PLOS ONE: Segmentação CDH17 Suprime progressão tumoral no câncer gástrico por downregulating Wnt /β-catenina Signaling

Abstract

Purpose

O câncer gástrico continua sendo uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo. Os pacientes geralmente apresentam atrasado com invasão local ou metástase, para o qual não há terapias eficazes disponíveis. Na sequência de estudos anteriores que identificaram a molécula de adesão da caderina-17 (CDH17) como um marcador potencial de carcinoma gástrico, realizamos estudos de prova de princípio para desenvolver abordagens terapêuticas racionais segmentação CDH17 para o tratamento desta doença.

Métodos

a imuno-histoquímica foi utilizado para estudar a expressão de CDH17 em 156 carcinomas gástricos, e a relação entre a sobrevivência e expressão CDH17 foi estudada por análise multivariada. O efeito do knockdown de ARN mediada por interferência de CDH17 sobre a proliferação de linhas celulares de carcinoma gástrico foi examinada in vitro e in vivo, bem como os efeitos sobre a sinalização a jusante por immunoblotting.

Resultados

CDH17 foi consistentemente sobre-regulada em cancros gástricos humanos e sobrevida global em pacientes com CDH17 upregulation era mais pobre do que naqueles sem expressão desse gene (taxa de 5 anos de sobrevida global de 29,0% vs 45,0%, P < 0,01). ensaios funcionais demonstraram que CDH17 knockdown inibiu a proliferação celular, adesão, migração, invasão, clonogenicidade e induzir a apreensão G0 /G1. Em camundongos, shRNA mediada knockdown CDH17 inibe marcadamente o crescimento do tumor; injecção intratumoral de CDH17 shRNAs resulta em efeitos anti-tumor significativos em modelos tumorais transplantados. Os mecanismos antitumorais subjacentes inibição CDH17 envolvem inativação de sinalização de Wnt /β-catenina.

Conclusão

Nossos resultados identificam CDH17 como biomarcador de carcinoma gástrico e atraente alvo terapêutico para esta malignidade agressiva.

Citation: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Segmentação CDH17 Suprime progressão tumoral no câncer gástrico por downregulating Wnt /β-catenina Sinalização. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10.1371 /journal.pone.0056959

editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Outubro, 2012; Aceito: 16 de janeiro de 2013; Publicação: 15 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural (30672408 para RHX). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a quarta causa mais comum de morte por câncer no mundo. Embora a incidência de câncer gástrico diminuiu drasticamente em alguns países desenvolvidos na última década, um total de um milhão de novos casos são estimados para ser diagnosticados a cada ano [1]. Os pacientes com esta doença geralmente têm uma visão pobre, respondendo por 10% do total de mortes de câncer [2]. Mesmo depois da cirurgia radical, mais de metade dos pacientes com reincidência. Linfonodal, profundidade de invasão do tumor e localização do tumor foram identificados como os factores de prognóstico clínico-patológicas mais significativas [3], [4].

invasão local e metástases à distância comumente ocorrem em carcinoma gástrico avançado. O processo de invasão e metástase é complexo e requer a desregulação de uma variedade de elementos celulares, incluindo moléculas de adesão críticos. Caderina pertence a uma das famílias de moléculas de adesão e desempenha um papel crucial no estabelecimento de interacção célula-célula [5]. Caderina-17 (CDH17), que também é chamado de fígado intestino (LI) caderina humana ou péptido transportador-1 (HPT-1), é um membro estruturalmente único da caderina superfamília [6], [7]. Considerando que os chamados caderinas clássicas, tais como E-, N- e P-caderina, tem cinco repetições de caderina dentro do domínio extracelular, CDH17 consiste em sete repetições de caderina. Além disso, CDH17 tem apenas 20 aminoácidos no domínio citoplasmático, ao passo que as caderinas clássicas têm um domínio citoplasmático altamente conservado consistindo em 150-160 aminoácidos. CDH17 é expressa em ratos e seres humanos quase exclusivamente em células epiteliais de ambos intestino delgado e cólon embrionário e adulto, sem expressão detectável no estômago e no fígado [8].

Utilizando abordagens genómicas e proteomic integrativos, os investigadores têm começado a identificar novos oncogenes e supressores de tumor no câncer gástrico. Estudos anteriores de coortes clínicos identificados CDH17 como um potencial marcador de doença do carcinoma gástrico [9], [10]. Apesar destes resultados clínicos significativos, as funções moleculares de CDH17 permanecer desconhecida, e o seu papel tumorigénico em carcinoma gástrico ainda não foi confirmada. Aqui, o nosso objectivo para dissecar os mecanismos de sinalização oncogênicas do CDH17 no contexto carcinoma gástrico e avaliou os efeitos da segmentação CDH17 como uma potencial abordagem terapêutica para o cancro gástrico.

Métodos

Os pacientes

A população de estudo consistiu em 156 pacientes consecutivos (106 homens e 50 mulheres), agendada para cirurgia de 1 de Janeiro de 2002 e 31 de Dezembro de 2006 Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, China. Todos os pacientes incluídos no estudo tinham um diagnóstico histológico de diagnóstico de carcinoma gástrico primário que foi ainda analisada patologicamente após a cirurgia. A cirurgia consistiu de subtotal ou gastrectomia total em todos os pacientes; uma técnica padronizada foi utilizada para a ressecção cirúrgica e linfadenectomia, conforme já descrito [3]. Os pacientes que se submeteram à cirurgia não-ressectivo, e aqueles com tipo Siewert I Cardia adenocarcinoma foram excluídos do estudo. tamanhos de amostra, e tumorais foram registrados pelos patologistas. áreas representativas do tumor foram selecionados e congelados instantaneamente. classificação pTNM seguiu os critérios da 6ª edição do UICC [11] .A idade média dos pacientes era de 57,2 anos (intervalo: 27-78 anos) a idade, sexo, tipo de cirurgia, localização do tumor, estágio TNM, quimioterapia, espécime comprimento, tamanho do tumor, e diferenciação histológico, foram registados para cada paciente numa base de dados. Todos os pacientes que foram submetidos a qualquer tipo de quimioterapia estavam no 5-FU, platina ou regimes baseados em taxol. Todos os pacientes, após a alta do hospital, entrou em um programa de acompanhamento de acordo com protocolo padrão [12]. O follow-up foi fechado em abril de 2010. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em Sun Yat-sen University Cancer Center, todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo.

linhas celulares e CDH17 anticorpo

linhas de células de carcinoma gástrico, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 e SGC-7901 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA), japoneses Cancer Research Resources bank (Tóquio, Japão) e Beijing University Medical (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). Um anticorpo monoclonal de rato para CDH17 (ab54511) foi da Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 RNA curto hairpin (shRNA)

O puro pLKO.1 (7 kb) construto lentiviral contém uma promotor U6 e HIV-1 do sinal de encapsidação de ARN com elementos de resistência pruomycin- e ampicillin- clonada a 3 'do promotor de fosfoglicerato quinase humana (hPGK). Um cpptCTE foi inserido 5 'do promotor hPGK. construções CDH17 shRNA humanos foram gerados por ligação das seguintes oligômeros recozidos em locais únicos Agel e EcoRI de puro pLKO.1: CDH17 shRNA para a frente (5'-CCG CCG ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G-3 ') e reverso (5'AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G-3'). preparações lentivirais foram produzidos por co-transfecção pLKO.1 Puro vector vazio com CDH17 shRNA, e vírus auxiliar plasmídeos de empacotamento e pCMVΔR8.9 pMG.G (numa proporção 10:10:01) em células 293T. A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina e reagente PLUS (Invitrogen). Os lentivírus foram colhidas às 24, 36, 48 e 60 h após a transfecção. Dois controles foram criados, em que as células cancerosas gástricas quer não recebeu nenhum tratamento, ou foram transfectadas com mexidos não-alvo vector RNAi (Mock). A infecção foi levada a cabo na presença de 8 ug /ml de polibreno. Após a infecção, AGS e células MKN-45 foram selecionadas para a expressão estável dos shRNAs utilizando 2 ng /mL de puromicina. As células foram lisadas por análise de Western blot de 10 dias pós-infecção.

imunotransferência e fraccionamento subcelular

lisados ​​proteicos foram preparados a partir de monocamadas de linhas celulares utilizando tampão de lise (1% de NP-40,50 mM Tris -HCl, pH 8,0, fluoreto de sódio 100 mM, pirofosfato de sódio 30 mM, molibdato de sódio 2 mM, EDTA 5 mM, ortovanadato de sódio 2 mM) contendo inibidores de protease (10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo ). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, EUA). Os lisados ​​celulares foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfacte de sódio (SDS-PAGE), e as proteínas separadas foram transferidas electroforeticamente para membranas Immobilon-P (Millipore). Após o bloqueio por leite não gordo, as membranas foram incubadas de forma independente em P53 anticorpos primários (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), ciclina D1 (Santa Cruz SC-753 ), Rb (Cell Signaling΢9), β-catenina (Zymed, 13-8400), GSK3β (Santa Cruz, sz-7291) e p-GSK3β (Ser9) (Cell SignalingΥ6). A membrana foi lavada várias vezes em PBS com 0,1% de Tween 20 e digitalizada em duas cores do sistema de detecção de infravermelhos Imager LI-COR Odyssey (LI-COR Bioscience) de acordo com as instruções do fabricante.

fraccionamentos subcelulares foram realizadas usando tampões de lise celular específicos e passos de centrifugação repetidas (kit extrato nuclear do Active Motive, Carlsbad, CA) de acordo com as especificações do fabricante. fracções de células foram dissolvidas em tampão RIPA, e a concentração de proteína foi medida utilizando o ensaio de quantificação de proteína BCA. Os extractos de proteína (20 ug) foram posteriormente dissolvido em 1 × tampão de Laemmli, submetidas a electroforese em 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose como descrito acima. A análise de Western blot de polimerase poli-ADP-ribose (PARP, a partir de Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) e superóxido dismutase 2 (SOD2, de ABFrontier, Seul, Coreia do Sul) foram realizadas para confirmar a separação adequada de proteínas nucleares e citosólicos.

quantitativa de transcrição reversa-PCR (PCR-QPT)

o ARN total foi extraído a partir de linhas celulares e tecidos de adenocarcinomas gástricos congelados com o reagente TRIzol (Invitrogen). A transcrição reversa de ARN total (2 Ag) foi feito usando uma vantagem para RT PCR kit (Clontech), e o cDNA foi sujeito a PCR durante 28 ciclos de amplificação com os seguintes iniciadores: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC e CHD17 Rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-actina foi usado como um controle.

imuno-histoquímica (IHQ)

Um total de 156 e amostras de tecido de câncer gástrico embebidos em parafina foram selecionados para o estudo IHC fixado em formol. coloração IHC foi realizada em secções de tecido de 5 ^ m re-hidratadas através de álcoois graduados. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 15 min. As lâminas foram tratadas de microondas em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) durante 10 min. A ligação não específica foi bloqueada com soro de coelho normal a 10% durante 20 min. As lâminas de tecido foram incubadas com anti-CDH17 (diluição 1:50) durante 60 min a 37 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram incubadas com imunoglobulina de coelho biotinilado anti-ratinho a uma concentração de 1:100 durante 30 min a 37 ° C e depois reagiu com um conjugado de estreptavidina-peroxidase durante 30 min a 37 ° C e finalmente incubadas com diaminobenzidina 3-3 'como um substrato de cromogénio. Para excluir um sinal falso positivo, foram incluídos controlos negativos em cada teste substituindo o anticorpo primário com soro de bloqueio. Dois observadores independentes, cegos à informação clínico-patológica marcou os slides. A definição de coloração foi como se segue: negativo, com 0% a menos do que 5% de células de tumor que mostram a imunorreactividade; fraco, 5-40% de células de tumor que mostram a imunorreactividade; positivo, mais do que 40% de células de tumor que mostram a imunorreactividade. Os casos positivos foram futher sub-classificados em CDH17 + (imunorreatividade: 40-60%), CDH17 2+ (imunorreatividade: 60-80%) e CDH17 3+ (imunorreatividade: 80-100%).

Em os ensaios in vitro para avaliar o fenótipo tumoral

os procedimentos experimentais para o crescimento celular, a formação de focos, ágar macio, a migração celular, a cicatrização de feridas e ensaios do ciclo celular são descritos no apoio a métodos S1.

experiências salvamento

o resgate de CDH17 em shCDH17 AGS e linhas celulares MKN-45 são descritos no apoio a métodos S1.

In vivo modelos do rato do cancro gástrico

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Sun Yat-sen University Cancer Center (número de autorização: 09-0238). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Após a anestesia, os ratinhos nus foram sacrificados por deslocamento cervical.

a formação de tumores em ratinhos nus.

tumorigénese in vivo foi investigada por experiências de xenoenxerto de tumor. Cerca de 2 × 10 ^{6 células AGS infectadas com CDH17 shRNA, controle de células AGS infectadas com o vector RNAi simulada e células AGS parentais foram injectados s.c. na patas traseiras esquerdas de ratos pelados 4 semanas de idade (30 ratos, 10 por condição) e direito. a formação de tumores em ratinhos nus foi monitorizada ao longo de um período de 8 semanas. O volume do tumor foi calculado pela fórmula V = 0,5 × L × W 2. [13]}

Tumor-rolamento modelo de rato.

tumores subcutâneos foram induzidos em ratos pelados utilizando células AGS como acima mencionados. Uma semana após a inoculação, os ratinhos foram tratados com anti-CDH17 shRNA. Cada rato recebeu 100 mL de injectionscontaining intratumoral 1 × 10 ^{9 cópias de CDH17 ou lentivírus simulada, duas vezes por semana, durante 2 semanas. Cinco ratinhos foram usados ​​em cada grupo. O crescimento do tumor foram monitorados diariamente.}

Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 13.0. As diferenças entre as variáveis ​​foram avaliadas por χ2 análise ou testes t 2 caudas de Student. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão, a menos que indicado de outra forma. A sobrevida global (OS) e as curvas de sobrevida livre de doença (DFS) foram calculados pelo método de Kaplan-Meier, e as diferenças entre os dois grupos foram comparadas pelo teste de log-rank. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

CDH17 é altamente expressa em células de carcinoma gástrico e está relacionada com prognóstico clínico

Em primeiro lugar, examinamos o nível de expressão de CDH17 em 156 espécimes de carcinoma gástrico por IHC: 69 (44,3%) de 156 casos foram positivos, enquanto que os restantes 87 casos (55,7%) foram negativos ou fracos para a expressão CDH17 (Fig. 1). O nível de expressão estava +, 2+ e 3+ em 21 (13,5%), 20 (12,8%) e 28 (17,9%) casos, respectivamente. Estes resultados indicam que CDH17 pode desempenhar um importante papel na tumorigénese do cancro gástrico. Em seguida, compararam as características clínicas e patológicas dos pacientes com e sem expressão CDH17. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos no que diz respeito ao sexo, idade, tamanho do tumor, local do tumor, profundidade de invasão tumoral, metástase linfonodal, metástases à distância e estágio TNM (Tabela 1)
.

Em seguida, nós investigamos o impacto potencial do estado expressão CDH17 sobre a sobrevivência a longo prazo dos pacientes por meio de análise uni e multivariada. Acompanhamento médio foi de 24,3 meses, no final do seguimento, 68 pacientes ainda estavam vivos, 87 pacientes morreram de tumor, e 1 paciente tinha morrido de outra causa; a taxa de sobrevida em 5 anos relacionada com o cancro em toda a série foi de 37,8%. Análises univariada mostrou uma associação entre a sobrevida global e local do tumor, diferenciação histológica, estágio TNM e expressão CDH17 (Tabela S1). Na análise multivariada, local do tumor (p = 0,02) diferenciação histológica (p = 0,02), estágio TNM (p < 0,001) e expressão CDH17 (p < 0,01) foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida global. FIG. 2A mostra a diferença na sobrevida global entre pacientes com e sem expressão CDH17. sobrevida global mediana foi de 15,9 meses em pacientes com expressão CDH17 comparação com 26,6 meses nos doentes expressão CDH17 negativo ou fraca (P < 0,01), correspondendo a uma redução de 16% na mortalidade. Além disso, a sobrevida livre de doença de análise (DFS) foi realizado em 131 pacientes que foram submetidos a ressecção R0. No final do seguimento, 69 (52,7%) pacientes ainda estavam vivos e 62 (47,3%) pacientes morreram de recorrência do tumor ou metástases à distância, as análises multivariadas mostraram os resultados semelhantes, diferenciação histológica, local do tumor, profundidade de invasão tumoral (fase pT), linfonodo metástases (fase pN) foram fatores prognósticos independentes para sobrevida livre de doença (dados não mostrados). Nós também descobrimos que os pacientes sem expressão CDH17 têm um prognóstico melhor do que aqueles que com expressão CDH17 no tecido tumoral (Fig 2B.) (P < 0,01). A sobrevida global foi reduzida em pacientes com alta expressão de CDH17 (IHC 2+, 3+) do que em pacientes com CDH17 + expressão (Fig. 2C). A sobrevida global mediana dos pacientes cujos tumores tinham maior expressão CDH17 foi de 10,9 meses para CDH17 3+, 21,1 meses para CDH17 2+, e de 25,7 meses nos doentes que designado para ser CDH17 + expressão (p < 0,01).

CDH17 expressos em linhas de células humanas gástricas

Nós avaliamos se linhas celulares de carcinoma gástrico humano expressar CDH17 e, assim, poderia ser utilizado para avaliar ainda mais a função potencial desta proteína. Nós seleccionado um painel de 6 linhas celulares de carcinoma gástrico com diferente potencial metastático: AGS, MKN-45, GSC-27, MGC-803 BGC-823 e SGC-7901. CDH17 nível de ARNm foi medido por análise de qRT-PCR. expressão forte foi observada em linha celular de carcinoma gástrico primário e metastático (AGS e MKN-45) (Fig. S1A). análise de manchas de Western confirmou a alta expressão de proteína CDH17 em AGS (estabelecidas a partir de um tumor primário) e MKN-45 (metastático) (Fig. S1B).

Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o CDH17 é importante para a iniciação e metástase do câncer gástrico; pelo menos, um subconjunto de linhas de células de carcinoma gástrico bem-credenciados mantém expressão de CDH17 permitindo a caracterização funcional adicional.

CDH17 knockdown induz efeitos anti-tumorais in vitro

Em seguida, derrubado CDH17 em linhas celulares de carcinoma AGS-gástrica e MKN-45 utilizando shRNAs específicos de CDH17. O knockdown produziu > 75% de redução em ambos os níveis de proteína e ARNm (Fig. 3A). Em seguida, avaliaram as propriedades tumorigénicas e metastáticos (proliferação, formação de colônia, adesão, invasão e do ciclo celular) das células CDH17 deficientes câncer gástrico (células shCDH17) em comparação com as células de controlo do vector infectado simulados.

CDH17 shRNA knockdown mediada resultou em taxas de crescimento reduzida de células de linhas de células de carcinoma gástrico (P < 0,001) (Figura 3A, com o botão direito.). formação de focos foi também inibiu significativamente (P < 0,001) em células shCDH17 em comparação com células falsamente (Fig 3B, Esquerda.), um resultado semelhante foi obtido em agar mole, em que a formação de colónias foi significativamente reduzida em células shCDH17 (P < 0,001 A Fig. 3B, direita). O papel de CDH17 na metástase foi estudada por ensaios de cicatrização de feridas e Transwell. CDH17 knockdown foi capaz de diminuir a mobilidade celular (Fig. 3C, à esquerda), como determinado pelo ensaio de ferida. ensaio Transwell revelou que a expressão reduzida de CDH17 diminui significativamente a adesão celular (P < 0,001) (Fig. 3C, à direita). Para explorar o mecanismo subjacente a inibição do crescimento por CDH17 knockdown, as distribuições do ciclo celular de células com CDH17 shRNA hairpin e Mock foram determinados por citometria de fluxo: As células shCDH17 foram presos na fase G0 /G1, com menor número de células em G2 /M de fase (Fig . 3D). O efeito antitumoral de CDH17 knockdown também foi observado na linha celular de carcinoma gástrico metastático MKN-45 (Fig. S2A-E). De acordo com os padrões aceitos que assegurem a qualidade ea precisão de experimentos RNAi [14], foram realizados experimentos de resgate re-expressando CDH17 em AGS e MKN-45 shCDH17 células (Fig. S3A-B). Restauração da expressão CDH17 em AGS e MKN-45 células devolvido as células com o fenótipo dos pais, o que confirma que os efeitos anti-tumorais de CDH17 knockdown não eram devidas a efeitos alvo fora. As experiências de salvamento revelou que após a restauração da expressão CDH17 nestas duas linhas de células, a tumorigenicidade e o potencial metastático aumentou para níveis semelhantes de AGS parentais e MKN-45 células (Fig. S3C-F). Estes resultados fornecem fortes evidências dos papéis oncogênicos de CDH17 em células de carcinoma gástrico.

CDH17 como um Alvo In Vivo para gástrico Cancer Therapy

Nós examinou se CDH17 é necessário para a formação do tumor e invasão em células de carcinoma gástrico em um modelo de ratos sem pêlo. Nós injectados por via subcutânea shCDH17, Mock e células AGS parentais em ratinhos nus. Os tumores são normalmente visíveis macroscopicamente em dorsal flanqueia dentro de um período de 6 a 8 semanas de injecção de células. 1 mouse de ambos os AGS parentais e grupos Mock morreram durante a terceira semana depois (foram usados ​​endpoints humanas) de injeção. Os ratinhos foram sacrificados 8 semanas após a injecção das células tumorais. No grupo de ratinhos injectados com células shCDH17, dois ratinhos não apresentaram nenhuma nódulo tumoral, e 8 murganhos mostraram a formação significativa de tumor reduzida em comparação com ratinhos injectados com células falsamente. tamanho e peso dos tumores foram significativamente reduzidos em ratinhos injectados com células shCDH17 em comparação com ratinhos injectados com células falsamente (Fig. 4a). Estes resultados mostram que a redução da expressão CDH17 pode suprimir significativamente a tumorigenicidade in vivo.

Para avaliar ainda o efeito de CDH17 knockdown no crescimento do tumor primário, que, em seguida, investigou se a entrega in vivo de CDH17 shRNA poderia impedir o crescimento de um xenoenxerto de tumor estabelecida a partir de células parentais AGS em ratinhos nus. Uma semana após a inoculação do tumor, quando o tumor tinha atingido aproximadamente 100 milímetros ^{3, foi realizada uma injecção intratumoral de CDH17 shRNA ou vector simulado, a uma dose de 10 9 partícula viral /injecção no local do tumor. A injecção foi administrada duas vezes por semana, durante 2 semanas. Em animais injectados com o vector Mock, os tumores cresceram progressivamente durante o decurso da experiência. Pelo contrário, a injecção intratumoral de CDH17 shRNA resultou em tumores significativamente menores em cada ponto de tempo, incluindo a medição do volume final (Fig. 4B). O exame das células tumorais por CDH17 IHC demonstraram notável regulação negativa de CDH17 alvo destina-se nas células tratadas shCDH17 (p < 0,05; Fig. 4B). Estes resultados demonstram que, na regulação negativa in vivo da CDH17 em células de carcinoma gástrico reduz a formação de tumores em ratinhos, o que implica que CDH17 é um alvo terapêutico para o cancro gástrico.}

A regulação negativa da sinalização de Wnt /β-catenina por CDH17 knockdown

Nós interrogado várias vias a fim de descobrir o mecanismo molecular da inibição CDH17 knockdown mediado de crescimento do câncer gástrico, proliferação e metástase. Encontrámos vários membros da via /β-catenina Wnt a ser expresso diferencialmente entre shCDH17 e células parentais. β-catenina expressão, fosforilação por GSK-3β, e expressão da ciclina D1 diminuiu; e expressão Rb aumentou em ambos os AGS e células MKN-45 shCDH17. Além disso, a expressão de p53, de MDM2 e p21 regulador chave do ciclo celular em células aumentou CDH17-knockdown. (Fig. 5A). Num ensaio de repórter de luciferase TOPFlash /FOPFlash (Fig. 5B), a restauração de CDH17 em ambos os AGS e células MNK-45 aumentou significativamente a força dos sinais de TCF /LEF em comparação com os controlos shCDH17. Além disso, como mostrado por meio de análise de imunotransf erência, foi detectada um aumento tanto da proteína total e nuclear β-catenina após a restauração de CDH17 em AGS e MKN-45, quando comparado com o shCDH17 (Fig. 5C), estes resultados .Together indicam que o CDH17 knockdown resultados na regulação negativa da via /β-catenina Wnt em células de cancro gástrico. Este, por sua vez, sugere que CDH17 mantém o potencial proliferativo através de sinalização de Wnt via /β-catenina.

Discussão

CDH17 é um romance caderina, a sua estrutura ser diferentes daquelas das caderinas clássicas em que o domínio N-terminal e a porção citoplasmática exibe nenhuma homologia significativa com as caderinas clássicas [6]. A função biológica da CDH17 ainda é desconhecida. Numerosos estudos têm relatado níveis elevados de CDH17 em vários cancros humanos, ligando expressão desta proteína para prognóstico e risco assesment [10], [15]. CDH17 sobreexpressão foi reportado no adenocarcinoma gástrico [9], o carcinoma hepatocelular [16] e carcinoma colorrectal [17]. Isso indica que CDH17 pode ser crucial na tumorigênese do câncer gástrico e do fígado.

Nos seres humanos, CDH17 é normalmente expressa exclusivamente na superfície basolateral dos hepatócitos e enterócitos. Após o primeiro relato de CDH17 como um marcador metapasia intestinal por Grotzinger et [9] al, várias investigações têm avaliado expressão CDH17 no câncer gástrico. CDH17 foi expresso em 50-78% dos tecidos de cancro gástrico com predominância do tipo intestinal [18], [19]. No presente estudo, demonstramos que CDH17 é um oncogene e um atraente alvo terapêutico no câncer gástrico: CDH17 é altamente expressa em tecidos tumorais, com quase metade dos cancros gástricos sendo CDH17 positiva por IHC. Park e colegas avaliada a expressão CDH17 em mais de 200 amostras de tecidos do carcinoma gástrico, e relataram que era altamente expresso em fases TNM anteriores [20], Além disso, eles descobriram que a expressão reduzida de CDH17 tem sido mostrado para ser estreitamente associado com a agressividade do tumor e metástases em linfonodos do carcinoma gástrico humano [20]. No entanto, outros relataram que a sua expressão era muito maior em avançado metástases em linfonodos [18], [21]. Em nosso estudo, não houve relação entre a expressão CDH17 e outras características clínico-patológicas.

Como um fator prognóstico, expressão CDH17 mostrou uma tendência para um indicador para a sobrevivência desfavorável em vários grupos de pacientes, mesmo após o controle para o estágio do tumor. Neste contexto, a sobrevida global mediana de 15,9 meses no grupo com expressão CDH17 positiva, versus 26,6 meses em pacientes com tumores IHC negativos representa uma relação clinicamente significativa. Além disso, uma análise exploratória mostraram sobrevivência global pobre em pacientes com elevada expressão de proteína de CDH17 (IHC 2+ e 3+) em comparação com pacientes com baixa expressão da proteína de CDH17 (IHC +). Estes resultados são dignas de nota na vista do prognóstico pobre nesta população. Colectivamente, expressão CDH17 é um marcador de prognóstico útil em carcinoma gástrico e parece estar relacionada com a progressão do tumor.

O presente estudo demonstra que shRNA mediada CDH17 knockdown no altamente tumorigénicas gástricas linhas AGS celulares de carcinoma e MKN-45 pode suprimir eficazmente o crescimento celular, diminuir a formação de focos e a formação de colónias em agar mole, bem como a invasividade e a capacidade metastática do cancro gástrico, in vitro. G1-S de transição de fase é um importante ponto de controlo para a progressão do ciclo celular e a p21 é um dos reguladores negativos críticos durante esta transição [22]. O efeito do ciclo celular principal de CDH17 knockdown é a inibição da transição de fase G1-S por meio da activação de p21 foi confirmada em estudos borrões (Fig. 5). Um estudo recente em células de carcinoma hepatocelular verificou que a depleção de CDH17 resultou na inibição da invasão, crescimento e metástases de células de carcinoma hepatocelular MHCC97H [16]. CDH17 é um regulador positivo para migratória, adesiva, e comportamentos invasivos. É concebível que, consistente com N-caderina. No cancro gástrico, CDH17 pode mediar a interacção de células de carcinoma gástrico e com estroma estar envolvidos na promoção da metástase do cancro gástrico, facilitando a migração de células de carcinoma e re-estabelecer a adesão célula-célula homofica na metástase. Nossos estudos fornecem novos insights sobre seu potencial papel na iniciação do câncer gástrico e progressão. De acordo com nossos resultados, CDH17 é um oncogene e um atraente alvo terapêutico no cancro gástrico.

Assim, postulamos que a segmentação CDH17 pode ser usado para tratar câncer gástrico in vivo. modelos de ratinho de cancro gástrico foram utilizados para validar o efeito de direccionamento CDH17 como um tratamento potencial. A infecção das células de carcinoma gástrico por CDH17 shRNA aboliu a sua carcinogenicidade em ratinhos. Nos ratinhos portadores de tumor, a entrega local de lentivírus com base CDH17 shRNA inibiu o crescimento tumoral, que mostra um efeito supressor marcante na formação de tumores. Estes resultados têm implicações clínicas importantes para o tratamento do câncer gástrico. Actualmente, há apenas uma terapia direcionada aprovado pela FDA para o tratamento de um subconjunto de cancro gástrico: trastuzumab, um anticorpo monoclonal que interfere com o receptor HER2. Infelizmente, os tumores que expressam HER2 são raras, apenas 22% doente com cancro gástrico poderia se beneficiar desta terapia [23]. Em contraste, CDH17 foi altamente expressa no cancro gástrico em quase 50% dos pacientes (Tabela 1) .Atualmente, terapia padrão para o cancro gástrico inclui cirurgia com diminuição de volume óptimo da doença, seguido por terapia citotóxica. Apesar destes esforços, 80% dos pacientes diagnosticados com câncer gástrico desenvolver doença recorrente e apenas 20% desses pacientes sobrevivem 5 anos após o diagnóstico [24]. Nossos resultados sugerem fortemente que pacientes com câncer gástrico podem se beneficiar da terapia direcionada contra CDH17, e garante a exploração e concepção de inibidores potenciais CDH17.

Os mecanismos moleculares pelos quais CDH17 regula o crescimento do câncer gástrico continuam a ser elucidado. Um relatório recente mostrou que um trans-interacção entre a E-caderina e CDH17 em enterócitos durante o desenvolvimento do epitélio intestinal [25], [26], sugerindo que CDH17 pode intersectar com a via Wnt através da sua articulação com a E-caderina e /ou associada parceiros. Estudos anteriores encontraram que a segmentação CDH17 inactiva a sinalização de Wnt /β-catenina em carcinoma hepatocelular [16]. A activação da sinalização /β-catenina Wnt é encontrada em cerca de 30% do cancro gástrico, e modelos animais transgénicos também têm demonstrado que a sinalização de Wnt promove carcinogénese gástrica [27]. Nisto, CDH17 knockdown diminuiu β-catenina e a fosforilação por GSK-3β, acompanhada por um aumento concomitante de Rb e redução de ciclina D1 em cancro gástrico.

• PLOS ONE: Caveolina-1 Nível de expressão no câncer associado fibroblastos prediz a evolução no câncer gástrico
• PLOS ONE: Fase II estudo avaliando 2 esquemas de dosagem de Foretinib Oral (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, em Pacientes com metastático Câncer Gástrico