živalih vbrizgali z modelnim vektorjem, tumorji med eksperimentom postopoma rasla. Nasprotno, intratumorska injekcija CDH17 shRNA signifikantno manjše tumorje na vsaki časovni točki, vključno z merjenjem končne prostornine (sl. 4B). Pregled tumorskih celic z CDH17 IHC dokazali izjemen navzdol ureditev zastavljeni cilj CDH17 v shCDH17 obdelanih celic (P < 0,05;. Slika 4b). Ti rezultati kažejo, da vivo downregulation za CDH17 v želodčnih celic karcinoma zmanjša nastanek tumorjev pri miših, kar pomeni, da je CDH17 terapevtski cilj za raka želodca.}

Dol-regulacijo NT /β-catenin signalizacijo, ki ga CDH17 rasklapanje

zaslišali smo več poti, da bi odkrili molekularni mehanizem CDH17 rasklapanje posredovano zaviranje rasti želodčnega raka, orožja in metastaz. Našli smo več članov NT /β-catenin poti, ki se različno izražena med shCDH17 in starševskih celic. β-catenin izraz, GSK-3β fosforilacija in ciklin D1 izraz zmanjšalo; in Rb izraz povečal tako v letnem pregledu rasti in MKN-45 shCDH17 celic. Poleg tega izražanje p53, Mdm2 in ključno celičnega ciklusa regulator p21 povečala v CDH17-razgradljiv celic. (Sl. 5A). V TOPFlash /FOPFlash novinar luciferazni test (sl. 5b), obnova CDH17 tako v letnem pregledu rasti in MNK-45 celic znatno povečala moč TCF /lef signale v primerjavi s kontrolami shCDH17. Poleg tega, kot je razvidno s pomočjo analize imunoblot, smo zaznali povečanje tako skupnega in jedrski β-catenin proteina po obnovi CDH17 v letnem pregledu rasti in MKN-45, v primerjavi s shCDH17 (sl. 5C) .Together, ti rezultati kažejo, da CDH17 rasklapanje rezultate downregulation na NT /β-catenin poti v želodcu rakavih celic. To pa, kaže, da CDH17 ohranja proliferativni potencial prek NT /β-catenin poti, v signalizacijo.

Pogovor

CDH17 je roman kadherina, njena struktura pa drugačne od tistih klasičnih cadherins s tem, da N-terminalne domene in citoplazemskega odsek prikazuje ni bistveno homologijo do klasičnih cadherins [6]. Biološki funkcija CDH17 še ni znan. Številne študije so poročali o povišani ravni CDH17 v različnih oblikah raka, ki povezuje izraz tega proteina prognoze in tveganja Niso definirani [10], [15]. CDH17 overexpression so poročali pri adenokarcinomom želodca [9], karcinomom jetrnih celic [16] in kolorektalnega raka [17]. To pomeni, da lahko CDH17 ključnega pomena v tumorigeneze raka želodca in jeter.

Pri ljudeh se CDH17 običajno izražajo izključno na basolateral površini hepatocitov in enterocitih. Po prvem poročilu CDH17 kot črevesne metapasia označevalca, ki ga Grötzinger et al [9], so številne raziskave ocenili CDH17 izražanje pri raku želodca. CDH17 je bila izražena v 50-78% želodca rakavih tkiv s črevesno tipa prevladujejo [18], [19]. V tej raziskavi smo dokazati, da je CDH17 onkogena in privlačen Terapevtski cilj pri raku želodca: CDH17 je zelo izražena v tumorskih tkivih, s skoraj polovico želodca raka čemer CDH17 pozitivna z imunohistokemijo. Park in sodelavci ocenili CDH17 izraz v več kot 200 želodca vzorcev karcinom tkiva, in so poročali, da se je zelo izražena v zgodnjih fazah TNM [20] Poleg tega so ugotovili, da je bilo dokazano, zmanjšano izražanje CDH17 biti tesno povezana z tumorja agresivnostjo in bezgavka metastaze želodčnega raka prehrano [20]. Vendar, drugi pa so poročali, da je bil njen izraz precej višji v naprednih bezgavkah metastaze [18], [21]. V naši raziskavi je bilo med CDH17 izražanja in drugih clinicopathological funkcije ni nobene povezave.

Kot prognostični dejavnik, CDH17 izraz pokazala težnjo kazalec neugodnega preživetje v več skupin bolnikov, tudi po nadzorovanju za stopnjo tumorja. V zvezi s tem je mediana celokupnega preživetja 15,9 meseca v skupini s pozitivnim CDH17 izražanja, v primerjavi z 26,6 meseca pri bolnikih z IHC negativnimi tumorji pomeni klinično pomembno razmerje. Poleg tega je raziskovalna analiza pokazala slabo celokupno preživetje pri bolnikih z visoko ekspresijo CDH17 proteina (IHC 2+ in 3+) v primerjavi z bolniki z nizko izražanje CDH17 proteina (IHC +). Te ugotovitve so omeniti, glede na slabo prognozo pri tej populaciji. Kolektivno, CDH17 izraz je koristen prognostični dvojno podajo pri karcinomu želodca in se zdi, da so povezani z napredovanja tumorja.

Ta študija kaže, da shRNA posredovano CDH17 rasklapanje v zelo tumorogenih želodca linije AGS karcinom celic in MKN-45 lahko učinkovito zaviranje rasti celic, zmanjša nastanek žarišč in tvorbo kolonije v mehkem agarju, pa tudi invazivnosti in metastatskega sposobnost raka želodca in vitro. G1-S fazni prehod je glavna kontrolna točka za razvoj celičnega cikla in p21 je eden od ključnih negativnih regulatorji pri tem prehodu [22]. Učinek Glavni celični cikel CDH17 rasklapanje zaviranje G1-S faznega prehoda skozi aktivacijo p21 je bil potrjen v blots študije (Sl. 5). Nedavna študija v HCC celicah ugotovili, da izčrpavanje CDH17 povzročila inhibicijo invazije, rasti in metastaz v MHCC97H hepatocelularnim karcinomom celic [16]. CDH17 je pozitiven regulator za selitvene, lepila in invazivne vedenje. Možno je, da, v skladu z N-kadherina. Pri raku želodca, lahko CDH17 posreduje interakcijo karcinomom z želodčno strome in sodelovati pri spodbujanju želodca metastaz raka, ki ga olajšali prehod karcinomom in ponovni vzpostavitvi oprijem homophilic celica-celica v metastaz. Naše raziskave zagotoviti nove vpogled v potencialne vloge, želodca nastanek in napredovanje raka. Po rezultatih, CDH17 je onkogena in privlačen terapevtski tarča raka želodca.

Zato smo domnevajo, da se ciljanje CDH17 lahko uporabljajo za zdravljenje raka na želodcu in vivo. Mouse modeli raka želodca so bile uporabljene za potrditev učinka ciljnih CDH17 kot morebitnega zdravljenja. Okužba želodca celic karcinoma po CDH17 shRNA odpravijo svoje karcinogenosti pri miših. Pri tumor prenašujočih miših, lokalna dostava lentivirusni temelji CDH17 shRNA inhibira rast tumorjev, ki kažejo izrazit vpliv dušenje na nastanek tumorja. Te ugotovitve imajo pomembne klinične posledice za zdravljenje raka želodca. Trenutno obstaja samo ena FDA odobrila usmerjena terapija za zdravljenje podskupini raka želodca: trastuzumab, ki je monoklonsko protitelo, ki pride v stik s receptorjem HER2. Na žalost, HER2 izražajo tumorji so redki, lahko le 22% želodčnega raka koristi od tega zdravljenja [23]. V nasprotju s tem je CDH17 zelo izražene v raka želodca v skoraj 50% bolnikov (tabela 1) .Zdaj, standardna terapija za raka želodca vključuje kirurški poseg z optimalno odstranitvenem bolezni sledi citotoksična terapija. Kljub tem prizadevanjem, 80% bolnikov, ki so zboleli za rakom želodca razvoj ponovitve bolezni, in le 20% teh bolnikov preživi 5 let po diagnozi [24]. Naši rezultati nakazujejo, da lahko bolniki z rakom želodca koristi od ciljnega zdravljenja proti CDH17 in jamstva za raziskovanje in oblikovanje potencialnih inhibitorjev CDH17.

molekularne mehanizme, s katerimi CDH17 ureja rast raka želodca je treba še pojasniti. V nedavnem poročilu je pokazala trans-interakcijo med E-kadherina in CDH17 v enterocitih pri razvoju črevesnega epitela [25], [26], kar kaže, da bi CDH17 sekajo z NT poti preko svojega sodelovanju z E-kadherina in /ali povezan partnerji. Predhodne raziskave so pokazale, da je ciljanje CDH17 inaktivira NT /β-catenin signalizacijo v karcinomom jetrnih celic [16]. Aktiviranje /β-catenin signalizacijo NT najdemo v približno 30% raka želodca in transgene živalski modeli so prav tako pokazali, da NT signalizacijo spodbuja želodčne karcinogenezo [27].

• Plos ONE: Caveolin-1 Izražanje ravni v raka pridruženih fibroblastov napoveduje izid želodčnega raka
• Plos ONE: Faza II študija Vrednotenje 2 shemah odmerjanja peroralnega Foretinib (GSK1363089), cMet /VEGFR2 Inhibitor, pri bolnikih z metastatskim Rak želodca