PLOS ONE: Inriktning CDH17 Dämpar tumörprogression i ventrikelcancer genom nedreglering Wnt /β-catenin Signaling

Abstrakt

Syfte

Gastric cancer förblir en av de främsta orsakerna till cancerdöd världen. Patienterna brukar vistas sent med lokal invasion eller metastaser, för vilka det finns inga effektiva behandlingar tillgängliga. Efter tidigare studier som identifierade adhesionsmolekylen cadherin-17 (CDH17) som en potentiell markör för magcancer, utförde vi proof-of-principle studier för att utveckla rationella behandlingsmetoder inriktade CDH17 för behandling av denna sjukdom.

Metoder

Immunohistokemi användes för att studera uttrycket av CDH17 i 156 gastriska karcinom, och förhållandet mellan överlevnad och CDH17 expression studerades genom multivariata analyser. Effekten av RNA-interferens-medierad knockdown av CDH17 om spridning av magcancer cellinjer undersöktes in vitro och in vivo, liksom effekterna på nedströms signalering av immunoblotting.

Resultat

CDH17 var genomgående uppreglerat i mänskliga gastric cancer, och total överlevnad hos patienter med CDH17 uppreglering var sämre än i de utan uttryck av denna gen (5 år totala överlevnaden 29,0% jämfört med 45,0%, P < 0,01). Funktionella analyser visade att CDH17 knockdown hämmade celltillväxt, adhesion, migration, invasion, klonogenicitet och inducerar G0 /G1 gripande. Hos möss, shRNA-medierad CDH17 knockdown hämmar markant tumörtillväxt; intratumoral injektion av CDH17 shRNAs resulterar i signifikanta antitumöreffekter på transplanterade tumörmodeller. Antitumör mekanismerna bakom CDH17 hämning innebär inaktivering av Wnt /β-catenin signalering.

Slutsats

Våra resultat identifierar CDH17 som en biomarkör för magsäckscancer och attraktiv terapeutiskt mål för denna aggressiva malignitet.

Citation: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Targeting CDH17 Dämpar tumörprogression i ventrikelcancer genom nedreglering Wnt /β-catenin Signaling. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10.1371 /journal.pone.0056959

Redaktör: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Mottagna: 22 october 2012, Accepteras: 16 januari 2013, Publicerad: 15 mars 2013

Copyright: © 2013 Qiu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation (30672408 till RHX). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den fjärde vanligaste dödsorsaken i cancer i världen. Även om förekomsten av magsäckscancer har minskat dramatiskt i vissa utvecklade länder under det senaste decenniet, är totalt en miljon nya fall beräknas vara diagnostiseras varje år [1]. Patienter med denna sjukdom har vanligen en dålig utsikter, som står för 10% av det totala antalet dödsfall [2] cancer. Även efter radikal kirurgi, mer än hälften av patienterna återkommer. Lymfknutor, djup av tumörinvasion och tumör plats har identifierats som de viktigaste clinicopathologic prognostiska faktorer [3], [4].

lokal invasion och fjärrmetastaser är vanligt förekommande i avancerad magsäckscancer. Processen för invasion och metastas är komplex och kräver att dysreglering av en mängd olika cellulära element inklusive kritiska adhesionsmolekyler. Cadherin tillhör en av molekylen familjer vidhäftnings och spelar en avgörande roll för att skapa cell-cellinteraktion [5]. Cadherin-17 (CDH17), som också kallas lever-tarm (LI) cadherin eller humant peptidtransportör-en (HPT-1), är en strukturellt unik medlem av cadherin superfamiljen [6], [7]. Medan de så kallade klassiska cadheriner, såsom E-, N- och P-cadherin, har fem cadherin upprepningar inom den extracellulära domänen, CDH17 består av sju cadherin upprepningar. Dessutom har CDH17 endast 20 aminosyror i den cytoplasmiska domänen, medan klassiska cadheriner har en högt konserverad cytoplasmatisk domän som består av 150-160 aminosyror. CDH17 uttrycks i möss och människor nästan uteslutande i epitelceller i både embryonala och vuxna tunntarm och kolon, med ingen detekterbar expression i magen och levern [8].

Använda integrativa genomiska och proteomik metoder har forskare börjat identifiera nya onkogener och tumörsuppressorer i magcancer. Tidigare studier av kliniska kohorter identifierade CDH17 som en potentiell sjukdomsmarkör för magkarcinom [9], [10]. Trots dessa betydande kliniska fynd, de molekylära funktioner CDH17 fortfarande okända, och dess tumörframkallande roll i magcancer har ännu inte bekräftats. Här syftar vi att dissekera de onkogena signalmekanismer CDH17 i magsäckscancer sammanhang och utvärderat effekterna av inriktning CDH17 som ett potentiellt terapeutiskt tillvägagångssätt för magcancer.

Metoder

Patienter

studie~~POS=TRUNC populationen~~POS=HEADCOMP bestod av 156 konsekutiva patienter (106 män och 50 kvinnor) planeras för operation från 1 januari 2002 till 31 december 2006 Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, Kina. Alla patienter som ingick i studien hade en histologiskt bekräftad diagnos av primär magkarcinom som ytterligare analyserades patologiskt efter operationen. Kirurgi bestod av delsumman eller total gastrektomi i alla patienter; en standardiserad teknik användes för kirurgisk resektion och lymfkörtlar, såsom beskrivits på annat håll [3]. Patienter som genomgick icke-resektiv kirurgi, och de med Siewert typ I övre magmunnen adenokarcinom uteslöts från studien. Prov och tumörstorlekar registrerades av patologer. Representativa områden av tumören valdes och snap-frysta. pTNM klassificering följt kriterierna i 6: e upplagan av UICC [11] .Det Medianåldern för patienterna var 57,2 år (intervall: 27-78 år) ålder, kön, typ av kirurgi, tumörplacering, TNM stadium, kemoterapi, prov längd, tumörstorlek, och histologisk differentiering, registrerades för varje patient i en databas. Alla patienter som genomgick någon typ av kemoterapi var på 5-FU, platina eller taxol-baserade behandlingsregimer. Alla patienter, efter utskrivningen från sjukhuset, in i en uppföljningsprogram enligt standardprotokoll [12]. Uppföljningen avslutades i april 2010. Studien godkändes av den etiska kommittén i Sun Yat-sen universitetet Cancer Center, alla deltagare om deras skriftligt informerat samtycke att delta i denna studie.

cellinjer och CDH17 antikropp

magkarcinom cellinjer, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 och SGC-7901 erhölls från American Type Culture Collection (Manassas, VA), japanska Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) och Beijing Medical University (Beijing, Kina). Celler odlades i RPMI 1640-medium (Sigma), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Invitrogen) och 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). En mus monoklonal antikropp till CDH17 (ab54511) var från Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 kort hårnål RNA (shRNA) Review

pLKO.1 puro (7 kb) Lentiviral konstruktionen innehåller en U6 promotor och HIV-1-RNA-packningssignalen med pruomycin- och ampicillin- motståndselement klonas 3 'om den humana fosfoglyceratkinas (hPGK) promotor. En cpptCTE infördes 5 'om hPGK promotorn. Human CDH17 shRNA konstruktioner genererades genom att ligera följande glödgade oligomererna i de unika Agel och EcoRI-ställena hos pLKO.1 puro: CDH17 shRNA framåt (5'CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3 ') och omvända (5'AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G-3'). Lentivirala preparat framställdes genom att samtransfektera pLKO.1 puro tom vektor med CDH17 shRNA, och hjälpare virus förpackningar plasmider pCMVΔR8.9 och pMG.G (vid en 10:10:01 förhållande) i 293T-celler. Transfektion utfördes med användning av lipofektamin och PLUS-reagens (Invitrogen). Lentivirus skördades vid 24, 36, 48 och 60 h efter transfektion. Två kontroller sattes upp, där gastric cancerceller antingen inte fick någon behandling, eller transfekterades med kodat icke öron RNAi vektorn (Mock). Infektion utfördes i närvaro av 8 pg /ml polybren. Efter infektion, AGS och MKN-45-celler selekterades för stabil expression av de shRNAs som använder 2 mikrogram /ml puromycin. Cellerna lyserades för Western blot-analys 10 dagar efter infektion.

Immunoblotting och subcellulär fraktione

Protein lysat framställdes från cellinje-monoskikt med användning av lysbuffert (1% NP-40,50 mM Tris HCl, pH 8,0, 100 mM natriumfluorid, 30 mM natriumpyrofosfat, 2 mM natriummolybdat, 5 mM EDTA, 2 mM natriumortovanadat) innehållande proteasinhibitorer (10 mg /ml aprotinin, 10 mg /ml leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid ). Proteinkoncentrationer bestämdes med användning av Bio-Rad proteinanalys (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA). Cellysat utsattes för natriumdodecyl-sulfacte-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), och de separerade proteinerna överfördes elektro till Immobilon-P-membran (Millipore). Efter blockering av fettfri mjölk, inkuberades membranen oberoende i primärantikroppar P53 (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), cyklin D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signa΢9), β-catenin (Zymed, 13-8400), GSK3P (Santa Cruz, sz-7291) och p-GSK3P (Ser9) (Cell SignalingΥ6). Membranet tvättades flera gånger i PBS med 0,1% Tween 20 och skannas i LI-COR Odyssey infraröd tvåfärgad detekterings imager system (LI-COR Bioscience) i enlighet med tillverkarens instruktioner.

Subcellulära fraktioneringar utfördes med användning av specifika cell lys buffertar och upprepade centrifugeringssteg (Nukleärt extrakt kit från Active Motive, Carlsbad, CA) enligt tillverkarens specifikationer. Cellfraktionerna upplöstes i RIPA-buffert, och proteinkoncentrationen mättes med användning av BCA-protein kvantifiering analys. Proteinextrakt (20 | ig) rades vidare löst i 1 × Laemmli-buffert, utsattes för elektrofores på en 10% SDS-PAGE och överfördes till nitrocellulosamembran såsom beskrivits ovan. Western blot-analys av poly-ADP-ribos-polymeras (PARP, från Cell Signa Technology Inc, Beverly, MA) och superoxiddismutas 2 (SOD2, från ABFrontier, Seoul, Korea) utfördes för att bekräfta lämplig separation av nukleära och cytosoliska proteiner.

Kvantitativ omvänd transkription-PCR (qPT-PCR) Review

Totalt RNA extraherades från cellinjer och frysta magsäcks vävnader genom den TRIzol-reagens (Invitrogen). Omvänd transkription av totalt RNA (2 Ag) gjordes med användning av en Advantage RT i PCR-kit (Clontech), och cDNA utsattes för PCR för 28 cykler av amplifiering med följande primrar: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC och CHD17 Rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-aktin användes som en kontroll.

Immunohistokemi (IHC) Review

Totalt 156 formalinfixerade och paraffininbäddade gastric cancervävnadsprover valdes ut för IHC studien. IHC färgning utfördes på 5-im vävnadssnitt rehydrerade genom graderade alkoholer. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 0,3% väteperoxid under 15 min. Objektglasen mikrovågsugn behandlades i 10 mM citratbuffert (pH 6,0) under 10 minuter. Icke-specifik bindning blockerades med 10% normalt kaninserum under 20 min. Vävnadsobjektglasen inkuberades med anti-CDH17 (1:50 spädning) i 60 min vid 37 ° C i en fuktig kammare. Objektglasen inkuberades med biotinylerad kanin-anti-mus-immunoglobulin vid en koncentration av 1:100 under 30 min vid 37 ° C omsattes därefter med en streptavidin-peroxidaskonjugat i 30 min vid 37 ° C och slutligen inkuberades med 3-3 'diaminobensidin som en kromogen substrat. För att utesluta en falsk positiv signal var negativa kontroller ingår i varje test genom att ersätta den primära antikroppen med blockerande serum. Två oberoende observatörer blinda för den clinicopathologic uppgifter gjorde bilderna. Definitionen av färgningen var följande: negativ, med 0% till mindre än 5% av tumörceller som visar immunoreaktivitet; svag, 5-40% av tumörceller som visar immunoreaktivitet; positiv, mer än 40% av tumörceller som visar immunoreaktivitet. De positiva fallen Vidareutbildning under klassificeras i CDH17 + (immunoreaktivitet: 40-60%), CDH17 2+ (immunoreaktivitet: 60-80%) och CDH17 3+ (immunoreaktivitet: 80-100%).

I vitro-analyser för att bedöma tumör fenotyp

de experimentella förfaranden för celltillväxt, härdar bildning, mjuk agar, cellmigration, sårläkning och cellcykelanalyser beskrivs i stöd Metoder S1.

Räddnings experiment

rädda CDH17 i shCDH17 AGS och MKN-45 cellinjer beskrivs i stöd Metoder S1.

in vivo musmodeller av magcancer

Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet godkändes av utskottet för etik djurförsök av Sun Yat-sen universitetet Cancer Center (Tillståndsnummer: 09-0238). All kirurgi utfördes under natriumpentobarbital anestesi, och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Efter anestesi, var Nakna möss avlivades genom halshuggning.

tumörbildning i nakna möss.

In vivo tumörbildning undersöktes av tumör xenograft experiment. Cirka 2 x 10 ^{6 AGS-celler infekterade med CDH17 shRNA, kontroll AGS celler infekterade med mock RNAi vektor och föräldra AGS celler injicerades s.c. in i den högra och vänstra bakben av 4 veckor gamla nakna möss (30 möss, 10 per tillstånd). Tumörbildning i nakna möss övervakades under en 8-veckors period. Tumörvolymen beräknades med formeln V = 0,5 X L × B 2. [13]}

tumörbärande musmodell.

subkutana tumörer inducerades i nakna möss med användning av AGS celler som ovan nämnts. En vecka efter inokulering, behandlades mössen med anti-CDH17 shRNA. Varje mus erhöll 100 mikroliter av intratumoral injectionscontaining 1 x 10 ^{9 kopior av CDH17 eller mock lentivirus, två gånger i veckan i 2 veckor. Fem möss användes i varje grupp. Tumörtillväxten övervakades dagligen.}

Statistik

Statistiska analyser utfördes med hjälp av SPSS 13,0. Skillnader bland variabler bedömdes av χ2 analys eller 2-tailed Students t test. Data presenteras som medelvärdet ± SD om inte annat anges. Total överlevnad (OS) och sjukdomsfri överlevnad (DFS) kurvor beräknades av Kaplan-Meier-metoden, och skillnaderna mellan de två grupperna jämfördes genom log-rank test. Ett p-värde av mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

CDH17 uttrycks starkt i gastriska karcinomceller och förbinds till dåligt kliniskt utfall

Först av allt, vi undersökte uttrycksnivån för CDH17 i 156 magcancer exemplar av IHC: 69 (44,3%) av 156 fall var positiva, medan de övriga 87 fall (55,7%) var negativa eller svaga för CDH17 uttryck (fig. 1). Uttrycksnivån var +, 2+ och 3+ i 21 (13,5%), 20 (12,8%) och 28 (17,9%) fall respektive. Dessa fynd tyder på att CDH17 kan spela en viktig roll i magcancer tumörbildning. Vi jämförde sedan de kliniska och patologiska funktioner i patienter med och utan CDH17 uttryck. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades mellan de två grupperna med avseende på kön, ålder, tumörstorlek, tumörstället, djup tumörinvasion, lymfkörtel metastas, fjärrmetastaser och TNM stadium (Tabell 1).

Nästa, vi undersökte den potentiella effekten av CDH17 uttrycksstatus på långsiktiga överlevnaden av patienter med univariat och multivariat analys. Median uppföljningstid var 24,3 månader i slutet av uppföljningen var 68 patienter fortfarande lever, 87 patienter hade dött av tumör, och 1 patient hade dött av andra orsaker; den cancerrelaterad 5-års överlevnad i hela serien var 37,8%. Univariata analyser visade ett samband mellan total överlevnad och tumörstället, histologiska differentiering, TNM stadium och CDH17 uttryck (tabell S1). I multivariata analyser, tumörstället (p = 0,02) histologisk differentiering (p = 0,02), TNM stadium (p < 0,001) och CDH17 uttryck (p < 0,01) var oberoende prognostiska faktorer för total överlevnad. Fikon. 2A visar generell skillnad i överlevnad mellan patienter med och utan CDH17 uttryck. Medianöverlevnaden var 15,9 månader hos patienter med CDH17 uttryck jämfört med 26,6 månader för dem som CDH17 negativ eller svagt uttryck (P < 0,01), vilket motsvarar en minskning av dödligheten med 16%. Dessutom var Disease-överlevnad (DFS) -analys utfördes i 131 patienter som genomgick R0 resektion. Vid slutet av uppföljningen, var 69 (52,7%) patienter fortfarande lever och 62 (47,3%) patienter hade dött av tumörrecidiv eller fjärrmetastaser, multivariata analyser visade liknande resultat, histologisk differentiering, tumörstället, djup av tumörinvasion (pt skede), lymfkörtelmetastaser (pN steget) var oberoende prognostiska faktorer för sjukdomsfri överlevnad (data visas ej). Vi fann också att patienter utan CDH17 uttryck har en bättre prognos än de som med CDH17 uttryck i tumörvävnad (Fig 2B.) (P < 0,01). Överlevnad minskades hos patienter med högt uttryck av CDH17 (IHC 2+, 3+) än hos patienter med CDH17 + uttryck (Fig. 2C). Medianöverlevnaden för patienter vars tumörer hade högre CDH17 uttryck var 10,9 månader för CDH17 3+, 21,1 månader för CDH17 2+ och 25,7 månader för dem som tilldelas vara CDH17 + uttryck (p < 0,01).

CDH17 uttryckt i humana mag cellinjer

Vi utvärderade om mänskliga gastric carcinoma cellinjer uttrycker CDH17 och därmed kan användas för att ytterligare utvärdera möjligheterna funktion detta protein. Vi valde en panel av 6 gastric carcinoma cellinjer med olika metastatisk potential: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 och SGC-7901. CDH17 mRNA-nivån mättes genom QRT-PCR-analys. Starkt uttryck sågs i primär och magsäckscancer cellinje (AGS och MKN-45) (Fig. S1A). Western blöts analys bekräftade hög CDH17 proteinuttryck i AGS (etablerad från en primär tumör) och MKN-45 (metastaserad) (Fig. S1B).

Sammantaget antyder dessa resultat att CDH17 är viktig för initiering och metastas av magcancer; åtminstone en delmängd av väl credentialed gastric carcinoma cellinjer bibehåller uttrycket av CDH17 möjliggör ytterligare funktionell karakterisering.

CDH17 knockdown inducerar antitumöreffekter in vitro

Nästa, vi slog ner CDH17 i magcancer cellinjer-AGS och MKN-45 med hjälp av CDH17 specifika shRNAs. Den knockdown gav > 75% minskning av både mRNA och proteinnivåer (Fig 3A.). Vi sedan bedömde tumorigena och metastatiska egenskaper (proliferation, kolonibildning, vidhäftning, invasion och cellcykel) av CDH17 brist gastric cancerceller (shCDH17 celler) jämfört med mock vektorinfekterade kontrollceller.

CDH17 shRNA medierad knockdown resulterade i en signifikant minskad tillväxt cell av magcancer-cellinjer (P < 0,001) (Fig 3A, höger.). Foci-bildning också signifikant hämmade (P < 0,001) i shCDH17 celler jämfört med Mock celler (Fig 3B, Vänster.), Ett liknande resultat erhölls i mjuk agar, där kolonibildningen signifikant minskade i shCDH17 celler (P < 0,001 Fig. 3B, höger). Rollen av CDH17 i metastas studerades genom sårläkning och Transwell-analyser. CDH17 knockdown kunde minska cellrörlighet (fig. 3C, vänster), som bestäms med den lindade analysen. Transwell-analys visade att minskad expression av CDH17 minskar signifikant celladhesion (P < 0,001) (Fig. 3C, höger). För att undersöka mekanismen bakom tillväxthämning av CDH17 knockdown, var cellcykeln fördelningar av celler med CDH17 shRNA hårnål och Mock bestäms genom flödescytometri: shCDH17 celler greps i G0 /G1 fas, med färre celler i G2 /M-fas (Fig . 3D). Antitumöreffekten av CDH17 knockdown sågs också i magsäckscancer cellinje MKN-45 (Fig. S2A-E). Enligt de accepterade standarder som skulle försäkra kvaliteten och riktigheten i RNAi experiment [14], utförde vi räddningsförsök åter uttrycka CDH17 i AGS och MKN-45 shCDH17 celler (Fig. S3A-B). Restaurering av CDH17 uttryck i AGS och MKN-45 celler tillbaka cellerna till föräldra fenotypen, vilket bekräftar att de antitumöreffekter av CDH17 knockdown var inte på grund av från målet effekter. Räddningsexperiment visade att efter återställande av CDH17 expression i dessa två cellinjer, ökad tumorigeniciteten och metastatisk potential att liknande nivåer av föräldra AGS och MKN-45-celler (fig. S3C-F). Dessa resultat ger starka belägg för de onkogena roller CDH17 i gastric cancerceller.

CDH17 som en in vivo mål för Gastric Cancer Therapy

Vi undersökte huruvida CDH17 krävs för tumörbildning och invasions i gastriska karcinomceller i en naken musmodell. Vi subkutant shCDH17, Mock och föräldra AGS-celler i nakna möss. Tumörer är vanligtvis synlig makroskopiskt i rygg flankerar inom en 6-8-veckors period av celler injektion. En mus från båda föräldra AGS och Mock grupper dog under den tredje veckan efter injektion (humana slutpunkter användes). Möss dödades 8 veckor efter tumörcellinjektion. I den grupp av möss som injicerats med shCDH17 celler, två möss visas ingen tumör knöl, och 8 möss visade signifikant minskad tumörbildning jämfört med möss injicerade med mock-celler. Tumörstorlek och vikt reducerades signifikant hos möss som injicerats med shCDH17 celler jämfört med möss injicerade med mock celler (Fig. 4A). Dessa resultat visar att en minskning av CDH17 uttryck kan avsevärt undertrycka tumörbildning in vivo.

För att ytterligare utvärdera effekten av CDH17 knockdown på primär tumörtillväxt, undersökte vi sedan om in vivo leverans av CDH17 shRNA kan hindra tillväxten av en etablerad tumör xenograft från föräldra AGS celler i nakna möss. En vecka efter tumörinokulering, när tumören hade nått ca 100 mm ^{3, utförde vi en intratumoral injektion av CDH17 shRNA eller mock vektor vid en dos av 10 9 viruspartikel /injektion vid tumörstället. Injektionen administrerades två gånger per vecka, i 2 veckor. I djuren som injicerats med Mock vektor, tumörerna växte progressivt under loppet av experimentet. Tvärtom intratumoral injektion av CDH17 shRNA resulterade i signifikant mindre tumörer vid varje tidpunkt, inklusive den slutliga volymmätning (fig. 4B). Undersökning av tumörceller genom CDH17 IHC visat anmärkningsvärd nedreglering avsedd CDH17 mål i shCDH17 behandlade celler (P < 0,05; Fig. 4B). Dessa resultat visar att in vivo nedreglering av CDH17 i gastric cancerceller minskar tumörbildning i möss, vilket innebär att CDH17 är ett terapeutiskt mål för magcancer.}

nedreglering av Wnt /β-catenin signalering av CDH17 knockdown

Vi förhördes flera vägar för att upptäcka den molekylära mekanismen för CDH17 knockdown-medierad hämning av gastrisk cancertillväxt, proliferation och metastas. Vi hittade flera medlemmar av Wnt /β-catenin väg att differentiellt uttryckt mellan shCDH17 och moderceller. β-catenin uttryck, GSK-3β fosforylering, och cyklin D1 uttryck minskat; och Rb expression ökade i båda AGS och MKN-45 shCDH17 celler. Dessutom uttryck av P53, MDM2 och nyckeln cellcykelregulator p21 ökade i CDH17-knockdown celler. (Fig. 5A). I en TOPFlash /FOPFlash reporter luciferas analys (Fig. 5B), återställande av CDH17 i både AGS och MNK-45 celler signifikant ökade styrkan i TCF /LEF signaler jämfört med shCDH17 kontroller. Dessutom, vilket visas genom immunoblotanalys, upptäckte vi en ökning av både den totala och kärn β-catenin protein efter restaurering av CDH17 i AGS och MKN-45, jämfört med shCDH17 (Fig. 5C) .Together, dessa resultat indikerar att CDH17 knockdown resulterar i nedreglering av Wnt /β-catenin vägen i gastric cancerceller. Detta, i sin tur, tyder på att CDH17 bibehåller den proliferativa potentialen genom Wnt /β-catenin pathway signalering.

Diskussion

CDH17 är en ny cadherin, dess struktur skiljer sig från de för de klassiska cadheriner av att den N-terminala domänen och den cytoplasmatiska delen uppvisar ingen signifikant homologi med klassiska cadheriner [6]. Den biologiska funktionen hos CDH17 är fortfarande okänd. Ett flertal studier har rapporterat förhöjda nivåer av CDH17 i olika humana cancerformer, som förbinder uttryck av detta protein till prognos och risk assesment [10], [15]. CDH17 uttryck har rapporterats i magcancer [9], hepatocellulär cancer [16] och kolorektal cancer [17]. Detta tyder på att CDH17 kan vara avgörande för tumörbildning av mag- och levercancer.

Hos människa CDH17 uttrycks normalt endast på den basolaterala ytan av hepatocyter och enterocyter. Efter den första rapporten från CDH17 som en tarm metapasia markör av Grotzinger et al [9], har flera undersökningar utvärderade CDH17 uttryck i magcancer. CDH17 uttrycktes i 50-78% av magcancer vävnader med intestinal-typ dominans [18], [19]. I den aktuella studien visar vi att CDH17 är en onkogen och en attraktiv terapeutiskt mål i magsäckscancer: CDH17 starkt uttryck i tumörvävnad, med nästan hälften av magcancer vara CDH17 positivt med IHC. Park och kollegor utvärderat CDH17 uttryck i mer än 200 gastric carcinoma vävnadsprover, och rapporterade att det mycket uttrycktes i tidigare skeden TNM [20], Dessutom fann de att en minskad expression av CDH17 har visat sig vara nära förknippad med tumör aggressivitet och lymfkörtelmetastaser av mänsklig gastric cancer [20]. Men andra rapporterade att dess uttryck var mycket högre i avancerad lymfkörtel metastas [18], [21]. I vår studie fanns inget samband mellan CDH17 uttryck och andra kliniskt patologiska funktioner.

Som en prognostisk faktor, CDH17 uttryck visade en tendens till en indikator för ogynnsam överlevnad i flera patientgrupper, även efter kontroll för tumörstadium. I detta sammanhang, medianöverlevnaden 15,9 månader i gruppen med positiv CDH17 uttryck, jämfört med 26,6 månader hos patienter med IHC negativa tumörer representerar en kliniskt signifikant samband. Vidare visade en förberedande analys dålig överlevnad hos patienter med högt uttryck av CDH17 protein (IHC 2+ och 3+) jämfört med patienter med låg expression av CDH17 protein (IHC +). Dessa resultat är anmärkningsvärt med tanke på den dåliga prognosen i denna population. Kollektivt är CDH17 uttryck en användbar prognostisk markör i gastrisk carcinom och förefaller vara relaterad till tumörprogression.

Föreliggande studie visar att shRNA-medierad CDH17 knockdown i de högt tumorigena gastric carcinoma cellinjer AGS och MKN-45 kunde effektivt undertrycka celltillväxt, minska foci bildning och kolonibildning i mjuk agar, samt invasivitet och metastaserande förmåga för magcancer in vitro. G1-S fasövergång är en viktig kontrollpunkt för cellcykelprogression och p21 är en av de kritiska negativa regulatorer under denna övergång [22]. Huvudcellcykel effekten av CDH17 knockdown är hämning av G1-S-fasen övergång genom aktiveringen av p21 bekräftades i blots studier (Fig. 5). En ny studie i HCC-celler fann att utarmning av CDH17 resulterade i inhibering av invasion, tillväxt och metastaser hos MHCC97H hepatocellulära karcinomceller [16]. CDH17 är en positiv regulator för flyttande, lim och invasiva beteende. Det är tänkbart att, i överensstämmelse med N-cadherin. I magcancer, kan CDH17 förmedla carcinoma interaktion cell med gastric stroma och delta i främjandet av magsäckscancer metastas genom att underlätta cancer cell migration och återupprätta homofil cell-cell-adhesion i metastaser. Våra studier ger nya insikter i dess potentiella roll i magcancer initiering och progression. Enligt våra resultat är CDH17 en onkogen och en attraktiv terapeutiskt mål i magcancer.

Följaktligen postulerar vi att rikta CDH17 kan användas för att behandla magcancer in vivo. Musmodeller av magcancer användes för att validera effekten av målsökande CDH17 som en potentiell behandling. Infektion i mag cancerceller från CDH17 shRNA avskaffade deras cancerframkallande hos möss. I tumörbärande möss, hämmade lokal tillförsel av Lentiviral baserad CDH17 shRNA tumörtillväxt, som visar en slående undertryckande effekt på tumörbildning. Dessa fynd har viktiga kliniska implikationer för behandling av magsäckscancer. För närvarande finns det endast ett FDA-godkända riktad terapi för behandling av en underuppsättning av magcancer: Trastuzumab, en monoklonal antikropp som interfererar med HER2-receptorn. Tyvärr, HER2-uttryckande tumörer är sällsynta, kunde endast 22% gastric cancerpatient dra nytta av denna behandling [23]. Däremot var CDH17 starkt uttryckt i magcancer i nästan 50% av patienterna (tabell 1) .För närvarande, standardterapi för magcancer inkluderar kirurgi med optimal debulking av sjukdom följt av cytostatikabehandling. Trots dessa ansträngningar, 80% av patienter som diagnostiserats med magcancer utvecklar återkommande sjukdom och endast 20% av dessa patienter överlever 5 år efter diagnos [24]. Våra resultat tyder starkt på att gastric cancerpatienter kan ha nytta av målinriktad terapi mot CDH17, och garanterar prospektering och design av potentiella CDH17 hämmare.

De molekylära mekanismer genom vilka CDH17 reglerar magcancer tillväxten återstår att belysas. En färsk rapport visade en trans-interaktion mellan E-cadherin och CDH17 i enterocyter under utvecklingen av tarmepitelet [25], [26], vilket tyder på att CDH17 kan skär med Wnt väg genom sitt samarbete med E-cadherin och /eller tillhörande partners. Tidigare studier visade att rikta CDH17 inaktiverar Wnt /β-catenin signalering i hepatocellulär cancer [16]. Aktivering av Wnt /β-catenin signalerings hittas i ca 30% av magcancer, och transgena djurmodeller har också visat att Wnt-signalering främjar magsäcks karcinogenes [27].

• PLOS ONE: Caveolin-1 Uttrycksnivå i cancer associerade fibroblaster förutsäger utfall i Gastric Cancer
• PLOS ONE: fas II studie som utvärderade 2 doseringsscheman Oral Foretinib (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, hos patienter med magsäckscancer